白藜芦醇调控Hedgehog信号通路抑制肝星状细胞活化的研究

【目的】观察白藜芦醇对HSC-T6细胞内Hedgehog信号通路及其下游靶基因表达的影响,探讨白藜芦醇抗肝纤维化的作用机制,为白藜芦醇的临床应用提供理论依据。【方法】体外培养大鼠肝星状细胞系HSC-T6,用含体积分数10%胎牛血清的DMEM高糖培养基培养种板,细胞贴壁后加入白藜芦醇(4、8、16μmol/L)或环耙明(100μmol/L)预处理30 min,再加入瘦素(100 ng/mL)孵育24 h诱导细胞活化。采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测细胞增殖水平,蛋白免疫印迹(Western Blot)法检测细胞α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达,实时聚合酶链反应(PCR)检测细胞内Hedgehog信号通路成员Shh、Smo、Patched和Gli1 mRNA及Gli1下游靶基因Cyclin D1、Cyclin D2及Bcl-2的表达。【结果】与空白组比较,模型组细胞增殖率及α-SMA蛋白表达均呈显著增高趋势,Hedgehog信号通路成员Shh、Smo、Patched、Gli1 mRNA及Gli1下游靶基因Cyclin D1、Cyclin D2及Bcl-2的表达亦显著上升(P 0.05或P 0.01)。与模型组比较,白藜芦醇低、中、高剂量组及环耙明组均可显著抑制HSC-T6细胞增殖率及α-SMA蛋白表达(P 0.01),亦可明显抑制Hedgehog信号通路成员Shh、Smo、Patched、Gli1及靶基因Cyclin D1、Cyclin D2及Bcl-2 m RNA的表达(P 0.05或P 0.01)。【结论】白藜芦醇可通过调控Hedgehog信号通路抑制HSCT6细胞的增殖与活化,达到抗肝纤维化的作用。     

Nedd4调节Hedgehog信号通路的研究

Hedgehog信号通路在胚胎发育及胎儿组织自稳中发挥重要作用。异常的Hedgehog激活可导致许多癌症的发生。为了研究Hedgehog信号通路中新的调节因子,我们利用Smoothened (Smo)的C末端作为诱饵采用酵母双杂交筛查方法,鉴定出Nedd4蛋白与Smo具有相互作用。研究显示在转染的HEK293细胞中Nedd4与Smo结合,另外,Nedd4的过表达会增加Gli 荧光酶素报告基因的活性,反之,Nedd4的失表达可以使Gli依赖的Hedgehog信号通路激活消失。总之,我们的研究显示Nedd4正性调节Hedgehog信号通路,而且为癌症的治疗中抑制Hedgehog信号通路提供了一个潜在的作用靶点。     

Sonic Hedgehog信号通路分子Shh和Smo在肝细胞肝癌中表达与意义

目的:探讨Sonic Hedgehog(SHH)信号通路分子Shh和Smo在肝细胞肝癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)中的表达及其意义?方法:用RT-PCR方法检测10例HCC组织及相应癌旁组织和肝癌细胞系HepG2?Huh7中Shh?Smo mRNA的表达?采用免疫组化方法检测30例肝癌组织及10例正常肝组织中Shh?Smo蛋白的表达?结果:RT-PCR结果显示HCC组织中Shh?Smo mRNA的表达率显著高于癌旁组织(P < 0.05);Shh?Smo mRNA在Huh7中的表达强度高于HepG2,但两者间无显著性差异(P > 0.05)?免疫组化结果显示Shh?Smo蛋白在HCC组织中阳性率分别为63.3%(19/30)?76.7%(23/30);Smo蛋白的表达与肿瘤大小相关(P < 0.05)?Shh?Smo蛋白在正常肝组织中均无表达?结论:Shh和Smo在肝癌中高表达,表明SHH信号通路可能参与肝癌的发生,为肝癌防治提供新的依据?     

Shh、Gli1和MMP-9在胃癌组织中的表达及临床意义

目的 探讨胃癌组织中Hedgehog(Hh)信号通路分子(Shh和Gli1)与基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)的表达以及临床意义.方法 采用免疫组织化学方法检测54例人胃癌组织、癌旁组织和30例正常胃黏膜组织中Shh、Gli1和MMP-9蛋白的表达.结果 胃癌组织中Shh、Gli1和MMP-9的阳性表达率分别为68.52％、61.11％和64.81％,明显高于癌旁组织(阳性表达率分别为27.78％、24.07％和22.22％)和正常组织(阳性表达率分别为36.67％、26.67％和33.33％)(P＜0.05);三者的表达均与胃癌患者性别、年龄、部位无关(P＞0.05);而与分化程度、浸润深度以及淋巴结转移相关(P ＜0.05);Shh、Gli1分别与MMP-9表达呈正相关.结论 Hedgehog( Hh)信号通路可能通过上调MMP-9的表达促进胃癌的侵袭转移.联合检测胃癌组织中Shh、Gli1和MMP-9蛋白水平,可作为胃癌预后的客观参考指标.     

