Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ胶原基因在泡球蚴感染中期小鼠肝脏中的表达及意义

目的观察泡球蚴感染中期BALB/c小鼠所致肝纤维化时Ⅰ型胶原(Col1a1)、Ⅲ型胶原(Col3a1)、Ⅳ型胶原(Col4a1)基因的表达及意义。方法将雌性BALB/c小鼠随机分为实验组(8只)和对照组(5只)。实验组小鼠开腹,肉眼直视下左肝叶内注射泡球蚴混悬液,建立疾病动物模型;对照组以同样方法注射等量生理盐水。于感染中期第12周,颈椎脱臼处死小鼠,实验组取病变组织和病变邻近肝组织,对照组取注射部位所在肝组织以及临近肝组织,用4%甲醛固定,常规石蜡包埋,HE、Masson染色后观察形态学改变和肝纤维化程度。取病变临近肝组织,提取总RNA,反转录合成cDNA,实时荧光定量PCR(Real-time PCR)检测Col1a1、Col3a1、Col4a1基因的表达,计量结果用相对单位(AU)表示。结果泡球蚴感染组和对照组Collal基因表达量分别为(2.155±0.809)AU和(1.000±0.221)AU,差异有统计学意义(t=3.427,P<0.05);Col3a1基因表达量分别为(18.641±10.244)AU和(1.000±0.412)AU,差异有统计学意义(t=10.324,P<0.01);Col4a1基因表达量分别为(0.894±0.495)AU和(1.000±0.381)AU,差异无统计学意义(t=1.932,P>0.05)。Masson染色检查泡球蚴感染组肝纤维化评分为2.72±1.04,对照组为1.0,差异有统计学意义(t=4.105,P<0.05)。结论在泡球蚴感染小鼠中期,引起肝纤维化的胶原主要为Ⅲ型和Ⅰ型。     

实时荧光定量PCR检测多房棘球蚴感染小鼠肝脏丝氨酸蛋白酶抑制基因方法的建立

目的 建立多房棘球蚴(泡球蚴)感染小鼠肝脏丝氨酸蛋白酶抑制基因(Serpina3g)实时荧光定量PCR(RT-qPCR)的检测方法及与常规RT-PCR检测方法的比较.方法 肉眼直视下肝脏穿刺注射100 μl泡球蚴组织匀浆液建立泡球蚴感染小鼠模型,3个月后将小鼠处死,Trizol法提取肝脏总RNA,反转录获得cDNA.依据Serpina3g的编码基因(NM_009251)保守序列,通过Primer 5软件设计定量引物,以β-actin作为内参.以健康小鼠肝脏获得的cDNA依次10倍梯度稀释制备标准品(1×10~2～1×10~6 pg),利用SYBR Green RT-qPCR方法检测Serpina3g基因,然后根据cDNA浓度与循环值(Ct)的线性关系,绘制标准曲线,确定RT-qPCR检测的最佳条件和重复性;并将RT-qPCR结果与常规RT-PCR琼脂糖凝胶电泳结果进行特异性、灵敏度和定量等方面的比较.结果 筛选出Serpina3g基因定量引物,最佳退火温度为56.4℃;RT-qPCR无非特异性扩增,标准品及样品熔解温度均在80.5℃,熔解峰单一;标准曲线斜率为-2.833(效率),相关系数r=0.996;5个不同梯度的样本(1×10~2-1×10~6pg)重复检测5次均为阳性,变异<5%;mRNA检出限为1×10~2 pg,总RNA在1×10~2～1×10~6 pg内均可以进行扩增;常规RT-PCR方法mRNA检出限仅为1×10~6 pg.结论 成功建立了小鼠源Serpina3g的PT-qPCR检测方法,在特异性、灵敏度、重复性和定量方面优于常规RT-PCR.     

