骨髓间充质干细胞体外定向诱导心肌样细胞的实验研究

目的研究兔骨髓间充质干细胞（mensenchymal stem cell,MSC）经5-氮杂胞苷（5-azacytidine,5-aza）诱导在体外定向分化为心肌样细胞形态学及分子生物学特征,为心肌样细胞鉴定提供依据。方法取兔髂骨骨髓,分离并培养骨髓间充质干细胞,用5-氮杂胞苷定向诱导向心肌样细胞分化。相差显微镜、透射电镜观察心肌样细胞形态学变化及超微结构特征,RT—PCR检测心房利钠肽、受磷蛋白、β-肌球蛋白重链表达。结果5-氮杂胞苷诱导后,部分细胞体积增大,呈“棒状”或“珠状”结构,有肌管样结构形成,透射电镜下有肌丝、心房颗粒及线粒体等心肌样细胞超微结构形成,RT—PCR检测显示有心房利钠肽、受磷蛋白、β-肌球蛋白重链表达。结论经5-氮杂胞苷诱导骨髓间充质干细胞体外可分化为心肌样细胞。     

5-氮胞苷诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化观察

目的：探讨5-氮胞苷（5-aza）对纯化培养的骨髓间充质干细胞（MSCs）向心肌样细胞分化的影响.方法：取雄性Wistar大鼠下肢长骨骨髓进行体外培养和连续传代,取第3代MSCs以10 μmol/L 5-aza诱导作用24 h后,用含体积分数为5%胎牛血清的完全培养基继续培养,观察细胞形态学变化,并在4周后行免疫细胞化学染色鉴定α-Actin,Desmin及心肌特异性肌钙蛋白T（cTnT）的表达.结果：5-aza作用MSCs 7d后细胞形态及排列发生变化,14～21 d左右细胞数量较诱导前明显减少,28 d后细胞稀落,周围伸出多个长的突起,细胞体积大小不等.经抗α-Actin抗体、抗Desmin抗体、抗cTnT抗体鉴定部分细胞出现阳性染色,阳性细胞率分别为20%,19%和10%.结论：骨髓间充质干细胞在体外特定的诱导条件下可以向心肌样细胞分化,有望成为缺血性心脏病细胞移植治疗的细胞材料.     

微小RNA可在人骨髓间充质干细胞分化来源的心肌样细胞中表达

目的研究人骨髓间充质干细胞（hMSCs）分化来源的心肌样细胞中代表性微小RNA（miRNAs）的表达。方法利用FITC-偶联的CD29、CD34和CDllb抗体在流式细胞仪上检测分离的hMSCs的抗原表型。分别用5-氮胞苷（5-aza）和乳鼠心肌非接触共培养法诱导传至3代的hMSCs分化为心肌样细胞。用免疫化学法检测hMSCs分化来源的心肌样细胞中心肌特异的α-肌节辅肌动蛋白和心肌肌钙蛋白（cTnI）的表达：利用逆转录PCR和DNA测序鉴定5个代表性的心脏特异的初级微小RNA（pri-miRNAs）的表达。结果hMSC标志分子CD29表达率为98．87％．而造血细胞标志分子CD34和CDllb的表达率只是5％和0．4％。免疫化学分析显示．分别经5-aza和乳鼠心肌非接触共培养诱导的hMSC均可表达α-肌节辅肌动蛋白和cTnI,而在未分化的hMSCs中无表达。miRNA-143,-181可在5-aza诱导的hMSCs中表达,miRNA．143,-181,-206,-208可在乳鼠心肌非接触共培养的hMSCs中表达．而两种诱导方法均未能诱导miRNA-1-2在hMSCs中表达。结论利用5-aza和乳鼠心肌非接触共培养法诱导hMSCs分化的心肌样细胞中可以表达不同的心脏特异的pri-miRNAs。     