核转录因子Gli1在肾透明细胞癌中的表达及意义

目的 观察肾透明细胞癌(Renal clear cell carcinoma,RCCC)及正常肾组织中Gli1 的表达,探讨RCCC中Gli1的异常表达与肾癌之间的关系.方法 采用免疫组化技术检测 RCCC 及正常肾组织中Gli1 蛋白的表达.结果 在正常肾组织中Gli1不表达,而在RCCC中Gli1高表达,且其表达与患者的年龄、性别及肿瘤大小均无关.结论 Hedgehog信号通路中Gli1表达上调可能参与了RCCC的发病,其在肾细胞癌的发生、发展等方面可能具有重要作用.     

erbB4/HER4在食道鳞状细胞癌的表达研究

目的探讨第四人体表皮生长因子受体（HER4）表达与食道鳞状细胞癌临床病理的关系。方法采用免疫组化的方法检测60例食道鳞状细胞癌组织中HER4的表达。结果食道鳞状细胞癌组织中HER4的过度表达率为68.33%。食道鳞状细胞癌中HER4的过度表达与淋巴结转移及TNM分期有关。结论 erbB4基因是食道鳞状细胞癌生长的一个调控基因,干预HER4蛋白的过度表达可能是治疗食道鳞状细胞癌的有效方法。     

Sonic hedgehog信号通路Smo蛋白及其下游转录因子Glil蛋白在胃癌组织中的表达及其意义

目的 探讨Sonic hedgehog信号通路Smo蛋白及其下游转录因子Gli1蛋白在胃癌组织中的表达及其意义.方法 收集85例胃癌组织及25例正常胃粘膜组织构建成组织芯片,应用免疫组化S-P法检测胃癌组织中Smo蛋白及G1il蛋白的表达,并以正常胃粘膜组织作对照,分析两者的相关性.结果 Smo和Gli1蛋白均在正常胃粘膜中不表达或弱表达;在胃乳头状腺癌、管状腺癌、低分化腺癌中,两者的表达强度和阳性表达率显著高于正常胃粘膜(P＜0.05,并随着胃腺癌分化程度下降而上升;相关分析显示Smo和Gli1蛋白在胃癌组织中的表达呈正相关,相关系数为0.989,P＜0.001.结论 胃癌发生过程中的Sonic hedgehog信号通路异常激活可能通过Smo蛋白高表达上调下游转录因子Gli1蛋白的表达参与部分胃腺癌的发生.     

Sonic Hedgehog信号通路在大鼠牙髓炎中的作用

目的:观察Sonic Hedgehog(Shh)信号分子在大鼠牙髓炎中的免疫定位,探讨Shh信号通路在牙髓防御和修复中所起的作用。方法:将15只SD大鼠随机分成1d、3d和7d组,每组5只,用穿髓开放法建立大鼠牙髓炎模型,3组大鼠分别于术后1,3,7d处死,取出下颌磨牙,常规组织学处理,免疫组化方法检测Shh,Smo,Ptc,Gli1的表达,并对Shh信号通路在大鼠牙髓炎中的表达进行半定量分析,对照组为大鼠正常牙髓。结果:大鼠牙髓炎模型1,3,7dShh广泛表达于穿髓孔下方牙髓间充质细胞及远离穿髓孔的根髓细胞中,表达量随炎症的进展无显著性提高(P>0.05)。Ptc、Smo、Gli1在大鼠牙髓损伤后1d未见阳性表达,3d和7d均表达于穿髓孔下方牙髓间充质细胞中,且表达量均有显著性提高(P<0.05)。空白对照组中Shh信号通路阴性表达。结论:Shh信号通路在牙髓炎过程中表达,提示其可能被激活,参与牙髓炎症反应。     

