人血管能抑素基因N端片段的表达、纯化及其生物活性测定

以中国人胎盘脐带组织为材料 ,提取组织总RNA ,用RT PCR方法合成人血管能抑素cDNA ,将该cD NA克隆进 pSP72载体获得重组质粒 pSP72C。以pSP72C为模板 ,PCR方法合成编码血管能抑素N端 189aa的基因片段 ,将其克隆进pET 3c载体获得重组表达质粒 pET CN ,转化E .coliBL2 1(DE3) ,SDS PAGE分析显示 ,在IPTG诱导下 ,人血管能抑素N端基因片段获得了有效表达 ,表达量约占菌体总蛋白质的 35 .3% ,主要以包涵体形式存在。包涵体经过洗涤、裂解、蛋白质复性以及SephadexG 10 0凝胶过滤层析等步骤纯化后 ,获得了纯度约92 .6 %的人血管能抑素N端片段 ,CAM实验证明具有显著抑制鸡胚新生血管生成活性。     

人血管内皮抑素基因的克隆及其在原核中的表达

以人胎肝组织为材料,提取总ＲＮＡ,经反转录和ＰＣＲ扩增,得到血管内皮抑素基因,序列分析表明,与国外文献报道一致。将其克隆到大肠杆菌表达系统ｐＧＥＸ－ＫＧ,分别在ＤＨ５α、ＢＬ－２１菌中以ＧＳＴ－Ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ融合蛋白的形式高效表达。     

人神经生长因子基因在大肠杆菌中的克隆、表达及产物纯化

从人胎盘组织中提取总DNA, 经PCR扩增编码人β神经生长因子（β-NGF）成熟肽的基因,并克隆到大肠杆菌表达载体pET15b中。重组质粒pET15b-NGF经测序与报道的完全一致。重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS,经IPTG诱导表达得到16kD的目的蛋白带,与预期的大小一致,NGF表达量约占全菌总蛋白的25%.经过亲和层析柱（Ni2+-charged IDA his-bind column）纯化后得到了单一的NGF蛋白条带,蛋白纯度可达90%以上,从每升表达菌液中可以得到4.56mgNGF。表达产物的Western 印迹鉴定结果显示：重组人神经生长因子能与兔抗人β-NGF的多克隆抗体发生特异性结合反应,在16kD处出现单一的条带,表明诱导表达的重组NGF具有免疫学活性。鸡胚背根神经节感觉神经元鉴定试验表明,本实验表达的重组NGF具有良好的生物学活性。     

人TIMP—3cDNA的克隆,表达及其抗血管生成作用

从人新鲜的胎盘组织中提取总ＲＮＡ,以ＲＴ－ＰＣＲ法获取了人组织金属蛋白酶抑制－３成熟蛋白的ｃＤＮＡ。序列分析表明,ＴＩＭＰ－３成熟蛋白含有１８８个氨基酸残基,其中１２个半胱氨酸残基在ＴＩＭＰ家族中高度保守。将人ＴＩＭＰ－３ｃＤＮＡ插入含７启动子的质粒ｐＥＴ－２４构建表达质粒ｐＥＴ－ＴＩＭＰ３,转化大肠杆菌ＢＬ２１,筛选表达菌株ＢＬＴＩＭＰ３。     

人白细胞介素-17基因的克隆、表达及其表达产物的分离纯化

利用ＲＴ－ＰＣＲ方法成功地从ＰＩ（ＰＭＡ,Ｉｏｎｏｍｙｃｉｎ）、ＰＨＡ活化的人Ｔ细胞中扩增出ｈＩＬ－１７编码区ｃＤＮＡ（４６８ｂｐ）,克隆测序证实得到该基因．用特殊设计的引物扩增ｈＩＬ－１７成熟肽编码区（４１４ｂｐ）,接入表达载体ｐＥＴ３０ａ质粒中．ｐＥＴ３０ａ－ｍｈＩＬ－１７在大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）中获得高效表达,目的蛋白占总菌体蛋白５０％左右．经凝胶过滤和阴离子交换层析两步分离纯化和复性,得到单体型ｒｍｈＩＬ－１７,纯度达９８％以上,Ｎ端１６个氨基酸序列分析,结果与文献报道一致．ＳＤＳ－ＰＡＧＥ法测定分子量为１６ｋＤ,薄层丙烯酰胺凝胶等电聚焦分析该蛋白等电点为ｐＨ８．８～８．９,３ＨＴｄＲ参入法测定ｒｍｈＩＬ－１７单体的体外活性,实验结果表明ｒｍｈＩＬ－１７对ＰＨＡ活化人的ＰＢＭＣ细胞具有抑制作用,结果同可溶型ＩＬ－１７Ｒ性质相似     