内参照基因在实时荧光定量RT-PCR检测中的应用

目的 建立测定内参照β-actin表达量的实时荧光定量RT-PCR两步法检测方法.方法 根据Genbank 中人β-actin保守区域序列设计荧光PCR适用的引物和探针,构建质粒标准品建立标准曲线用于荧光PCR相对定量,检测荧光PCR方法的特异性和重复性.结果 建立了人β-actin实时荧光RT-PCR检测方法.结论 本实验建立的人β-actin表达实时荧光RT-PCR两步法检测方法特异性和重复性较好,为β-actin作为定量RT-PCR中内参照基因进行人其他功能基因和病原基因表达的定量分析奠定了基础.     

泡球蚴感染小鼠Tregs与Th17细胞相关细胞因子的平衡变化

目的通过检测泡球蚴感染小鼠血清中Tregs相关细胞因子IL-10与Th17细胞相关细胞因子IL-17的浓度变化,探讨其在泡球蚴感染过程中的平衡变化关系。方法 60只雌性BALB/c小鼠随机分为实验组和对照组,实验组小鼠腹腔接种泡球蚴,对照组小鼠腹腔接种等量生理盐水,分别在接种后2、8、30、90、180和360d实验组与对照组各取5只小鼠,采血,收集血清,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测IL-10和IL-17的表达水平。结果与对照组相比,小鼠血清IL-10水平在感染中晚期显著升高(P<0.01);IL-17水平在整个感染期均显著性升高(P<0.05),且晚期高于早期(P<0.01);IL-10与IL-17水平成正相关(r=0.655,P<0.01)。结论通过相关细胞因子的作用,Tregs与Th17细胞可能共同促进泡球蚴慢性感染的形成。     

基因1型狂犬病病毒一步法荧光定量RT-PCR检测方法的建立

目的在我国狂犬病均由基因1型狂犬病病毒（rabies virus,RV）引起。本研究针对RV N基因保守序列设计并合成了一套简并引物和Taqman探针,在优化反应条件的基础上,建立了检测RV核酸的一步法荧光定量RT-PCR（qRT-PCR）检测方法。方法与结果该方法能特异检测基因1型,不能检测基因2-7型和犬瘟热病毒（CDV）、犬细小病毒（CPV）、犬腺病病毒（CAV）、水泡性口炎病毒（VSV）、日本乙型脑炎病毒（JEV）等5种非狂犬病病原体,其检测灵敏度可达到4.68个TCID50的病毒含量。用该方法对29份新鲜和5份腐败的临床犬脑组织样品进行检测,并与国际金标准确诊方法狂犬病荧光抗体染色法（FAT）和乳鼠脑内接种试验（MIT）及本实验室建立的套式RT-PCR方法进行比较。结果表明所建立的qRT-PCR与套式RT-PCR的符合率为100%,二者均检测出12份阳性的新鲜样品和5份阳性的腐败样品,而FAT只检测出12份阳性的新鲜样品和1份阳性的腐败样品,MIT只检测出12份阳性,未检测出阳性腐败样品。检测中FAT和MIT确诊的所有阳性样品在qRT-PCR检测均是阳性,而在FAT检测为阴性的4份腐败样品在qRT-PCR为阳性,说明所建立的qRT-PCR方法准确性达到了FAT和MIT的水平,而且灵敏度更高,更适合于腐败样品的检测。结论研究结果表明该qRT-PCR方法特异性好、灵敏度高、污染率低、操作简单,在我国动物狂犬病临床诊断上具有巨大的应用价值。     

人、沙鼠、小鼠泡球蚴抗原诊断泡球蚴病的比较研究

用同一组47例泡球蚴患者和115例对照血清比较研究了人、沙鼠和小鼠泡球蚴抗原的诊断价值。人、沙鼠和小鼠泡球蚴抗原的阳性率各为97.8％、100％和97.8％,三者无显著差异(P>0.05)。三者的假阳性率也无显著差异(P>0.05)。用沙鼠泡球蚴抗原检测时,95.74％病例的消光值在0.70以上,非常显著地高于人(48.94％)和小鼠(57.45％)抗原,P均<0.01。在1:1600以上抗体滴度组中,沙鼠泡球蚴抗原检出74.47％病例,非常显著地高于人(6.38％)和小鼠(29.79％)泡球蚴抗原(P均<0.01)。以滴度几何均数计,沙鼠泡球蚴抗原检测最高为1:1209,是小鼠泡球蚴检测的2.89倍和人泡球蚴抗原检测的3.32倍。说明在诊断人体泡球蚴病时宜用沙鼠泡球蚴抗原。以SDS-PAGE分离的人、沙鼠和小鼠泡球蚴抗原的蛋白质带数各为23、36和15。讨论了蛋白质带数与泡球蚴病诊断的关系。     