5-氮胞苷诱导大鼠骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的实验研究

目的:研究体外培养大鼠骨髓间充质干细胞(mensenchymal stem cells,MSCs) 经5-氮胞苷(5-aza) 诱导定向分化为心肌样细胞形态学及分子生物学特征?方法:SD大鼠股骨骨髓经密度梯度离心及贴壁分离培养传代MSCs,体外用5-aza定向诱导向心肌样细胞分化?相差显微镜观察心肌样细胞形态学变化?免疫组化检测肌钙蛋白T(cTnT)?α-肌动蛋白和缝隙连接蛋白Cx43表达?结果:密度梯度离心及贴壁法分离培养的MSCs生长稳定,增殖快?5-aza诱导后,部分细胞形态发生变化,有肌管样结构形成?随诱导后培养时间延长MSCs中cTnT?α-肌动蛋白和缝隙连接蛋白Cx43表达逐渐增强?结论:密度梯度离心及贴壁分离培养可获得大量纯度较高的骨髓间充质干细胞?经5-aza诱导骨髓间充质干细胞体外可分化为心肌样细胞?     

骨髓干细胞的肝细胞样细胞分化

干细胞是生命科学研究领域的一个热门话题,骨髓干细胞是目前研究较多且较深入的一类成体干细胞,主要有造血干细胞和间充质干细胞两大类成分。早期的研究主要集中于血液学相关的方面,近年来对髓源干细胞分化潜能的研究层出不穷,现已证实它不仅能分化为同胚层的细胞,还能在一定条     

碱性成纤维细胞生长因子体外诱导犬骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化

目的探讨不同剂量的碱性成纤维细胞生长因子体外定向诱导犬骨髓间充质干细胞（BMSCs）向心肌样细胞分化的可行性。方法采用密度梯度离心法分离犬BMSCs并进行传代培养。四甲基偶氮唑盐（MTT）法和流式细胞术检测第3代BMSCs的增殖及DNA周期;取第3代BMSCs设置对照组,碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）10、100μg·L^-1组进行体外诱导培养,镜下观察其形态变化,细胞生长曲线法检测细胞增殖情况;免疫荧光法鉴定心肌肌钙蛋白I（TnI）、肌球蛋白重链（MHC）和波形蛋白（Vimentin）的表达。结果密度梯度离心法得到的BMSCs呈长梭形、聚集性生长,第3代BMSCs MTT法检测结果显示细胞生长阶段为潜伏期、对数生长期及平台期。DNA周期检测结果:G₀/G₁期为（91.90±1.68）%,表明绝大部分细胞处于非增殖状态。经诱导分化3周后,3组细胞经生长曲线法检测结果显示:1³ d,bFGF10、100μg·L^-1组细胞数较对照组增殖明显,差异有统计学意义（P<0.05）;4⁵ d,对照组细胞呈对数生长趋势,bFGF 10、100μg·L^-1组细胞数量减少;6⁷ d,bFGF诱导组较对照组细胞数明显减少（P<0.05）,而bFGF 10μg·L^-1组与bFGF100μg·L^-1组比较细胞数量明显偏少（P<0.05）。免疫荧光法检测结果显示:经诱导分化4周后,bFGF 10μg·L^-1组和bFGF100μg·L^-1组的细胞均表达TnI和MHC,不表达Vimentin;对照组均不表达TnI、MHC和Vimentin。结论 10μg·L^-1bFGF能够有效促进BMSCs的体外增殖,并具有向心肌样细胞分化能力。     

脉冲微交流电刺激促进体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞向心肌分化

目的 探讨脉冲微交流电刺激对体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的作用.方法 常规方法 分离培养鼠骨髓间充质干细胞,取P3细胞进行5-氮胞苷诱导,诱导后以是否给予脉冲微交流电刺激分为两组,观察各组细胞生长情况、细胞形态学及超微结构改变,免疫细胞化学方法 检测、cTnT、Cx43的表达.结果 脉冲微交流电刺激组细胞较非刺激组生长良好,更早出现心肌样细胞改变,诱导后1周可观察到胞内肌丝形成及、cTnT、Cx43的表达,且在随后的相同时相点(诱导后2、3、4周),、cTnT、Cx43表达水平明显高于非刺激组,胞内肌丝也由杂乱分布逐渐成束,部分细胞可观察到肌节.结论 模拟心脏跳动的脉冲微交流电刺激有助于经5-氮胞苷诱导的骨髓间充质干细胞在体外分化为功能完备的心肌样细胞.     