人内皮抑素基因的克隆以及在大肠杆菌中的可溶性表达研究

用PCR的方法从人胎肝cDNA文库中得到人内皮抑素基因 ,克隆测序正确后连接到硫氧还蛋白融合表达载体上 ,转化大肠杆菌BL2 1 (DE3)得到表达人内皮抑素的工程菌。用IPTG诱导表达 ,表达量达到全菌蛋白的 64%。经分析硫氧还蛋白可以辅助内皮抑素可溶性表达 ,表达的融合蛋白保持了天然蛋白的免疫学特性。而且表面带有多聚组氨酸的突变的硫氧还蛋白还简化了蛋白纯化的步骤 ,使融合蛋白可以通过固相金属螯和层析 (IMAC)的方法纯化。纯化后的融合蛋白经IgA蛋白酶的切割可得到大小正确的重组人内皮抑素 ,用此方法获得的重组人内皮抑素可以在CAM试验中抑制新生血管的形成。高效可溶型表达内皮抑素的工程菌的构建成功 ,为内皮抑素的生产应用打下了良好的基础。     

人血管抑素 Kringles 1-3 的表达纯化及生物学活性研究

人血管抑素包含了4个环饼状结构域(Kringle),是一个有效的血管生成抑制因子。采用PCR方法从人胚肝cDNA文库中扩增了人血管抑素Kringles 1-3的基因,重组于pPIC9K载体中,获得重组载体pPIC9K-K1-3,然后转化毕赤酵母细胞GS115,获得重组菌株。K1-3蛋白在5 L发酵罐的表达量达41.2 mg/L,发酵液上清经过浓缩、透析,然后用Lysine Sepharose 4B层析柱纯化,得到的K1-3蛋白纯度大于98%,纯化回收率达到95%以上。K1-3能明显抑制bFGF刺激的人微血管内皮细胞的迁移,达到抑制效果为50%时所需的蛋白浓度(IC₅₀)为1.86 μg/ml。K1-3也能抑制鸡胚绒毛尿囊膜血管的生长,抑制率达95%。为应用人血管抑素Kringles 1-3治疗肿瘤奠定了初步实验基础。     

肌肉特异性激酶基因的克隆、表达和纯化

目的:克隆小鼠肌肉特异性激酶(muscle-specific kinase,MuSK)基因,原核表达、纯化MuSK蛋白。方法:获取编号AY360453的小鼠肌肉特异性激酶的基因编码序列进行优化和合成,将得到的目的基因构建于大肠杆菌表达载体pQE30中,获得重组表达载体pQE30-MuSK,转化至大肠杆菌菌株M15中表达,SDS-PAGE凝胶电泳检测是否有目的蛋白条带,MuSK酶联免疫分析试剂盒检测目的蛋白的免疫活性及其含量。结果:获得MuSK基因1.4kb片段,成功构建pQE30-MuSK原核表达载体,MuSK蛋白在大肠杆菌中成功表达,相对分子质量约为48kDa,Elisa试剂盒测得样品中MuSK的含量约为8.2pmol/L。结论:利用分子克隆技术建立了MuSK基因的原核表达系统,为更深入的研究其在重症肌无力中的作用打下基础。     

人生长激素基因的cDNA克隆,原核高效表达及纯化

用ＲＴ－ＰＣＲ方法,从含有全长人生长激素（ＨＧＨ）基因的ＣＨＯ细胞中获得ｈｇｈ的ｃＤＮＡ,将其克隆入ｐＥＴ－１１ｂ载体中,在大肠杆菌中获得高效表达,表达量占菌体蛋白总量的２０％。经色谱纯化后,纯度大于９５％。     

人血管抑素在丝氏酵母中的表达及其活性测定

利用RT－PCR方法从人肝细胞癌HepG2细胞株中扩增得到编码人血管抑素（angiostatin)的cDNA。将其插入毕氏酵母表达载体pPIC9K中,转化结氏酵母,获得了整合多拷贝血管抑素基因的菌株。了酵液经赖氨酸亲和柱纯化所得到的重组蛋白的产量为25mg/L。蛋白质氨基酸序列分析结果与国外报道一致。重组蛋白特异地抑制bFGF刺激的牛主动脉内皮细胞的增殖,ED50约为3mg/L。     

