探讨两种石蜡包埋组织DNA提取方法

正随着精准医学和个体化医学的快速发展,人们对分子检测的研究越来越广泛、越来越深入;寻找疾病的遗传学发病因素,对不同患者实施适于其病情的治疗及使用不同剂量的药物逐渐成为医学发展的方向[1,2]。新鲜组织、石蜡包埋组织、外周血、胸腹水等样本中核酸的提取,是分子生物学的基本要求。由于患者病程及身体状况等原因,很多情况下短期内获取人体新鲜组织、胸腹水等标本较困难,而甲醛固定石蜡包埋组织(formalin-fixed paraffin-embeded tissue,FFPET)     

冷冻切片后甲醛固定石蜡包埋组织DNA质量分析

目的分析冷冻切片后再行甲醛固定、石蜡包埋组织的DNA质量,探讨其在分子病理检测中的应用价值。方法收集已行术中快速冷冻病理诊断的肺腺癌14例,分别提取同一病例冷冻切片后剩余组织蜡块及常规包埋组织蜡块DNA,检测DNA浓度及OD260/OD280值,行内参基因PCR扩增以检测DNA完整性,并以ARMS法行EGFR基因突变检测。结果冷冻切片后固定包埋组织提取DNA浓度及OD260/OD280均值,分别为157.33 ng/μL及1.96,均较常规包埋组织低;所有冷冻后包埋组织提取的DNA均具有100 bp及200 bp的PCR产物,但仅部分能扩增出300 bp及400 bp的PCR产物,DNA完整性稍逊于常规固定包埋组织;冷冻后包埋组织与常规包埋组织EGFR基因突变检测结果完全一致。结论组织冷冻后再行甲醛固定及石蜡包埋,会使得组织DNA进一步降解及片段化,但仍适用于ARMS法的分子病理学检测。     

全自动核酸提取仪与手动提取组织DNA的效率比较

正近年,随着众多与疾病诊断、预后及治疗相关的分子标志物的出现,以石蜡组织DNA为材料进行分子水平的基因检测及筛查已成为临床诊断及相关研究的常规手段。对于各种基因分析而言,重要的是能够获得足够纯度和数量的DNA~([1])。DNA提取是分子生物学研究的一项基础技术,其提取的质量好坏及数量的多少直接影响到分子生物学实验的开展~([2])。目前病理科所使用的DNA大部分为人工提取,     

档案保存石蜡组织中抗原丢失的评估

<正>福尔马林固定石蜡包埋组织(formalin fixed paraffin embedded, FFPE)是病理科常规档案保存标本,其对患者预后和后续治疗评估具有重要作用,也是进行临床科学研究的不可替代资源。研究发现,石蜡组织切片长时间保存会导致组织中抗原丢失[1]。本文对一组不同年限的石蜡组织块行免疫组化检测,评估常见细胞核、质、膜表达抗原在档案蜡块中的表达,现将实验结果报道如下。1材料与方法1.1 蜡块收集1988～2     

石蜡包埋软骨组织中DNA提取方法的改良

<正>随着基因遗传学的发展,DNA检测技术也日臻完善,而对某些特定疾病的基因分析能为探究疾病的发病机制以及遗传概况提供可靠的方法学依据。各大医院的病理科均存留着大量的组织蜡块,从这些石蜡标本中提取DNA可以在短时间内获得足够的目标疾病DNA。目前已有多位学者对从石蜡     

石蜡包埋组织提取DNA不同条件下的PCR扩增

背景：在甲醛固定石蜡包埋组织的制作及保存过程中会对DNA造成损害,提取的DNA在用于PCR扩增时部分结果并不理想。 目的：比较分析石蜡包埋组织中提取DNA应用于PCR反应的影响因素。 方法：从10.0 μm×2、10.0 μm×4和10.0 μm×5石蜡包埋食管癌组织切片中提取DNA,以0.05,0.1,0.2 μg模板DNA量扩增内参基因β-actin,PCR反应循环次数分别为35,40,45次,分析影响PCR反应的因素。 结果与结论：琼脂糖凝胶电泳结果显示以10.0 μm×2组织切片量,PCR反应循环次数40次,PCR反应模板DNA量      0.05 μg扩增取得的目的基因DNA的质量最高。说明减少石蜡包埋组织用量和减少模板DNA量有助于获得高质量的PCR反应条带,且PCR反应循环次数应大于40次,小于45次,再增加循环次数,则意义不大。 关键词：石蜡包埋组织;提取DNA;PCR反应;循环次数;模板DNA doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2012.11.017     

