微小隐孢子虫CP15基因高效真核表达载体的构建及其在Hela细胞中的表达

目的 :构建隐孢子虫CP15真核表达载体pCR3 1 15 ,观察其在Hela细胞中的表达。方法 :用BglⅡ从pMD18 T 15中酶切得到CP15基因 ,将其插入真核表达载体pCR3 1(+)的BamHⅠ位点 ,构建CP15真核表达载体pCR3 1 15 ,脂质体介导法将其转染Hela细胞 ,并用G4 18加压筛选 ,用RT PCR方法检测外源CP15基因的转录 ,用ELISA法和间接免疫荧光法检测其活性。结果 :酶切鉴定表明已成功构建了重组真核表达载体pCR3 1 15 ;外源CP15基因能在转染细胞中有效转录 ;ELISA法和间接免疫荧光法实验结果表明表达产物具有良好的生物活性。结论 :构建的pCR3 1 15真核表达载体在Hela细胞中具有良好的表达活性。     

微小隐孢子虫CP23基因真核表达载体的构建及表达

为了构建微小隐孢子虫子孢子表面蛋白CP2 3基因真核表达载体pCR3 1 2 3,观察其在Hela细胞中的表达。本研究用EcoRⅠ从pMD18 T 2 3中酶切得到CP2 3基因片段 ,将其插入真核表达载体pCR3 1(+)的EcoRⅠ位点 ,构建CP2 3基因真核表达载体pCR3 1 2 3,脂质体介导法将其转染Hela细胞 ,并用G4 18加压筛选 ,用RT PCR方法检测外源CP2 3基因的转录、ELISA法和间接免疫荧光法检测其活性。酶切鉴定表明已成功构建了重组真核表达载体pCR3 1 2 3;外源CP2 3基因能在转染细胞中有效转录 ;ELISA法和间接免疫荧光法实验结果表明表达产物具有良好的生物活性     

Ⅰ型人免疫缺陷病毒gag-gp120嵌合基因核酸疫苗的构建与鉴定

目的：构建含Ⅰ型人免疫缺陷病毒(HIV-1)gag—gp120嵌合基因核酸疫苗的表达质粒。方法：将gag和gp120连接后的嵌合基因插入到真核表达载体pVAX1中，构建真核表达质粒pVAXGE。用脂质体法将构建的重组质粒转染Hela细胞72h后，取转染的Hela细胞进行RT—PCR检测和和Dot—ELISA分析。结果：重组质粒转染细胞的总RNA中，可扩增出目的基因的转录产物。Dot-ELISA的结果显示，目的基因在Hela细胞内得到表达。结论：成功地构建了表达gag—gp120嵌合基因的核酸疫苗质粒，为HIV—1核酸疫苗的制备奠定基础。     

人FL基因高效真核表达载体的构建及其在COS—7细胞中的表达

目的：构建人FL真核表达载体－pIRS1neo/hFL,观察其在COS－7细胞 中的表达。方法：采用RT－PCR方法自人白血病细胞系TF－1中克隆可溶型FL（Flt3-ligand)cDNA片段,测序鉴定正确后,插入真核表达载体-pIRES1 neo中的EcoR Ⅰ和BamHI位点,构建hFL真核表达载体－pIRES1neo/hFL。脂质体介质法将其转染COS－7细胞,72h以RT－PCR检测转染细胞中外源hFL基因的转录、ELISA法及脐血CD34^ 细胞增殖实验测定转染细胞上清上hFL的含量和活性。结果：酶切鉴定表明成功构建了重组真核表达载体－pIRES1neo/hFL;外源hFL基因能在转染细胞中有效转录;ELISA法测得72h后培养上清中的hFL含量为每24小时251ng/10^6 cells,并且分泌的hFL具有良好的生物学活性。结论：构建hFL真核表达载体在COS－7细胞中具有良好的表达活性。     