小鼠canstatin C端片段基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

为了构建小鼠canstatinC端片段的原核表达载体并在大肠杆菌中表达。以小鼠肝脏组织总RNA为模板,通过RT-PCR扩增小鼠canstatinC端片段(mCan-C)基因,克隆到pMD18-T载体中并进行序列分析。将mCan-C基因定向克隆于原核表达载体pET30a(+)中,构建表达载体pET／mCan-C,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。结果表明,小鼠canstatinC端片段的cDNA长度为399bp,含有1个终止密码,编码132个氨基酸,与已知的人canstatinC端片段氨基酸的同源性为61％。IPTG诱导mCan-C在大肠杆菌E．coliBL21中表达,表达量约占菌体总蛋白量的28％,重组蛋白主要以包涵体形式存在。首次克隆了小鼠canstatinC端片段的cDNA,IPTG诱导mCan-C在大肠杆菌E．coliBL21中高效表达。小鼠canstatinC端片段的cDNA序列已收入GenBank,接受号为:AY502947。     

人IL-18的基因克隆、表达及纯化

目的 :克隆人IL 1 8基因 ,并构建高表达人IL 1 8的工程菌 ,纯化获得重组人IL 1 8。方法 :从人肿瘤组织内提取总RNA ,利用逆转录聚合酶链反应扩增人IL 1 8基因 ,在基因的 5′和 3′端分别加上NcoI和EcoRI酶切位点 ,酶切后直接克隆至质粒表达载体pET2 8a( + )内 ,转化大肠杆菌BL2 1 (DE3) ,挑选转化子 ,IPTG诱导后SDS PAGE筛选高表达人IL 1 8的工程菌。提取表达菌质粒进行DNA序列分析。表达菌大量培养及IPTG诱导后 ,超声破菌收集包涵体 ,十二烷基肌苷酸钠溶解后用阳离子柱和分子筛纯化。结果 :克隆的人IL 1 8基因序列完全正确 ,工程菌表达的人IL 1 8约占菌体蛋白 30 % ,以包涵体形式存在 ,经阳离子柱和分子筛纯化获得了较纯的人IL 1 8。结论 :可用构建的工程菌大量制备人IL 1 8,为开展人IL 1 8药物的临床前研究奠定了基础。     

人角质化细胞生长因子-2基因的克隆、表达及产物的纯化、鉴定

用高表达菌株BL21codon plus compentent cells表达重组人角质化细胞生长因子(Hkgf-2)蛋白并初步纯化和检测其活性。通过RTPCR从流产胎儿肺组织中钓取hKGF-2cDNA,将其克隆入pBV220载体质粒。在大肠杆菌BL-21codon plus compent cells中表达hKGF-2蛋白。采用亲和层析和离子交换层析分离纯化,以细胞增殖实验测定表达蛋白的生物活性。结果显示,hKGF-2蛋白在BL21中得到高效表达;hKGF-2蛋白能刺激NIH3T3细胞的增殖,具有显著的促有丝分裂活性。     

人源蛋白酪氨酸磷酸酶SHP-2基因克隆与原核表达

目的:构建蛋白酪氨酸磷酸酶SHP-2的原核表达载体并在大肠杆菌中表达。方法:以人脑组织mRNA为模板,通过RT-PCR扩增出目标cDNA,构建蛋白酪氨酸磷酸酶SHP-2-pEASY-E1重组质粒。将重组质粒转化进E.coli TOP10感受态细胞中,通过菌落PCR和测序进行阳性克隆的筛选和验证,将正确的质粒转化E.coli Transetta感受态细胞中,通过SDS-PAGE和western-blot进行蛋白检测和验证,酶促动力学分析SHP-2可溶性蛋白的活性。结果:成功克隆SHP-2功能域,构建SHP-2-pEASY-E1原核表达载体,完成可溶性蛋白的表达;酶促动力学分析结果为:米氏常数Km=0.97mmol/L,Vmax为13.57mmol/L/s。结论:本研究成功构建SHP-2的原核表达载体,重组表达的SHP-2蛋白具有较高的磷酸酶活性。     