石蜡包埋组织PCR检测中DNA提取方法的比较及改进

目前,PCR常用于新鲜组织或细胞提取标本中的核酸分子的检测,较少用于检测石蜡包埋的陈旧组织中的DNA,其主要原因是后者核酸的提取较为困难。针对这种情况,我们在对文献报道的几种石蜡包埋组织提取DNA的方法进行了比较的基础上,进行了改进,提高了石蜡包埋组织提取DNA进行PCR的阳性率,现介绍如下。     

石蜡包埋组织基因组DNA提取的条件优化

DNA提取是分子生物学研究的基础工作.在进行回顾性实验研究时,病理科保存的大量石蜡包埋组织(paraffin-embedded tissues, PETs)系分子生物学研究材料的可靠来源,但从福尔马林固定的PETs中提取高质量的DNA仍存在一定难度.PETs在制作过程中受到多种理化因素影响,造成DNA降解严重,使得PCR扩增结果不稳定.如何避免DNA分子损失,保持DNA相对完整和纯度是亟待解决的难题.本研究通过比较不同脱蜡方法和抽提方法所得DNA的质量,旨在找到一种安全有效的PETs中提取DNA的方法.     

微阵列比较基因组杂交技术在肿瘤研究中作用

人类肿瘤的研究重心经历了从单基因水平到染色体、多基因水平的转变。许多人类肿瘤与发育异常疾病一样以基因组DNA拷贝数变化为特点。在癌症中，不利于肿瘤生长的基因（抑癌基因）可能存在于DNA拷贝数减少的区域；而有利于肿瘤发生、发展的基因（癌基因）可能存在于DNA拷贝数增加的区域。1992年，Kallioniemi等。首次描述了比较基因组杂交（CGH）技术。其基本原理是：分别用不同的荧光标记体系标记来自待检组织和正常组织的全基因组DNA，[第一段]     

提高组织芯片切片成功率的方法和体会

Ｋｏｎｏｎｅｎ等[1] 于 1998年创立了真正意义的组织芯片或称组织微阵列 (ｔｉｓｓｕｅｍｉｃｒｏａｒｒｙ ,ＴＭＡ)技术 ,将直径 0 .6ｍｍ的乳腺癌小组织样本 ,以阵列方式包埋于同一块 2 0ｍｍ× 45ｍｍ的石蜡块中 ,然后进行切片 ,用于同一实验指标的研究。而由此产生的蜡块切片可同时用于ＤＮＡ、ＲＮＡ或蛋白水平的原位组织学研究 ,使基因、蛋白水平的研究与组织形态学特征相结合。目前已应用到肿瘤的进展、预后、早期诊断以及与ｃＤＮＡ基因芯片相结合 ,进行高表达基因的定位研究 ,研究报道的有乳腺癌[1 3] 、前列腺癌[4 6 ] 、脑肿瘤…     

人血细胞DNA无酚提取法

目的 寻找最佳的从血液尤其是凝血中提取DNA的方法,减少实验和临床检测血液的用量.方法 静脉抽取30份健康体检者的血样,分别抗凝、不抗凝处理后,用经优化的不需要酶和有机溶剂的抽提程序提取DNA,通过电泳和PCR进行检测.结果 凝血和抗凝血的DNA产量分别是(40.2±8.86)mg DNA/L和(39.1±10.2)mg DNA/L;纯度分别为1.87±0.11和1.92± 0.12.所有样本的DNA分子质量都很高,从两者的DNA样本中能很容易地扩增出t-PA基因的第8内含子区ALU等位基因二态性,因此所提取的DNA是完整可靠的.结论 该方法能快速、简单、有效、无毒地从新鲜血液和凝血中提取DNA,适合于临床检测和分子生物学研究.     