EPCs在MSCs向肝样细胞转化中作用的初步探讨

目的：探讨内皮前体细胞(endothelial precursor cells, EPCs)在间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)向肝样细胞转化中的作用。方法：分离培养SD大鼠MSCs和EPCs,取第3代MSCs向肝样细胞转化培养,培养过EPCs的无血清及因子的培养基(endothelial progenitor cell-conditioned medium, EPCs-CM)、无血清的α-最低必需培养基(alpha minimal essential medium, α-MEM)分别与肝细胞转化培养基按1∶1比例配置,作为实验组和模型对照组,正常α-MEM培养基为空白对照组,分别观察细胞形态及数量变化;在培养3、5、7、9 d时应用免疫荧光检测甲胎蛋白(alpha fetoprotein, AFP)、清蛋白(albumin, ALB)的表达。结果：空白对照组MSCs形态无明显变化;实验组与模型对照组细胞均出现肝样细胞形态。空白对照组未见AFP、ALB表达,模型对照组和实验组在3、5、7、9 d AFP、ALB表达水平均增高,其中实验组比模型对照组AFP、ALB水平增高明显。结论：EPCs在MSCs向肝样细胞转化中可能起一定的促进作用。     

体外培养鼠骨髓间充质干细胞及其向心肌样细胞诱导分化的实验研究

目的 通过体外培养骨髓间充质干细胞(MSCs),并用5-氮胞苷诱导其向心肌样细胞分化,研究MSCs生物学特性和5-氮胞苷效能.方法 将SD大鼠的骨髓采用贴壁法进行分离培养及传代增殖,相差显微镜下观察细胞形态变化,绘制生长曲线,并用流式细胞仪技术检测CD29、CD45的表达,进行细胞成分鉴定.用5-氮胞苷体外诱导MSCs,观察其形态结构.用免疫组化检测肌钙蛋白T(cTnT)、结蛋白(Desmin),用RT-PCR检测心肌特异因子基因β-肌球蛋白重链(β-MHC)的表达.结果 贴壁法分离培养的MSCs生长稳定,增殖较快.经5-氮胞苷诱导后,MSCs形态发生变化,可见肌管样结构.免疫组化和RT-PCR证实MSCs经体外诱导发生了向心肌样细胞的分化.结论 采用贴壁筛选法,简便易行,短期内可获得大量的纯度较高的骨髓间充质干细胞;在5-氮胞苷的诱导下,骨髓间充质干细胞呈现向心肌样细胞分化的趋势.     

5-氮胞苷诱导大鼠骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化的研究

目的探讨体外5-氮胞苷诱导大鼠骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化的可行性。方法分离培养骨髓间充质干细胞,传至第3代后,加入5-氮胞苷诱导24h,按照诱导浓度分为对照组、5μmol/L组、10μmol/L组、15μmol/L组4组,培养4w,倒置显微镜观察形态变化,有无自发搏动,在第1、2、3、4w行细胞免疫组化检测α-Actin、Connexin43表达。结果 5-氮胞苷浓度10μmol/L组为适宜诱导浓度,5μmol/L组浓度不能达到诱导分化作用,15μmol/L组细胞死亡率高。未观察到心肌样细胞的单个搏动或多个同步搏动。结论经过5-氮胞苷诱导后的心肌样细胞在形态和结构特性上均与心肌细胞相似,但由于5-氮胞苷为细胞毒性药物,其应用于临床的安全性有待商榷。     