三氧化二砷对急性早幼粒细胞白血病细胞株Hedgehog信号通路的影响

［摘要］目的: 探讨三氧化二砷（As2O3）对急性早幼粒细胞白血病细胞Hedgehog信号转导通路相关分子的作用,为将其扩大应用于其他具有Hedgehog异常活化的肿瘤提供理论基础。方法： 将不同浓度的As2O3作用于急性早幼粒细胞白血病NB4细胞株48 h,采用实时定量PCR（qRT PCR）和免疫印迹技术检测Hedgehog信号转导通路关键分子Smoothened（Smo）、Ptch、Gli1和Gli2在mRNA和蛋白水平的变化。结果： As2O3处理后,NB4细胞的Smo、Ptch、Gli2在蛋白和mRNA水平均受到明显抑制,差异有统计学意义。结论： As2O3可能是通过抑制Gli2蛋白和mRNA发挥抗Hedgehog信号转导通路的作用,而Hedgehog信号转导通路可能是As2O3发挥抗急性早幼粒细胞白血病的机制之一。     

Smo和Gli1在胃癌中的表达及其临床意义

目的:探讨Smo和Gli1在胃癌及癌旁组织中的表达与胃癌的临床病理因素之间的关系;并探讨两者之间在胃癌中的关系.方法:应用免疫组织化学EliVision法测定75例胃癌组织和45例对应的癌旁组织中Smo和Gli1的表达情况.应用RT-PCR技术检测30例新鲜胃癌组织及癌旁组(距切缘5 cm)组织中Smo mRNA和Gli1 mRNA的表达情况.结果:免疫组织化学染色结果显示,胃癌组Smo和Gli1表达阳性率均显著高于癌旁组(P<0.01);RT-PCR显示,胃癌组Smo和Gli1表达水平均较癌旁组显著升高(P<0.01).2种方法均提示Smo、Gli1在胃癌组织中的表达阳性率在病人年龄、性别、肿瘤分化程度及肿瘤大小间差异均无统计学意义(P>0.05),而在TNM分期、浸润深度、及淋巴结转移间差异均有统计学意义(P<0.01).结论:Smo与Gli1蛋白表达与胃癌淋巴结转移、临床分期、浸润深度等因素相关,提示两者可能与胃癌的恶性生物学行为有关.Smo与Gli1在胃癌中的表达呈正相关关系,两者可能协同促进肿瘤的发生与发展.     

Smo蛋白及Gli1蛋白在结直肠癌组织中的表达及其意义

目的探讨Sonic hedgehog信号通路中Smo和Gli1蛋白在结直肠癌组织中的表达及其意义。方法应用免疫组化S—P法检测125例结直肠癌组织及30例正常结直肠黏膜组织中Sonic hedgehog信号通路中Smo和Gli1蛋白的表达情况。结果Smo和Gli1蛋白在结直肠癌组织的表达明显高于其正常结直肠黏膜（P〈0．001）,与肿瘤部位、分化程度、Dukes分期以及有无淋巴结转移无关（P〉0．05）,而与肿瘤组织学类型有关（P〈0．001）,相关分析显示Smo及GIi1蛋白在结直肠癌组织中的表达呈正相关,相关系数为0．690（P〈0．001）。结论结直肠癌的发生与Smo和Gli1蛋白的高表达有关,可能与Smo蛋白高表达上调其下游转录因子Gli1蛋白的表达有关。     

Sonic hedgehog信号通路Smo蛋白及其下游转录因子Glil蛋白在胃癌组织中的表达及其意义

目的探讨Sonic hedgehog信号通路Smo蛋白及其下游转录因子Gli1蛋白在胃癌组织中的表达及其意义。方法收集85例胃癌组织及25例正常胃粘膜组织构建成组织芯片，应用免疫组化S—P法检测胃癌组织中Smo蛋白及Gli1蛋白的表达，并以正常胃粘膜组织作对照，分析两者的相关性。结果Smo和Gli1蛋白均在正常胃粘膜中不表达或弱表达；在胃乳头状腺癌、管状腺癌、低分化腺癌中，两者的表达强度和阳性表达率显著高于正常胃粘膜（P〈0．05，并随着胃腺癌分化程度下降而上升；相关分析显示Smo和Gli1蛋白在胃癌组织中的表达呈正相关，相关系数为0．989，P〈0．001。结论胃癌发生过程中的Sonic hedgehog信号通路异常激活可能通过Smo蛋白高表达上调下游转录因子Gli1蛋白的表达参与部分胃腺癌的发生。     

皮肤鳞状细胞癌组织和细胞系中Ptch-1及Gli-1表达的检测

目的:探讨Hedgehog信号传导通路中Pteh-1和Gli-1在鳞状细胞癌皮损和细胞系中的表达及意义.方法:采用免疫组化技术分别检测鳞状细胞癌皮损和细胞系A431,HSQ-89,HSC-2和Tca中Pteh-1和Gb-1的蛋白水平表达与分布.结果:Pteh-1及Gli-1在正常皮肤,鳞状细胞癌皮损,细胞系A431,HSQ-89以及HSC-2细胞中均有阳性表达,主要分布在鳞状细胞癌细胞胞膜及胞质中.结论:鳞状细胞癌皮损和细胞系中Pteh-1及Gli-1的阳性表达可能通过激活Hedgehog信号传导通路有助于鳞状细胞癌的形成和发展.     