中国株HIV-1核心蛋白Gag核酸疫苗的构建与表达

目的 构建含HIV－1中国流行株B亚型核心蛋白Gag基因的真核表达质粒，并在体外进行表达和鉴定。方法 将Gag基因插入到核酸疫苗载体质粒pVAX1中，构建真核表达质粒pVAXGAG。用脂质体法。将重组质粒转染人Hela细胞后进行表达产物的检测。结果 间接免疫荧光检测显示，转染重组质粒的细胞表面有绿色荧光。Western blot和Dot ELISA分析显示，重组质粒转染细胞的裂解物中存在表达的Gag蛋白。结论 构建的核酸苗可在体外进行表达，且表达的蛋白具有特异性。     

树突状细胞靶向性DNA疫苗的构建及其在CHO细胞的表达

目的 构建含OVA-Fc融合基因的真核表达质粒，证明其能在真核细胞CHO细胞表达。方法通过PCR从OVA-pcDNA3．1质粒中扩增出全长的小鼠OVA cDNA，酶切后克隆到含有小鼠IgG2a Fc cDNA的真核载体pMIgV，然后将OVA-Fc酶切后亚克隆入pcDNA3．1，构建真核表达载体OVA-Fc-pcDNA3．1；脂质体转染法将其导入CHO细胞，流式细胞仪、Western blot、ELISA法检测融合蛋白OVA-Fc的表达。结果酶切鉴定和序列测定证明真核表达载体OVA-Fc-pcDNA3．1构建正确；流式细胞术、Western blot、ELISA法均检测到转染的CHO细胞能表达OVA-Fc融合蛋白。结论OVA-Fc-pcDNA3．1真核表达质粒构建正确并能在真核细胞中表达，该质粒的成功构建与表达为进一步将其作为DNA疫苗治疗肿瘤、哮喘等疾病奠定了基础。     

人整合素β3亚基真核表达载体的构建及αIIbα3在细胞表面的表达

目的：构建人整合素β3亚基真核表达载体，并探讨如何使人整合素αIIbβ3在CHO细胞表面有效表达，为进一步研究整合素β3亚基作为汉坦病毒(hantavirus，HV)受体的特异性奠定基础。方法：构建编码人整合素β3真核表达载体pcDNA3．1—β3。将其与编码人整合素αIIb亚基真核表达载体，分别及共转染至中国仓鼠卵巢(China hamster ovary，CHO)细胞中进行表达。采用间接免疫荧光法(IFA)检测外源基因的表达。结果：共转染组目的蛋白呈高效的细胞膜表达。pcDNA3．1—β3单独转染组β3亚基在细胞膜的表达较共转染组弱；而pBJ1—αIIb单独转染组则未见有效的细胞膜表达。结论：人整合素αIIbβ3在CHO细胞表面的有效表达需要两个亚基共同参与。     

人端粒酶逆转录酶核心启动子调控的人TRAIL蛋白在人卵巢癌细胞中的表达

目的：构建人端粒酶逆转录酶基因核心启动子（hTERT）调控的肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体真核表达载体，并检测TRAIL在转染的卵巢癌细胞SKOV3中的表达情况。方法：利用基因重组方法将TRAIL基因克隆人带有hTERT基因核心启动子pIRES2-EGFP真核表达载体中。获得由hTERT基因核心启动子调控的绿色荧光蛋白和带有效应型TRAIL基因的真核表达载体hTERTpromoter-pIRES2-EGFP-TRAIL。采用脂质体介导的方法将hTERT调控的TRAIL基因真核表达载体转染人卵巢癌SKOV3细胞，采用G418筛选获得阳性克隆；应用免疫细胞化学法、蛋白质印迹分析、流式细胞术（FCM）结合间接免疫荧光、RT—PCR法检测转染前后卵巢癌细胞中外源基因的表达。结果：经酶切鉴定及测序结果证实所构建载体正确。转染细胞中的TRAIL表达明显高于对照组细胞。结论：成功地构建了hTRET基因核心启动子调控的TRAIL基因真核表达载体，并在人卵巢癌细胞系SKOV3中得到稳定表达，为进一步研究其对卵巢癌细胞生物学行为的影响奠定了实验基础。     