bFGF促进大鼠骨髓间充质干细胞向神经元转化及机制

目的探讨碱性成纤维生长因子对大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元的作用及信号通路.方法利用bFGF与不同生长因子和化学诱导剂组合诱导间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)向神经元转化,观察分化过程中细胞形态、数目的变化,观察免疫细胞化学检测分化后细胞神经细胞标志蛋白和部分神经功能相关蛋白以及FGFR的表达情况,并计算转化率.结果①3组不同条件诱导后,MSCs均能分化为具有典型神经元形态的细胞,并明显表达NSE、MAP2和5-HT1D,但不表达GFAP;②bFGF预诱导组的转化率明显高于未预诱导组;③诱导后的神经元样细胞FGFR3表达明显增强.结论以DMSO和BHA为基础诱导剂,bFGF预处理可明显提高MSCs跨胚层分化为神经元样细胞的转化率,浓度为10 ng/ml的bFGF主要是通过FGFR3作用于MSCs.     

心肌细胞体外微环境中骨髓间质干细胞向心肌样细胞的分化

目的：分析心肌组织内何种细胞对骨髓间质干细胞（bone mesenchymal stem cells,BMSCs)的定向分化起决定作用。方法：利用BMSCs与心肌细胞（cardiomyocytes,CM)、内皮细胞（endothelial cells,EC)共培养和单独培养，分析形态和结构蛋白表达等方面的变化。结果：与CM共培养后，相邻的BMSCs之间融合成肌管样结构，并与相邻胎鼠CM初步形成闫盘样结构。心肌肌球蛋白重链（myosin heavy chain,MHC)抗体染色呈阳性。在与EC共培养以及BMSCs单独培养时，BMSCs均未出现肌管样结构，MHC染色呈阴性。结论：CM对BMSCs的定向分化具有一定作用。     

心肌细胞对骨髓间充质干细胞分化为心肌细胞的影响

目的：观察大鼠成体心肌细胞对骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）定向分化的诱导作用。方法：应用Percoll’s密度梯度离心法分离培养大鼠MSCs，传2代后用流式细胞术检测其表面CD34,CD71和CD90的表达，然后用Lipofectamine2000介导pEGFP-N3转染标记MSCs。将GFP标记的MSCs与新鲜分离的成体大鼠心肌细胞分别按接触、非接触（MILLICELLTM-HA半透膜分层培养）及心肌细胞条件培养液培养。1周后应用免疫荧光检测MSCs α-actin，desmin和cTnT的表达。结果：接触培养组中可见表达GFP的MSCs细胞同时表达α-actin,desmin和cTnT，而分层培养组及条件培养组中均未见α-actin，desmin和cTnT的表达。结论：大鼠成体心肌细胞与MSCs接触培养，可能诱导MSCs分化为心肌细胞。     

人骨髓间充质干细胞体外定向分化为心肌细胞的实验研究

目的：建立人骨髓间充质干细胞（MSCs）体外定向分化为心肌细胞的实验模型。方法：取6个月水囊引产胎儿股骨骨髓,Percoll分离液分离,取单个核细胞层在人MSCs专用MSCGM培养基中体外培养。将第3代生长状态良好的MSCs用10μmol／L 5-氮胞苷孵育诱导24h,继续向心肌细胞诱导分化。结果：用Percoll分离液（1．073g／ml）分离得到的单个核细胞48～72h呈纺锤形、梭形、多角形的多型性改变;经5-氮胞苷孵育24h,细胞逐渐向梭形心肌细胞样形态转变,胞浆中可见棕黄色颗粒。结论：MSCs在体外经5-氮胞苷孵育24h,可被定向诱导分化为心肌形态的细胞。     