Hedgehog信号通路与Snail在肝癌细胞系中的表达及意义

目的 探讨Hedgehog(Hh)信号通路在各种肝癌细胞系中的表达及其与Snail蛋白的关系.方法 用RT-PCR检测了Hh信号通路分子Shh、Ihh、Ptch-1、Smo、Gli-1、Gli-2、Gli-3 mRNA在4种肝癌细胞系HepG2、Hep3B、SMMC-7721、Huh-7和永生化肝细胞系L02中的表达情况,应用Western blot检测了Snail蛋白在SMMC-7721和L02细胞中的表达差异.结果 RT-PCR结果显示Hedgehog信号通路分子mRNA在肝癌细胞株中呈高表达,并以Shh信号为主;Gli-2在SMMC-7721细胞中表达最显著,而在正常肝细胞株L02中表达最弱,两者差异显著(P<0.01).Snail蛋白在SMMC-7721细胞中的表达显著高于L02细胞(P<0.05),且与Gli-2的表达呈正相关(P<0.05).结论 Hh信号通路可能通过Gli-2上调Snail的表达,增强肝癌细胞增殖力和侵袭力,促进肝细胞癌的发生和发展.     

Hedgehog信号通路与肿瘤的关系

Hedgehog信号通路是调节动物胚胎正常发育的经典信号通路之一,主要由信号分子HH、膜受体Ptch、Smo以及转录因子Gli等组成.近年来,有关Hedgehog信号通路的研究取得了较大进展,对其在肿瘤发生、发展中的作用有了新的认识,并为肿瘤治疗提供了新的靶点.本文就Hedgehog信号通路的异常激活与肿瘤的关系作一综述.     

白藜芦醇诱导大鼠骨髓基质细胞的神经元样细胞分化伴Shh信号激活

目的 研究Sonic Hedgehog(Shh)信号在白藜芦醇诱导大鼠骨髓基质细胞(marrow stromal cells,MSCs)分化为神经元样细胞中的作用.方法 采用全骨髓贴壁法分离培养MSCs.MSCs分为3组,白藜芦醇诱导组:用含白藜芦醇的无血清DMEM/F12诱导MSCs分化;对照组:用无血清DMEM/F12诱导MSCs分化;正常组:不做诱导处理.倒置显微镜下观察细胞形态,免疫荧光法、免疫印迹法检测NSE、MAP-2、GFAP、Smo和Gli1蛋白的表达和移位.结果 白藜芦醇诱导后细胞胞体收缩,伸出长突起,类似神经元.免疫荧光显示正常组及对照组MSCs轻度表达神经元NSE蛋白,白藜芦醇诱导组MSCs NSE、MAP-2阳性,但诱导前后细胞始终未表达胶质细胞GFAP蛋白.免疫荧光显示,MSCs具有初级纤毛,并表达Smo和Gli1.白藜芦醇诱导组Smo从细胞质进入初级纤毛,Glil从细胞质进入细胞核,同时,Smo、Glil蛋白的表达增加(P＜0.01).对照组则无明显变化.结论 白藜芦醇能诱导MSCs分化为神经元样细胞;此过程中Shh信号通路被激活,推测Shh信号在MSCs分化过程中可能发挥着重要作用.     