抗Cyclin D1胞内抗体AD5N基因真核表达载体的构建及其对乳腺癌细胞增殖的抑制作用

目的：构建细胞核定位的抗CydinD1胞内抗体基因的真核表达载体并分析其对乳腺癌细胞增殖的抑制效应。方法：利用PCR技术和分子克隆技术，构建编码细胞核定位的抗CydinD1胞内抗体基因（AD5N）的真核表达载体pcDNA3．1-ADSN，利用脂质体介导法转染MCF-7细胞，RT-PCR、间接免疫荧光、Westernblot和流式细胞术分析该胞内抗体基因ADSN在MCF-7细胞中的表达、定位及抑瘤效应。结果：经限制性内切酶分析及序列分析发现，成功构建编码细胞核定位的抗CyclinD1胞内抗体（AD5N）基因的真核表达载体pcDNA3．1-ADSN，基因片段为855bp，编码285个氨基酸，分子量约为30kD。RT-PCR、免疫荧光及Westernblot实验结果显示，仅在转染胞内抗体基因的MCF-7细胞中存在该胞内抗体的表达，并且主要分布在细胞核区域。与野生型MCF-7细胞和转染空质粒的细胞相比，在MCF-7／pcDNA3．1-ADSN细胞中ADSN的表达可明显抑制MCF-7细胞增殖，显著诱导细胞凋亡（P〈0．01），使G0-G1期细胞周期指数增高12．64％，S期指数下降15．22％，凋亡细胞指数上升9．15％。结论：细胞核定位的抗CyclinD1胞内抗体ADSN基因的表达，可有效抑制乳腺癌细胞的增殖，阻滞细胞周期进展，并诱导细胞凋亡。     

iNOS基因和iNOS-VP1融合基因真核表达载体的构建及初步表达

目的 构建pcDNA3．1介导的诱导性一氧化氮合成酶（iNOS）的基因表达载体和pcDNA3．1介导的iNOS与柯萨奇病毒B组3型（CVB3）结构蛋白VP1融和基因的表达载体。方法 应用PCR扩增和DNA重组技术构建pcDNA3．1-iNOS和pcDNA3．1-iNOS—VP1表达载体；应用真核细胞转染技术及间接免疫荧光技术进行所构建的真核表达载体的初步表达和鉴定。结果 经PCR扩增技术用特异引物从质粒pKSiNOS分离编码iNOS开放阅读框架的cDNA，TA克隆于pMD19-T载体，根据设计引物时加入的酶切位点将插入片断亚克隆于表达载体pcDNA3．1；经PCR扩增技术用特异引物从质粒pCR2．1-VP1分离编码CVB3VP1结构蛋白的cDNA，TA克隆于pMD19-T载体，根据设计引物时加入的酶切位点将VP1亚克隆于iNOS的表达载体pcDNA3．1-iNOS，从而构建含有iNOS和VP1融合基因的真核表达载体。限制性内切酶分析、PCR鉴定和测序证实重组体peDNA3．1-iNOS和peDNA3．1-iN—OS—VP1插入片断的大小和方向正确且开放阅读框架的读码框不变；重组质粒peDNA3．1-iNOS和peDNA3．1-iNOS．VP1在HeLa细胞中均有表达，但表达效率较低。结论 获得含iNOS基因和iNOS—VP1融合基因的真核表达载体，并将重组质粒进行了初步表达，为体外iNOS抗CVB3作用的研究奠定了物质基础。     

微小隐孢子虫Cpgp40/15基因DNA疫苗表达载体的构建及其在Hela细胞中的表达

将微小隐孢子虫Cpgp4015基因定向克隆到真核表达载体pVAX1中多克隆位点XbaⅠ和PstⅠ之间,经酶切鉴定,构建真核表达重组质粒pVAX1-Cpgp4015,用脂质体介导法将其转染Hela细胞,并用G418加压筛选,后经SDSPAGE和Westernblot方法检测外源基因Cpgp4015的表达情况,得到预期大小的蛋白带,表明该重组质粒能够在哺乳动物细胞中较好地表达。     