病理收纳盒的设计及应用价值

正石蜡切片技术是组织学、发育生物学和病理学研究的重要技术手段,广泛用于医疗、教学和科研[1-3]工作中。常规石蜡切片的制作过程包括固定、脱水、浸蜡、包埋、切片和染色,其中的每一个环节均会影响最终制片的质量[4-6]。石蜡切片操作过程包括切片、捞片、放片,涉及的辅助工具如毛     

一种从石蜡包埋组织中快速提取DNA的方法

目的建立从甲醛固定石蜡包埋组织中高效、快速提取基因组DNA的方法。方法将一片10μm厚石蜡包埋大肠癌组织切片直接浸入150μl消化液中,56℃孵育0.5h、1h和2h,灭活蛋白酶K后离心取上清即为DNA提取物。琼脂糖凝胶电泳检测所提取DNA的片段分布,紫外分光光度法测定DNA的产量及纯度。以提取的DNA为模板,PCR扩增不同长度产物片段并进行产物的直接测序以评价提取方法。结果该提取方法能够获得较长片段的基因组DNA,从一片10μm厚石蜡切片中即可获得大约60μg的DNA,在0.5h消化条件下获取的模板DNA,即可实现对152bp、293bp、392bp和541bp等4种不同片段的100%扩增,1h消化组的PCR产物可直接用于DNA测序。结论建立了一种简单、快速地从甲醛固定石蜡包埋组织中提取DNA的方法,只需一步消化即可获得满足普通PCR及测序需要的基因组DNA。     

两种脱钙液对骨髓穿刺组织DNA质量的影响比较

<正>骨髓穿刺组织是病理科常见的标本,随着精准医学的发展和个体化治疗需求的增加,除了进行常规HE染色和免疫组化检测外,还需辅助分子生物学检测。良好的DNA质量是分子生物学检测的前提,脱钙液的选择对DNA质量有重要影响^[1],因此进行分子生物学检测前需要评估脱钙后骨髓穿刺组织DNA质量。混合酸脱钙液和EDTA脱钙液是本科室两种常用的骨髓穿刺组织脱钙液,在常规组织学染色方面已经取得良好的效果,但其对DNA质量的影响尚不清楚。本实验通过提取两种脱钙液脱钙骨髓穿刺组织的DNA,从浓度、纯度、片段长度及RT-PCR检测Ct值比较两种脱钙液对DNA质量的影响,取得较好效果,现报道如下。     

BIOMED-2系统引物用于检测T细胞淋巴瘤石蜡样本T细胞受体γ基因重排的研究

目的 了解BIOMED-2系统T细胞受体(TCR)γ引物组合对T细胞淋巴瘤的常规石蜡包埋组织样本中TCR基因重排的检出情况及其实用性.方法 用酚/氯仿法提取55例各种组织类型的T细胞淋巴瘤石蜡包埋组织样本的DNA并通过扩增看家基因β-globin检测其质量,利用BIOMED-2系统TCR-γ引物组合和TCR-γ基因通用型引物(TVG/TJX)对55例进行TCR基因重排检测,比较二者的检出率并进行统计学分析.结果 BIOMED-2系统TCR-γ引物组合和TCRγ基因通用型引物(TVG/TJX)的TCR基因重排检出率分别为76.4%和60.0%,前者高于后者,二者的差异无统计学意义(P>0.05).结论 BIOMED-2系统TCRγ引物组合适用于本组T细胞淋巴瘤石蜡包埋组织样本的TCR基因重排检测.     

利用存储数十年的档案组织蜡块提取RNA进行回顾性研究

现已证明从福尔马林固定和石蜡包埋的陈旧组织中提取DNA和RNA进行分子生物学研究的有效性。从档案组织中提取的DNA和RNA的质量和数量受不同因素的影响:如固定剂、固定时间、保存     

石蜡包埋组织DNA提取方法的比较及巢式PCR技术的应用

确定从福尔马林固定、石蜡包埋(FFPE)组织中提取DNA的最佳方法,增强长片段PCR产物的成功扩增率,便于分子生物学与临床医学的有机结合。本文选取正常甲状腺FFPE标本20份,分别应用一步法、酚/氯仿抽提法和试剂盒法三种不同的方法提取总DNA,并应用传统PCR法和巢式PCR法对线粒体DNA(mtDNA)的D环区进行扩增。结果酚/氯仿抽提法所得样本DNA的OD260/D280比值最高,为1.703±0.086。一步法、酚/氯仿抽提法和试剂盒法提取DNA的普通PCR长片段扩增成功率分别为0%、5%和10%,而巢式PCR长片段扩增成功率分别为0%、95%和85%。可见用蛋白酶K消化、酚/氯仿纯化法提取的FFPE组织标本DNA质量可靠,巢式PCR技术是从石蜡标本中扩增长片段DNA的有效方法。     

