猪戊型肝炎病毒ORF2片段克隆及原核表达

设计套式引物，内套引物含有BamHⅠ／XhoⅡ酶切位点，采用RT-PCR技术扩增猪戊型肝炎病毒（UEV）结构蛋白基因ORF2部分片段，长度为634bp，将其克隆于PGEX-T载体，测序结果表明插入的片段属于戊型肝炎病毒ORF2部分，将该片段插入PproEXHTb表达载体，经酶切鉴定证实获得了重组表达质粒。将重组质粒转化大肠杆菌BL21，经1mmol／L IPTG诱导，得到表达，表达蛋白分子量为27Ku，以包涵体形式存在。Western blot分析表明，该蛋白可以与猪戊型肝炎阳性血清反应，表明该蛋白具有良好的反应原性。     

猪源戊型肝炎病毒ORF2部分基因的原核表达及其鉴定

本试验旨在表达猪源戊型肝炎病毒(sHEV)ORF2部分基因片段,纯化表达产物并进行抗原性分析。以sHEV的cDNA为模板,PCR扩增ORF2基因片段,构建重组质粒pET32a-dORF2,转化表达菌BL21,IPTG诱导,SDS-PAGE凝胶电泳和Western blotting进行检测。试验结果表明,获得60 ku的目的蛋白,该蛋白具有良好的抗原性,主要以可溶性形式存在。     

我国鸡群禽戊型肝炎病毒RT-PCR检测及部分ORF2基因序列分析

为从核酸水平证实我国鸡群中禽戊型肝炎病毒(HEV)的存在,本实验从山东省某鸡场患有肝脾肿大综合征的病鸡中采集10份粪便和8份胆汁样品,利用RT-PCR方法检测其中禽HEV ORF2基因片段,并将阳性PCR产物克隆测序。结果显示:18份粪便和胆汁样品中,13份为禽HEV RNA阳性;其序列间的同源性为97%～99%,与GenBank中登录的参考序列同源性为76.6%～98.1%;进化树显示与欧洲地区的禽HEV在同一分支,属于禽HEV基因3型。禽HEV ORF2基因的检出为进一步了解禽HEV对我国家禽养殖业的危害以及在我国的流行情况奠定了基础。     

猪戊型肝炎病毒ORF2基因的分段原核表达及抗原表位的初步鉴定

为了初步鉴定猪戊型肝炎病毒(sw HEV)ORF2蛋白的抗原表位,通过设计两对引物,PCR扩增ORF2-1和ORF2-2两段基因片段,使用p MD18-T载体克隆,双酶切后构建重组质粒p ET32a-0RF2-(1,2),转化大肠杆菌BL21后进行IPTG诱导和SDS-PAGE凝胶电泳,最后用4株ORF2单抗对其进行Western Blot来初步鉴定其抗原表位。结果表明,分别获得约为36 ku和35 ku的两个目的蛋白,均以不可溶形式存在,抗原表位初步定位于ORF2-1这段蛋白中的414~523 aa。     

江西部分地区猪粪便戊型肝炎病毒核酸检测及序列分析

采集江西省A猪场2～3月龄猪粪便40份,B猪场2～3月龄猪粪便40份,利用反转录套式聚合酶链方法(RT-nPCR),检测戊型肝炎病毒(hepatitis E virus,HEV)RNA,结果表明,A猪场7份样品为阳性,阳性率17.5%.B猪场10份样品为阳性,阳性率25.0%.总阳性率21.3%.对4份PCR扩增阳性产物进行纯化并测序,利用生物学软件进行序列分析和进化树绘制,4个分离株ORF2 348 bp同源性为92.1%～97.5%,为同一基因型,与HEV1、HEV2、HEV3同源性分别为70.7%～77.4%、72.5%~75.7%和71.6%～76.8%,与HEV4型的同源性79.2%～83.9%.4个分离株与HEV4型的代表株T1在同一分支上,属基因4型.与中国大陆6株猪源HEV比较,同源性为79.0%～87.3%,提示中国大陆猪源HEV的基因型比较一致,同属HEV 4型.     