人类SUZ12基因实时荧光定量PCR检测方法的建立

目的:建立SYBR Green I实时荧光PCR定量检测人类SUZ12基因的方法.方法:将SUZ12 RT-PCR扩增片段克隆入载体pGEM-T后,经测序鉴定正确后,进行纯化和定量及系列稀释,应用SYBR Green I实时荧光定量PCR检测SUZ12,建立标准曲线,熔解曲线分析产物的特异性.结果:该法检测的最低拷贝数为14.2,线性范围为1.42×10~1-1.42×10~8拷贝,相关系数r为-1.00,1.42×10~7拷贝/L标本的批内变异系数(CV)和日间CV分别为1.8%和2.8%.熔解曲线分析显示单一的峰,熔解温度(melting temperature,Tm)为(81.37±0.16)℃.结论:实时荧光定量PCR方法检测SUZ12基因,快速有效、灵敏度高、特异性好.     

鼠类携带淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

目的建立检测鼠类携带淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒（lymphocytic choriomeningitis virus,LCMV）的实时荧光定量RT-PCR方法。方法根据LCMV核蛋白编码基因序列设计合成特异性引物对和TaqMan荧光探针,经优化反应体系和条件,建立LCMV实时荧光定量RT-PCR检测方法,然后进行灵敏度、特异性和重复性试验,并对79份宁波口岸捕获的鼠样品进行检测。结果建立实时荧光定量RT-PCR方法对鼠肺总RNA检测的灵敏度为20pg,是常规PCR方法的100倍;试验的重复性良好,CV值为0.85%;试验的特异性为100%。用该方法检测79份鼠样品有3份LCMV阳性,与常规RT-PCR结果一致。结论成功建立了鼠LCMV实时荧光定量RT-PCR检测方法,对于监测和防控鼠传LCM有重要意义。     

实时荧光定量PCR检测人类EZH2基因方法的建立

目的:建立SYBR Green Ⅰ实时荧光PCR定量检测人类EZH2基因的方法.方法:将EZH2 RT-PCR扩增片段克隆入载体pGEM-T后,经测序鉴定正确后,进行纯化和定量及系列稀释,应用SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测EZH2,建立标准曲线,熔解曲线分析产物的特异性.结果:该法检测的最低拷贝数为10,线性范围为101～108拷贝,相关系数r为-1.00,104copies/μl标本的批内变异系数(CV)和日间CV分别为1.0%和2.7%.熔解曲线分析显示单一的峰,熔解温度(Tm)为(83.42±0.13)℃.结论:实时荧光定量PCR方法检测EZH2基因,具有高敏感性、高特异性和高精确性等优点,可作为进一步研究EZH2的方法.     

Echinococcus multilocularis: superinfections in experimentally infected mice (author's transl)

The influence of subcutaneous superinfections following an intraperitoneal primary infection after 4 and 14 weeks respectively has been examined in Echinococcus multiolcularis infected NMRI-mice. It could be shown that the growth of subcutaneous echinococci is inhibited in superinfected mice (372 mg) if compared with control mice (903 mg parasite weight). Other differences (composition of serum proteins and white blood cells, hemoglobin content) are exclusively due to the primary intraperitoneal infection.     