Hh信号通路抑制剂Cyclopamine对Hela细胞增殖、侵袭迁移的影响

目的:研究Hh信号通路抑制剂Cyclopamine作用Hela细胞后Gli1、FoxM1、上皮间质转化(EMT)过程相关标记物表达的改变及对其增殖、侵袭迁移能力的影响,探究Gli1、FoxM1、EMT过程的可能作用关系,以期为宫颈癌的分子靶向治疗提供多个靶点。方法:采用实时定量RT-PCR、Western Blot技术检测Hela、Siha细胞系Hh信号通路中Shh、Ptch1、Smo的表达情况,选择Hh信号通路表达较高的Hela细胞系作为后续实验细胞,利用四甲基偶氮唑蓝比色法(MTT法)检测不同浓度Cyclopamine作用Hela细胞后其增殖能力的改变;采用Transwell小室试验检测Hela细胞侵袭、迁移能力的改变,并采用实时定量RT-PCR、Western Blot技术检测Gli1、FoxM1、EMT过程标记物的表达情况。结果:(1)Hela细胞中Hh信号通路成分(Shh、Ptch1、Smo)在mRNA水平显著高于Siha细胞(P<0.01),且相应蛋白的表达强度也高于Siha细胞;(2)Cyclopamine对Hela细胞增殖的抑制作用具有时间、剂量依赖性;(3)Cyclopamine作用Hela细胞48h后,细胞侵袭试验显示,实验组侵袭细胞数较对照组明显降低(P<0.01)。细胞迁移试验显示,实验组细胞迁移细胞数较对照组明显降低(P<0.01);(4)Cyclopamine作用Hela细胞48h后,实验组Gli1、FoxM1、Vimentin在mRNA水平的表达显著低于对照组(P<0.05),且相应蛋白的表达强度也低于对照组;E-cadherin在实验组中mRNA层面的表达显著高于对照组(P<0.05),且相应蛋白的表达强度也高于对照组。结论:抑制Hh信号通路可显著降低Hela细胞系增殖、侵袭迁移能力,FoxM1很可能是Hh信号通路末端转录因子Gli1的下游靶基因,且其对宫颈癌细胞系增殖、侵袭迁移的作用很可能是通过EMT实现的。     

雌激素受体α在乳腺癌细胞中对Gli1转录活性和表达的影响

目的:在先前研究发现Hedgehog信号通路的下游转录因子Gli1能够抑制乳腺癌细胞中的雌激素信号通路活性的基础上,观察雌激素受体ERα在乳腺癌细胞MCF-7中对转录因子Gli1的转录活性和表达的影响,以探讨两条信号通路之间是否存在着交互作用。方法:应用荧光素酶报告基因转录活性分析的方法,将Gli1的表达质粒和Gli的报告基因质粒pGli-BS-luc以及ERα的表达质粒或者空载体共同瞬时转染到乳腺癌细胞MCF-7中,观察Gli1转录活性的变化。然后分别用实时定量PCR和蛋白质印迹的方法检测乳腺癌细胞中ERα的过表达对Gli1 mRNA和蛋白表达的影响。结果:荧光素酶的活性随着ERα过表达剂量的增加而增加,ERα的质粒量在500 ng/孔时可将荧光素酶的活性升高到对照细胞的3.5倍(P<0.001)。雌激素处理后,荧光素酶的活性无显著变化。过表达ERα后可将Gli1 mRNA的表达水平提高为原来的2倍(P<0.01),也可明显增加Gli1蛋白的表达水平。结论:ERα在MCF-7细胞中的过表达能够明显增强Gli1的转录活性,增加Gli1的表达。这表明乳腺癌细胞中,转录因子ERα和Gli1之间存在着交互作用。     

SHH信号通路对子痫前期患者滋养细胞凋亡和侵袭的影响及其机制

目的：探讨激活SHH信号通路对子痫前期（PE）患者滋养细胞凋亡和侵袭的影响,并阐明其作用机制。方法：将HTR8/SVneo细胞分为正常对照组、缺氧/复氧（H/R）处理组和purmorphamine+H/R处理组。Western blotting法检测PE胎盘组织和正常妊娠晚期胎盘组织及各组HTR8/SVneo细胞中SHH信号通路相关蛋白SHH、Ptch1、Smo、Gli1和Gli3蛋白表达水平,流式细胞术（FCM）检测各组HTR8/SVneo细胞的凋亡率,Transwell小室法检测各组HTR8/SVneo细胞的穿膜细胞数,Western blotting法检测各组HTR8/SVneo细胞中基质金属蛋白酶2（MMP-2）和基质金属蛋白酶9（MMP-9）蛋白表达水平。结果：PE胎盘组织HTR8/SVneo细胞中SHH、Ptch1、Smo、Gli1和Gli3蛋白表达水平均明显低于正常妊娠晚期胎盘组织（P<0.05）;H/R处理组HTR8/SVneo细胞中SHH、Ptch1、Smo、Gli1、Gli3、MMP-2和MMP-9蛋白表达水平及穿膜细胞数均明显低于正常对照组,细胞凋亡率明显高于正常对照组（P<0.05）;purmorphamine+H/R处理组HTR8/SVneo细胞中SHH、Ptch1、Smo、Gli1、Gli3、MMP-2和MMP-9蛋白表达水平及穿膜细胞数均明显高于H/R处理组（P<0.05）,细胞凋亡率明显低于H/R处理组（P<0.05）。结论：激活SHH信号通路可减少PE患者胎盘组织中HTR8/SVneo细胞凋亡,并通过上调MMP-2和MMP-9表达提高细胞的侵袭能力。