猪戊型肝炎病毒ORF2部分片段原核表达载体的构建

利用Protean软件对猪戊型肝炎病毒(hepatitis E virus,HEV)swCH189株的ORF2进行潜在抗原位点分析,选取381aa－623aa段作为表达片段,运用PCR方法从ORF2全长质粒中扩增出目的片段cp239,经纯化、连接等,成功构建了表达载体pET32a(+)-cp239,为下一步进行基因原核表达及其生物学活性分析奠定了基础。     

人畜共患戊型肝炎的流行病学研究进展

戊型肝炎是由戊型肝炎病毒引起的一种自限性疾病,既往称肠道传播的非甲非乙型肝炎,临床症状与甲型肝炎极为相似.目前发现5个基因型,而且呈明显的地域性分布,主要分布于亚洲、非洲和中美洲的发展中国家,有流行性和散发性两种形式,其中以流行性为主.该病毒主要以经粪-口途径传播,与人畜关系密切,可引起人和牲畜严重的疾病.对戊型肝炎病毒的流行特点及途径作了一些简要分析,希望能对戊型肝炎的流行、预防研究提供参考.     

4例禽戊型肝炎病例的实验室诊断及ORF2基因遗传进化分析

本研究通过分子流行病学诊断技术,分别从山东、辽宁、吉林、陕西4个地区表现肝炎症状的病鸡中,采集肝脏和脾脏样品,利用RT-PCR方法,检测禽戊型肝炎病毒(aHEV),并对aHEV-ORF2基因片段进行测序,利用MegAlign进行同源性比较。结果显示:4个鸡场的病鸡样品均为aHEV阳性,aHEV-ORF2基因序列间同源性为84.5%~94.5%,与已报道的4种基因型同源性均小于84.0%,其中与基因1型的澳大利亚株和韩国株同源性为81.6%~82.8%,与基因2型的美国原型株和美国无毒株同源性为80.9%~82.8%,与基因3型的欧洲株和中国株同源性为80.8%~82.5%,与基因4型的匈牙利株和中国台湾株同源性为81.4%~82.6%。ORF2基因进化树分析显示:4株aHEV均属于戊型肝炎B种,形成独立的基因分支,但不属于已报道的4个基因型,而在一个新型独立分支上,表明国内存在一种新基因型的aHEV流行。本研究为我国aHEV的进一步研究提供了基础和依据。     

戊型肝炎病毒感染检测方法的研究进展

建立针对戊型肝炎病毒(HEV)感染的具有较高敏感性、特异性和稳定性的检验方法,对戊型肝炎(HE)患者和患畜的早期诊断和治疗,以及控制食源性戊肝病毒感染具有重要意义。本文针对目前检测HE病毒及其特异性抗体的不同方法和特点作了综述。     

猪戊型肝炎病毒Ⅳ型衣壳蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

为获得猪戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus,HEV)Ⅳ型衣壳蛋白单克隆抗体,将猪HEV衣壳蛋白的C端267(408—675)个氨基酸基因序列克隆入原核表达载体pET-28a(+),构建重组质粒pET-28a-ORF2-C,转化E.coli Rosetta(BL21)感受态细胞进行诱导表达,SDS-PAGE和Western blot鉴定,纯化后免疫小鼠。取免疫小鼠的脾脏与鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合制备单克隆抗体。通过间接ELISA和竞争ELISA方法筛选并鉴定单抗。结果表明蛋白得到正确、高效表达,获得3株识别不同的抗原表位区的单克隆抗体,分别命名为Mab-1E4(IgG1)、Mab-2C7(IgG1)和Mab-2G9(IgG2b),其中1E4和2G9能阻断临床阳性猪血清,提示该2株单克隆抗体识别的抗原表位是猪HEVⅣ型衣壳蛋白上重要的抗原表位区,而单抗Mab-2C7不能阻断。本研究为猪HEVⅣ型的诊断及研究提供重要工具。     