泡球蚴感染BALB/c小鼠肝脏中ICOS表达的动态变化

目的观察泡球蚴感染BALB/c小鼠肝脏中诱导性协同刺激分子(ICOS)的动态变化。方法将60只BALB/c小鼠随机分成实验组和对照组,实验组经腹腔注射感染泡球蚴,对照组以相同的方法注射生理盐水。分别于感染后2、8、30、90、180和300d各处死5只小鼠,取肝脏组织,通过HE染色观察病理变化,通过免疫组化观察泡球蚴感染后ICOS的动态改变。结果与对照组比较,泡球蚴感染小鼠肝脏ICOS表达升高,表达部位主要在肝细胞浆和肝细胞膜。结论泡球蚴感染鼠肝组织ICOS表达增高。ICOS可能参与泡球蚴感染致肝纤维化及肝损伤过程。     

Augmented bioavailability and cysticidal activity of albendazole reformulated in soybean emulsion in mice infected with Echinococcus granulosus or Echinococcus multilocularis

The anthelminthic drug, albendazole (Abz), was reformulated in a soybean oil emulsion and evaluated as a therapeutic agent for the treatment of Echinococcus granulosus and Echinococcus multilocularis in mice. Abz emulsified with 30% soybean oil (AbzE-30) resulted in higher circulating plasma concentrations of the major bioactive Abz metabolite, Abz sulfoxide (AbzSOX), after oral administration, compared with an Abz suspension. The soybean oil-emulsified Abz compound was also noted to penetrate into the hydatid cyst wall and produced higher hydatid cyst concentrations of AbzSOX. The emulsion was superior to Abz suspension in reducing the size of hydatid cysts caused by E. granulosus protoscolices collected from naturally infected sheep in Urumchi, Xinjiang Uygar Autonomous Region. In contrast, the reformulated compound's ability to reduce E. multilocularis cyst masses was only marginally superior to Abz suspension. AbzE-30 exhibited increased bioavailability and bioactivity in the treatment of murine Echinococcus hydatid cyst infections. The compound has the potential for improving therapeutic outcomes for human echinococcosis.     

巢式PCR在鉴别多房棘球绦虫及细粒棘球绦虫基因亚型中的应用

目的 探索巢式PCR在鉴别多房棘球绦虫及细粒棘球绦虫基因亚型中的应用价值.方法 将水泡带绦虫、犬弓首蛔虫、多房棘球绦虫、细粒棘球绦虫羊株和骆驼株等样本的DNA用巢式PCR扩增.结果 巢式PCR可以扩增出多房棘球绦虫和水泡带绦虫,而对细粒棘球绦虫羊株和骆驼株及其他寄生虫均不能扩增出.结论 在鉴别细粒棘球绦虫和多房棘球绦虫方面,巢式PCR有一定的诊断意义,但不能用于鉴别细粒棘球绦虫基因亚型.     

细粒棘球绦虫TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

目的 为建立高效、特异的细粒棘球绦虫(Echinococcus granulosus,Eg)检测方法。方法 本研究设计了一组基于Eg线粒体基因的特异性引物和TaqMan探针,通过反应体系及条件的优化,建立了Eg荧光定量PCR检测方法。结果 该方法线性关系好,灵敏度高,在10⁹~10²拷贝/μL相关系数达0.998,灵敏度达10²拷贝/L;在特异性试验中,与其他病原虫株无交叉反应,特异性较好;重复性试验变异系数均低于3%。应用该方法对50份临床样品进行检测,发现6份为Eg感染阳性。结论 由此可见,建立的荧光定量PCR方法可快速、灵敏、特异地检测细粒棘球绦虫,具有一定的实际应用价值。     

日本血吸虫感染小鼠IL17IL23动态变化研究

目的观察日本血吸虫感染小鼠IL 17A、IL 23p19的表达,探讨IL 17、IL 23在免疫调控中的作用。方法建立日本血吸虫感染的小鼠模型,采用ELISA和RT PCR法检测小鼠感染后1、2、4、6、8及10周脾细胞培养液上清中IL 17A、IL 23p19蛋白水平和mRNA水平的表达。结果蛋白及mRNA表达结果显示,感染小鼠IL 17A与IL 23p19的变化趋势基本一致。感染小鼠IL 17A蛋白表达水平于感染后1周迅速升高,之后持续下降,8周时表达水平低于正常对照组;其mRNA表达也于感染后1周升高,第2周开始下降。而IL 23p19蛋白的表达水平于感染后1周升高,第2周到达高峰,第4周开始下降;其mRNA水平起先一直在正常范围波动,感染后4周开始升高,第6周达到峰值,之后逐渐下降。结论 IL 17和IL 23在日本血吸虫感染小鼠体内协同表达,并于感染早期呈现显著上升趋势,提示IL 17、IL 23参与了血吸虫感染极早期的免疫病理过程。     