pEGFP-C3 -insig2融合基因真核表达质粒的构建、表达及其对下游基因的影响

目的：构建insig 2基因的真核表达质粒, 转染3T3-L1细胞并观察对下游脂肪酸结合蛋白（AP2）mRNA、脂联素mRNA表达的影响.方法：采用RT-PCR法获取小鼠全长insig 2基因, 并克隆入真核表达载体pEGFP-C3中.酶切、测序鉴定后, 经脂质体转染入3T3-L1细胞, 通过荧光显微镜观察及RT-PCR检测其在3T3-L1细胞中的表达及下游基因的变化.结果：成功地构建了pEGFP-C3-insig 2融合基因的真核表达载体, 荧光显微镜观察到pEGFP-C3-insig 2融合蛋白在转染的3T3-L1细胞胞质中的表达, insig 2基因的转录明显上调.转染后24 h、 72 h较0 h AP 2 mRNA和脂联素mRNA的转录水平明显下调.结论：构建了insig 2基因的真核表达质粒, 在转染的3T3-L1细胞中insig 2的过表达可能影响该细胞的脂肪代谢.     

人细胞间黏附分子-1表达载体的构建及在真核细胞的表达

目的：构建人细胞间黏附分子-1真核表达载体pcDNA3.1（-）-ICAM-1，在真核细胞中表达人细胞间黏附分子-1。方法：设计特异性引物，利用PCR技术扩增出ICAM-1全编码区基因片段，插入到真核表达载体pcDNA3.1（-）中，重组质粒pCDA3.1（-）-ICAM-1用脂质体转染法转染哺乳动物细胞，以间接免疫荧光(IFA)和Western blot分析蛋白质的的表达。结果：PCR扩增得到人成熟ICAM-1的cDNA片段大小为1800bp, 重组子经酶切鉴定和DNA序列分析得到真核表达载体pCDA3.1（-）-ICAM-1。结论：成功构建了人ICAM-1真核表达载体，ICAM-1高效表达在转染的哺乳动物COS-7细胞表面，为进一步建立稳定表达ICAM-1的COS-7细胞株以及研究ICAM-1及其受体的生物学功能提供了条件。     

人MUC1与GM-CSF基因融合真核表达质粒的构建与表达

目的：构建人MUC1重复序列串联体基因与GM-CSF基因重组的真核共表达质粒pcDNA3.1（＋）-MUC1-GM-CSF,并观察重组质粒在COS-7细胞中的表达。方法：将信号肽及编码MUC1基因片段合成、合成的片段经退火等方法获得MUC1基因重复序列串联体,酶切鉴定及序列分析后,与GM-CSF基因克隆入pcDNA3.1（＋）真核表达载体中,构建真核共表达质粒pcDNA3.1（＋）-MUC1-GM-CSF。以重组质粒转染COS-7细胞,通过间接免疫荧光法及ELISA检测目的基因的表达。结果：酶切鉴定及序列分析表明,重组质粒含有人MUC1重复序列串联体与GM-CSF的融合基因,在COS-7细胞中可检测到MUC1表达,重组质粒免疫小鼠可诱导产生抗GM-CSF抗体。结论：人MUC1重复序列串联体与GM-CSF基因重组的真核共表达质粒的成功构建,为对其免疫原性、生物学特性及免疫治疗的进一步研究奠定了基础。     

转位肽/粒酶B融合蛋白基因的构建、表达及对细胞生长的抑制作用

目的：研究转位肽／粒酶B融合蛋白对细胞生长的抑制作用。方法：采用重组PCR法，将绿脓杆菌外毒素(PE)部分转位肽编码序列与活性型粒酶B(GrBa)基因相融合，构建PE Ⅱ-GrBa融合蛋白基因，以粒酶活性中心丝氨酸突变的PE Ⅱ—mGrBa作为阴性对照。将所获重组基因克隆入真核表达载体pcDNA3和pIRES2-EGFP中，以脂质体法瞬时转染Hela等细胞系，通过与GFP共表达，用MTT比色、TUNEL及间接免疫荧光染色，检测PE Ⅱ—GrBa基因的表达对转染细胞的形态和生长的影响。结果：表达PE Ⅱ—GrBa融合蛋白的细胞的细胞骨架发生异常，细胞生长受到抑制，部分细胞呈现凋亡特征。结论：PE Ⅱ—GrBa融合蛋白的表达可抑制细胞生长。     