鸡传染性支气管炎病毒核蛋白基因重组真核表达载体的构建

将已经序列测定的鸡传染性支气管炎病毒（IBV）HB株的核蛋白基因亚克隆到表达载体pcDNA3的KpnⅠ酶切位点，快速筛选鉴定出含有HB核蛋白基因的重组质粒，经酶切、PCR及Southern鉴定为正向插入了HB核蛋白基因，将其命名为pcDNA-N。对重组质粒进行大量扩增，应用聚乙二醇纯化后，对SPF雏鸡进行了免疫攻毒试验，结果表明，IBV核蛋白在抗感染和抗致死方面具有一定的作用。     

牛脂联素基因真核表达载体的构建及鉴定

为了构建牛脂联素基因真核表达载体,试验采用RT-PCR方法扩增牛脂联素(bovine adi-ponectin,BovADPN)基因,将其克隆到pMD18-T载体中,测序正确的质粒经EcoR Ⅰ和Not Ⅰ双酶切,回收目的基因片段将其定向克隆到pPICZαtA载体中,构建重组质粒pPICZαA BovADPN.结果表明:克隆的基因序列与GenBank公布的序列有100%的同源性;目的基因正向插入,阅读框正确无误,说明牛脂联素基因真核表达载体构建成功.     

旋毛虫Ts43基因真核表达载体的构建及其在Vero E6细胞中的表达

利用RT—PCR技术从黑龙江省猪源旋毛虫获得了Ts43基因，并克隆入pcDNA3．1-CT—GFP真核表达载体中构建重组质粒，用该重组质粒在脂质体介导下转染VeroE6细胞，GFP标签证明质粒DNA成功转染到细胞中并得以表达，通过Western—blot分析，细胞裂解液样品中有1条约66ku的条带，可被小鼠旋毛虫阳性血清所识别，与预计大小一致，说明，真核表达载体pcDNA3．1-CT—GFP中的Ts43基因在VeroE6细胞中获得了表达，表达产物具有抗原性。     

口蹄疫病毒非结构蛋白3B真核表达载体的构建及表达

设计、合成FMDV非结构蛋白3B基因的PCR引物，并在引物5’端和3’端分别加入含BamH I和HindⅢ限制性酶切位点序列。以FMDV基因组PNA为模板，利用RT—PCR技术扩增3B基因，得到的基因片段经BamH I/HindⅢ双酶切后与转座载体pFASTBAC HTa连接，转化宿主菌DH10BAC，在含庆大霉索、卡那霉索、X-gal、IPTC的LB平板上37℃培养24h，提取白色菌落，从中提取重组Bacmid 3B，与脂质体共同转染昆虫细胞8f9，得到重组杆状病毒，病毒经传代扩增后感染High5细胞，表达目的蛋白——FMDV非结构蛋白3B。SBS-PAGE及Westem Blot结果显示，本研究成功构建了Bacmid-3B重组表达载体，并在昆虫细胞中表达了NSP—3B蛋白，该表达产物可与MDV感染的猪、牛血清产生免疫反应。     

马动脉炎病毒大囊膜糖蛋白真核表达载体的构建与瞬时表达

将马动脉炎病毒大囊膜糖蛋白基因GL插入真核表达载体pVAX1中构建真核表达载体pVAX1-GL，酶切和测序结果表明构建是正确的，用脂质体转染试剂将其转染BHK-21细胞并通过问接免疫荧光试验检测其在体外的表达情况，结果在转染的细胞表面观察到绿色荧光，证明基因得到了表达，而对照则无绿色荧光，本研究为马动脉炎基因疫苗的研究奠定了基础。     