汉坦病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立

目的通过建立汉坦病毒实时荧光定量PCR检测方法,快速准确地检测汉坦病毒。方法根据汉滩型和汉城型汉坦病S片段基因的序列分别设计特异性探针引物,使用含有目的基因片段的重组质粒标准品绘制标准曲线,建立检测两型汉坦病毒的实时荧光定量PCR方法。结果建立的检测方法特异性良好,与其他常见病原不发生交叉反应;最低检测限为101copies/μl,灵敏度高;不同梯度定量模板的拷贝数的对数值与Ct值之间线性关系表达式分别为y=-3.4607x＋40.988（HTN）,y=-3.5307x＋39.356（SEO）,扩增效率分别为92.2%（HTN）和92.6%（SEO）,相关系数R2分别为0.9968（HTN）和0.9997（SEO）,呈良好的线性关系,且重复性好。结论建立的实时荧光定量PCR灵敏度高,重复性好,可用于汉坦病毒的快速检测,并可初步辨别汉滩型和汉城型汉坦病毒,对肾综合征出血热的病原早期诊断和流行病学调查有较好的应用价值。     

裂谷热病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立

目的建立一种快速、敏感、特异的RealtimePCR（实时荧光定量PCR）方法,用于裂谷热病毒（RVFV）的检测。方法根据裂符热病毒N蛋白基因的保守序列设计并合成一对引物及特异性TaqMan探针。通过条件优化,以10倍系列稀释重组质粒为标准品,进行Real-timePCR扩增,绘制标准曲线,并进行重复性、准确性、特异性及敏感性检测。结果建立的Real-timePCR方法检测裂谷热病毒所绘制标准曲线的相关系数大于0．99,灵敏度为1．0×10^1拷贝,高于常规PCR方法（1．0×10^3拷贝）;除裂谷热病毒外的其他7种对照烈性病病原体基因检测均呈阴性;批内重复和批问重复的变异系数均小于1％。结论建立的裂谷热病毒Real-timePCR检测方法敏感性和特异性较高,可用于裂谷执病毒感染懊涑诊眯斤殛流行病学谰杏．     

早期皮下寄生多房棘球蚴的蛋白组学分析

目的 了解皮下寄生多房棘球蚴的蛋白质组特征。方法 每只BALB/c小鼠皮下多点注射约600只原头蚴,一月后分离皮下寄生的包囊,制备组织切片,HE染色,糖原染色,利用显微镜观察虫体形态,同时提取蛋白质并进行测序、GO基因功能分析和COG分析,最后利用Western blotting对部分蛋白质进行验证。结果 皮下寄生的多房棘球蚴呈半透明状,如绿豆大小,包囊内含有囊液。在光学显微镜下,可见包囊中含有子囊,囊中仅有少数原头蚴,且一些原头蚴头节上还带有小钩;囊壁糖原染色阳性,呈粉红色。测序共鉴定203种蛋白质,其中多种蛋白酶的表达水平很高,如磷酸烯醇丙酮酸羧激酶、柠檬酸合酶等。在功能上,所鉴定的蛋白质主要富集在翻译后修饰、蛋白质转换和伴侣分子信号通路、能量合成与转换以及碳水化合物运输与代谢方面,而参与免疫应答、脂质运输与代谢等方面的蛋白质则较少。在丰度较高的前20种蛋白质中,多数为参与糖代谢过程的蛋白质。Western blotting结果显示,VCP、Enolase、14-3-3和β-actin在包囊蛋白中均有不同程度地表达,而GST不表达或表达水平非常低,这与测序结果基本一致。结论 研究结果表明,皮下寄生的多房棘球蚴在糖代谢和脂质代谢方面可能发生了明显地改变,这为探索包囊不育的机理提供了有价值的线索。