VEGF-C联合HGF促进间充质干细胞向淋巴管内皮细胞分化的研究

目的：使用血管内皮细胞生长因子C（vascular endothelial growth factor C,VEGF-C）与肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor,HGF）联合诱导大鼠骨髓间充质干细胞（bone marrow-derived mesenchymal stem cells,BMSCs）向淋巴管内皮细胞（lymphatic endothelial cells,LECs）方向分化,寻求最适HGF浓度,探索HGF的促分化机制。方法：原代培养获得BMSCs,流式细胞仪检测相关表面抗原以及向成骨诱导分化鉴定干细胞特性,取原代培养第３代细胞进行诱导实验。设置50 ng/ml VEGF-C分别联合10、20、40、60、80、100 ng/ml HGF配置诱导培养基的6个联合诱导组以及同时设置50 ng/ml VEGF-C诱导组、50 ng/ml HGF诱导组和空白对照组,诱导10 d后利用real-time PCR检测各组LECs标志性分子淋巴管内皮细胞透明质酸受体-1（lym－phatic endothelial hyaluronan receptor 1,LYVE-1）,同源异形盒蛋白1（prospero homeobox protein 1,Prox1）的表达,得出HGF最适浓度。Western blot、real-time PCR检测HGF诱导组、空白对照组、VEGF-C诱导组的LECs标志性分子LYVE-1、Prox1的表达,以及检测空白对照组、VEGF-C诱导组、HGF联合VEGF-C诱导组的integrinα9的表达。结果：成功分离获得原代培养大鼠BMSCs,80 ng/ml HGF联合50 ng/mlVEGF-C诱导组的LYVE-1、Prox1的mRNA表达量最高（PProx1=0.000,PLYVE-1=0.000）,同时HGF诱导组未检测到相关LECs标志性分子的表达,HGF联合VEGF-C诱导组的integrinα9的表达较VEGF-C诱导组明显提高（PWestern blot=0.001,Preal-time PCR=0.000）。结论：当HGF浓度为80 ng/ml时,此时HGF联合VEGF-C可更好地促进大鼠BMSCs向LECs分化。同时,在该浓度条件下HGF不具有单独诱导大鼠BMSCs分化为LECs的能力,但能在诱导分化过程中明显提高integrinα9的表达,证明在促分化过程中HGF可能是通过间接上调integrinα9表达发挥作用。     

骨髓间充质干细胞体内诱导分化为心肌细胞的初步实验观察

目的：初步观察MSCs墨体内诱导分化为心肌细胞的能力。方法：从大鼠双侧股骨骨髓获得MSCs，在体外纯化、扩增后，DAPI进行细胞标记，然后注射到急性心肌梗塞模型鼠和正常大鼠的心肌组织内，饲养2～4周后，处死动物在注射点获取心肌标本，初步采用肛染色和电镜观察形态学的方法对分化的心肌细胞进行鉴定，并用免疫组化法从组织学上对转化心肌细胞进行心肌特异性抗原的检测。结果：MSC进行DAPI的标记效率高，电镜观察与宿主心肌细胞问形成了闰盘，组化检测有心肌特异性抗原的出现。结论：在宿主心肌组织内，MSCs具有分化为心肌细胞的能力。     

体外诱导人骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化

目的 探索在体外诱导人骨髓间充质干细胞(hMSC)向心肌细胞分化的方法。方法 以5-杂氮胞苷(5-Aza)对hMSC诱导,利用结蛋白抗体、房性利钠肽抗体以及闰盘蛋白抗体进行免疫组化染色,并进行超薄切片透射电镜观察。结果 经反复多次传代后,细胞形态及抗原表达无改变,始终保持未分化状态和稳定扩增。利用5-Aza对其诱导后第2周始,免疫组化染色发现细胞结蛋白、闰盘蛋白以及房性利钠肽表达均为阳性,不同浓度5-Aza诱导组之问差异无显著性。电镜观察发现这些细胞具有心肌细胞的特点。结论 在体外利用5-Aza可以诱导hMSC向心肌细胞分化。     