牛源金黄色葡萄球菌的分离鉴定及ClfA基因的克隆和真核表达载体的构建

以研制安全有效的奶牛乳腺炎金黄色葡萄球菌基因工程疫苗为目的,采集380份隐性和临床型乳房炎奶样,经高盐肉汤、过氧化氢酶、甘露醇发酵、三糖铁发酵试验以及Baird-Parker平板对金黄色葡萄球菌进行分离和生化鉴定,PCR扩增分离株凝集因子基因(Clf A)并连接TA克隆载体。经测序确定无误后,连接pc DNA3.1His B以构建真核表达载体pc DNA 3.1His B-Clf A,转化Trans T1TM感受态细胞,HindⅢ和XhoⅠ双酶切分析,同时进行测序和序列分析。结果显示,通过高盐肉汤、过氧化氢酶、甘露醇、三糖铁试验和Baird-Parker平板从380份隐性及临床型奶牛乳房炎奶样中共分离到35株金黄色葡萄球菌,成功构建了真核表达载体(pc DNA3.1His B-Clf A),为研制金黄色葡萄球菌基因工程疫苗奠定基础。     

DINH与C3d3融合基因真核表达质粒的构建

为了构建DINH和mC3d基因融合的分泌型真核表达载体,试验将含有INHα(1～32)基因的pMD19-INH构建含有双拷贝INHα(1～32)基因的真核表达载体pcDNA-DPPISS-DINH,然后将鼠源C3d基因引入DINH基因3′端构建 了一种基于DINH-C3d3的抑制素基因疫苗pcDNA-DPPIS-DINH-C3d3.酶切及测序结果表明,pcDNA-DPPIS-DINH、pcDNA-DPPIS-DINH-sC3d3构建正确.     

大肠杆菌不耐热肠毒素A亚基K63突变体表达载体的构建及其在真核细胞中的表达

采用PCR方法从产肠毒素大肠杆菌(ETEC)44815菌株基因组中扩增不耐热肠毒素A亚基(LTA)编码基因,并将大肠杆菌不耐热肠毒素A亚基基因插入到含有人CD5信号肽序列的pcDNACD5sp真核表达载体中,构建成pcDNACD5sp/LTA分泌性真核表达载体,然后采用定点突变方法将大肠杆菌不耐热肠毒素A亚基第63位的丝氨酸改变为赖氨酸,构建成pcDNACD5sp/LTAK63突变体,经磷酸钙介导将pcDNACD5sp/LTAK63质粒转染HEK293T细胞进行表达.结果表明:试验克隆的大肠杆菌不耐热肠毒素A亚基基因与GenBank中大肠杆菌不耐热肠毒素A亚基基因序列相比,碱基序列、氨基酸序列同源性均达99%;表达产物经Western-blot检测,结果说明构建的含有人CD5信号肽的LTAK63基因能够在真核细胞中进行分泌性表达.     

猪带绦虫六钩蚴TSOL18真核表达载体pVTSOL18m的构建

根据Kozak原理设计引物，以重组原核表达载体pGEX—TSOL18为模板扩增TSOL18基因，用EcoRⅠ、XhoⅠ酶切后与经相同处理的pVAX1载体连接并转化JM109感受态细胞，经测序证明读码框正确后，再根据PCR点突变的方法设计引物。将目的基因NruⅠ位点中的碱基（第347位）经三次PCR反应突变，最终获得含突变位点的TSOL18m基因。EcoRI、XhoI再次酶切后与pVAX1载体连接，成功构建了含点突变的重组pVAX1表达载体，为TSOL18基因重组犬2型腺病毒活载体疫苗的研制奠定了基础。     

兔病毒性出血症病毒VP60基因真核表达载体的构建以及在真核细胞中表达

应用RT-PCR技术扩增编码兔出血症病毒衣壳蛋白VP60基因,将PCR产物克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+)中,获得重组质粒pcDNA-VP60,并将其转染Vero细胞。经间接免疫荧光试验,证实pcDNA-VP60在体外细胞中能够成功表达具有免疫原性的VP60蛋白。