特异引物双扩增即时PCR与传统测序法检测肠癌、肺癌患者K-ras基因突变的比较

目的 以特异引物双扩增即时PCR技术K-ras检测试剂盒(下称ADx-K-ras即时PCR试剂盒)和Sanger DNA测序法同时检测结直肠癌和肺癌患者K-ras基因,以了解K-ras基因突变频率和突变类型,比较ADx-K-ras即时PCR试剂盒和Sanger DNA测序法用于肿瘤K-ras基因体细胞突变检测的临床价值.方法 收集临床肿瘤病理石蜡切片样品827例,其中肠癌样品583例,肺癌样品244例,提取DNA后,对K-ras基因第12和13密码子进行PCR扩增后,使用ADx-K-ras即时PCR试剂盒进行检测,与此同时,将PCR扩增后的产物进行Sanger DNA测序.两种方法对K-ras基因第12和13密码子的检测结果进一步进行各个突变类型的数目和突变率的统计对比.结果 ADx-K-ras即时PCR试剂盒对827例样品检测都得到了明确的结果,检测成功率为100%,Sanger DNA测序成功检测了677例,成功率为81.9%.583例肠癌样品中ADx-K-ras即时PCR试剂盒检测出突变192例,突变检出率为32.9%,Sanger DNA测序成功的样品533例,检出突变160例,突变检出率为30.0%.244例肺癌样品中ADx-K-ras即时PCR试剂盒检出突变26例,突变检出率为10.7%,Sanger DNA测序成功的样品144例,检出突变12例,突变检出率为8.3%.肠癌中第12密码子第2位的GGT→GAT最常见,占全部突变的35.1%(66/188),其次是第13密码子第2位的GGC→GAC,26.6%(50/188),第12密码子第2位的GGT→GTT,18.6%(35/188),第12密码子第1位的GGT→GCT最少见,1.6%(3/188).肺癌中第12密码子第1位的GGT→GTT最常见,占全部突变的40.9%(9/22),同样第12密码子第1位的GGT→GCT最少见,占全部突变的4.5%(1/22).结论 肠癌中K-ras突变率明显高于肺癌.对于甲醛固定石蜡包埋样品而言,ADx-K-ras即时PCR试剂盒对样品的DNA质量的耐受性较好,检测成功率高于Sanger DNA测序,可替代Sanger DNA测序法成为临床上对肿瘤K-ras基因体细胞突变检测的实用方法.     

小鼠不同器官组织脱水方法的改进

正目前由于科研工作的需要,不同种类实验动物的组织石蜡切片应用日益广泛。在医学科研工作中,实验标本多来自于动物模型,如小鼠、大鼠、兔及犬等,其中尤以小鼠最为普遍[1]。人体标本与动物标本的组织处理,以及同一种属动物不同脏器间的处理程序也不尽相同,必须根据其组织结构特点,采用不同于人体组织的处理方法[2]。实验动物组织柔软,含水分多,在固定、脱水、透明和浸蜡等过程中若处理不当则很容易出现组织块变脆、收缩过度等现象,影响切片的成功率[3]。本实     

微卫星多态性分析技术检测肿瘤组织等位基因杂合性丢失在石蜡标本上的应用

通过微卫星多态性分析技术检测可以发现肿瘤在某染色体特定区域发生杂合性丢失（ＬＯＨ）,从而揭示该区域可能存在多个与肿瘤发生、发展相关的肿瘤抑制基因（ＴＳＧ）［１,２］。过往研究多应用在新鲜组织中,我们参考文献［３］将该技术应用到石蜡标本上,在酶消化、循环次数、模板量等方面进行探索,取得成功。一、材料与方法１．标本来源：３８例肝癌标本来自１９９３～１９９６年本院病理存档蜡块,选取肿瘤和瘤旁肝组织蜡块,部分病例的蜡块是肿瘤和正常肝组织混杂。２．ＤＮＡ的抽提：选取瘤细胞保存较好的瘤组织和癌旁肝组织蜡块,…