大鼠心肌细胞诱导人骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的研究

目的:研究人间充质干细胞(MSCs)向心肌方向分化的机制.方法:将人MSCs以10000/cm2的密度接种,共分为四组:1)对照组;2)共同培养组:人MSCs和新生SD大鼠心肌细胞进行共同培养;3)条件培养液组:将从新生SD大鼠心肌细胞培养中获得的培养液,用于人MSCs的培养;4)细胞匀浆液组:将心肌细胞匀浆液用于人MSCs的培养.分别于实验第2、5、7天收集各实验组的人MSCs,进行Desmin及肌钙蛋白Ⅰ的免疫组化染色.在共同培养组中,同时还用抗人DNA进行的荧光原位杂交,以区分鼠来源的细胞及人来源的细胞.结果:在对照组、条件培养液组及细胞匀浆液组均未检测到心肌特异性蛋白的表达.在共培养组中,第2天,部分人MSCs开始表达Desmin,第5天细胞开始表达cTnI,至第7天阳性表达率达35%左右.结论:与大鼠心肌细胞共同培养可以诱导人MSCs向心肌方向的分化,而心肌细胞的条件培养液及心肌细胞匀浆不能诱导它们的心肌分化.     

低氧微环境促进嗅黏膜间充质干细胞向神经元分化及其相关机制

目的：研究低氧微环境下利用嗅鞘细胞(olfactory ensheathing cells,OECs)上清液诱导嗅黏膜间充质干细胞(olfactory mucosa mesenchymal stem cells,OM-MSCs)更多地向神经元分化及其相关的机制。方法：分离培养OECs和OM-MSCs,应用流式细胞仪和免疫荧光方法分别进行鉴定;实验将OM-MSCs分为3%O2+低氧诱导因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)抑制剂利非西呱(lifi ciguat,YC-1)+OECs上清诱导组(A组)、3%O2+OECs上清诱导组(B组)及21%O2+OECs上清诱导组(对照组)。采用免疫荧光检测分化后的神经元,采用定量聚合酶链反应(quantitative polymerasechain reaction,Q-PCR)和Western印迹分别检测HIF-1α的mRNA及 βIII-微管蛋白(βIII-tubulin)、胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic portein,GFAP)的表达,再用膜片钳检测分化后的神经元钾离子通道开放情况。结果：实验各组相比较,B组OM-MSCs诱导后免疫荧光显示βIII-tubulin表达最多,Q-PCR显示B组HIF-1α表达明显增高(均P<0.05);Western 印迹表明B组中βIII-tubulin蛋白表达显著增多,而胶质细胞标志物GFAP表达明显降低(均P<0.05);且诱导分化后的神经元经膜片钳检测发现钾离子电流。结论：低氧微环境下的OM-MSCs经OECs上清液诱导能显著提高其向神经元分化的比例,并明显降低了神经胶质细胞的产生,且与细胞HIF-1α信号通路被激活有关。     

EphrinB2基因工程的骨髓间质干细胞对分化成血管内皮细胞的影响

目的 观察研究ephrinB2基因转染对体外诱导环境大鼠骨髓问质干细胞(BMSCs)分化成血管内皮细胞的促进作用.方法 采用密度梯度离心-贴壁培养法从Wistar大鼠骨髓中得到BMSCs.采用lenti-virus载体装载人ephrinB2基因转染大鼠BMSCs.采用流式细胞计数测定CD105、CD73、CD44、八因子(VWF)和血管内皮生长因子受体(KDR)等标志物在ephrinB2-BMSCs中的表达,并探讨其向成骨细胞及脂肪细胞体外分化的多向分化潜能.以2％FBS和50ng/ml血管内皮生长因子(VEGF)的培养条件,体外诱导ephrinB2-BMSCs向血管内皮细胞分化,并测定相应标志物的表达.结果 未经诱导分化的ephrinB2-BMSCs表达CD105、CD73和CD44,不表达血管内皮细胞特异性标志物VWF和KDR.转染后的ephrinB2-BMSCs依然具有分化成脂肪细胞和成骨细胞的多向分化潜能.经诱导,ephrinB2-BMSCs表达VWF与KDR,并且其生成血管内皮细胞的比率及在Matrix基质上形成毛细血管样结构的比率均显著高于未转染ephrinB2的BMSCs.结论 ephrinB2基因工程的BMSCs具有极高的向血管内皮细胞分化的潜能.这种基因工程细胞为建立冠心病患者的临床治疗新方法提供了有意义的资源.