人纤溶酶原K1-3基因的克隆、表达和产物的纯化及抗癌活性分析

纤溶酶原K1－3功能区是近年发现的血管生成抑制因子,具有抑制肿瘤生长和转移的活性。以人血管生成抑制素cDNA为模板用PCR技术扩增了K1－3功能区的基因,DNA序列分析后克隆至质粒pPIC9上获得重组质粒pPIC9K13转化毕节酵母GS115,用PCR和G418法筛选高拷贝转化子,进行摇瓶发酵。SDS－PAGE和Western blot分析结果证实K1－3基因已在GS115分泌表达,并具有免疫活性。选用30L和80L罐进行高密度发酵,甲醇诱导48h细胞密度达到OD250－300,比摇瓶提高5－6倍,表达量150－200mg/L,发酵上清液经Streamline SP离子交换及Phenyl-Sephorose疏水层析纯化,在SDS－PAGE上显示一条带,纯度96％,动物实验证明纯化产物具有抗血管生成和抗肿瘤的活性。     

转谷氨酰胺酶基因在大肠杆菌中的克隆表达

从轮枝链霉菌Streptoverticilliummobaraense细胞中获得其基因组DNA ,用一对特异性的引物通过PCR的方法扩增出转谷氨酰胺酶 (transglutaminase,TGase)全长基因 ,回收片段并将其连接到表达载体pET30a中 ,转化大肠杆菌DH5α。双向测序表明获得的转谷氨酰胺酶全长基因序列正确。纯化重组质粒转化大肠杆菌BL2 1 (DE3) ,以 1mmol/LIPTG诱导 5h收集菌体进行SDS-PAGE电泳分析 ,与阴性对照相比 ,明显多出了一条蛋白条带 ,紫外扫描显示此带约占总蛋白量的1 7% ,Westernblotting证实此带能够特异性地与兔抗MTG(味之素公司 )的抗体发生反应。测得纯化后得到的TGase蛋白的酶活可以达到 15.1U/mg蛋白。     

重组人源脑红蛋白的高效表达、纯化及鉴定

脑红蛋白(Neuroglobin,NGB)是新发现的主要表达于脊椎动物神经元及视网膜中的第三类携氧珠蛋白。已有诸多报道认为脑红蛋白在缺氧缺血性脑损伤的神经保护过程中,作为活性氧簇(ROS)的清除剂或缺氧信号的感受器起重要作用,但其神经保护作用的具体机制不明。显然,实现该蛋白的制备对于研究其功能具有重要作用。基于此,通过RT-PCR从人胎脑中扩增出脑红蛋白cDNA并克隆到原核表达载体pBV220,通过测序鉴定正确后转化至大肠杆菌HB101中诱导表达,表达产物超声破碎后经凝胶过滤柱Sephacryl S-200和阴离子交换柱Q Sepharose FF纯化,最后通过Sephadex G-25脱盐。经15% SDS-PAGE和Western blot检测及质谱和蛋白序列分析鉴定制备的蛋白样品为脑红蛋白。本文采用两步法实现了脑红蛋白高效特异性纯化,为后期基于脑红蛋白神经保护作用的功能及机制研究奠定了重要基础。     

一个新的人乙酰化酶MAK3的克隆、表达和纯化

在对乙酰GNAT家族进行研究分析的过程中,找到一个人GNAT家族的新成员MAK3。MAK3含有一个保守的乙酰化酶结构域,并且不同物种中的MAK3的蛋白质序列高度保守。通过半定量和定量RT—PCR检测了在不同组织中MAK3的mRNA水平。并且把MAK3分别克隆到了真核和原核表达质粒中,通过免疫印迹技术证实了MAK3的表达。还进一步用亲和层析的方法成功纯化了细菌中表达的MAK3,并对纯化后的MAK3的酶活性进行了测定。     

紫杉醇生物合成相关酶基因的克隆与表达

以牛儿基牛儿基二磷酸为前体的紫杉醇生物合成大约有20步酶促反应,其反应过程已基本阐明,近一半的相关酶基因已得到克隆与表达。综述了编码参与紫杉醇生物合成的紫杉二烯合酶、紫杉二烯5α羟化酶、紫杉烷10β羟化酶、紫杉烷13α羟化酶、紫杉二烯5α醇O乙酰基转移酶、紫杉烷2α苯甲酰转移酶、去乙酰基巴卡亭Ⅲ10βO乙酰转移酶、3氨基3苯基丙酰转移酶和3N去苯甲酰2脱氧紫杉醇苯甲酰转移酶等9个酶基因的克隆和表达方面的研究情况,并指出随着紫杉醇生物合成的分子生物学研究的不断深入,利用分子生物技术大规模生产紫杉醇将为期不远 。