人ISG20基因的克隆、真核表达及其抗HBV效应的初步研究

目的：克隆、体外真核表达ISG20基因并研究其抗乙肝病毒效应。方法：应用RT—PCR的方法从Hela细胞中扩增ISG20基因，构建HA—ISG20融合蛋白真核表达载体（pHA—ISG20），分别转染HepG2和HepG2．2．15细胞。Western blot检测HA—ISG20融合蛋白在HepG2细胞中的表达；ELISA方法检测转染和未转染pHA—ISG20的HepG2．2．15细胞中HBs抗原和HBe抗原的表达情况。结果：①克隆了ISG20基因，经测序与Genebank公布序列一致；②HA—ISG20融合蛋白真核表达载体经转染可在HepG2细胞中瞬时表达；③HA—ISG20融合蛋白可抑制HepG2．2．15细胞中HBs抗原和HBe抗原的表达。结论：初步证实ISG20蛋白产物可能具有抗HBV的效应。     

抗CD3 scFv基因的真核表达及其生物学活性鉴定

目的：真核表达抗CD3单链抗体(scFv)，并研究其生物学活性。方法：将编码抗CD3 scFv的DNA片段插入真核表达载体pDisplay中。对所构建重组表达载体进行测序确认后，以电穿孔法将重组质粒导入Hela细胞，以原位杂交法检测抗CD3 scFv的表达，以3H TdR掺入法检测其在体外对T细胞的活化作用，以MTT比色法观察转染的。Hela细胞与T细胞混合培养后，诱发的细胞毒性T细胞的杀伤作用。结果：成功地构建了抗CD3 scFv的真核表达载体，并在Hela细胞中获得表达。所分泌的抗CD3 scFv在抗CD28mAb存在的条件下，能够刺激T细胞活化。将转染的Hela细胞与T细胞混合培养能够诱发CTL的杀伤作用。结论：真核表达的抗CD3 scFv具有刺激T细胞活化的活性，可用于构建对肿瘤进行免疫治疗的双功能分子。     

CD80-IgG1 Fc段融合蛋白真核表达载体的构建及表达

目的：构建人CD80-IgG1 Fc段融合蛋白的真核表达载体CD80-IgG1 Fc／pcDNA3．1（＋），并住CHO细胞中进行表达。方法：应用T—A克降技术和亚克降技术，构建人CD80膜外段-IgG1 Fc段融合蛋白的真核表达载体CD80-IgG1 Fc／pcDNA3．1（＋），并将其转染人CHO细胞株并筛选，进行稳定表达：通过Western blot及ELISA法，检测融合蛋白的表达。结果：成功地构建了真核表达载体CD80-IgG1 Fc／pcDNA3．1（＋），并建立CHO细胞稳定表达株。Western blot及ELISA法检测到细胞培养上清中有融合蛋白的表达。结论：成功地构建了人CD80膜外段-IgGI Fc段融合蛋白的真核表达载体CD80-IgGI Fc／pcDNA3．1（＋），并在CHO细胞中稳定表达，为下一步抗肿瘤的研究奠定了基础。     

转染PF4 cDNA的GRC-1细胞培养液对于ECV-304细胞生长及VEGF表达的影响

目的：构建真核表达载体pcDNA3-PF4-SS，检测稳定转染后的GRC-1细胞的培养上清对于血管内皮细胞ECV304的生长以及转染细胞中血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响。方法：构建真核表达载体pcDNA3-PF4-SS，并经Bgl Ⅱ／Bam HI双酶切鉴定.通过脂质体介导，以该载体稳定转染GRC-1细胞，转染细胞中VEGF因子的表达情况用免疫组化染色法检测，转染细胞的培养上清对于ECV304细胞生长的影响用MTT法检测。结果：经Bgl Ⅱ／BamH I双酶切证实，hPF4 cD—NA已成功地克隆到真核表达载体pcDNA3-CD34-SS中。RT—PCR法检测证实，hPF4 cDNA已成功地转染GRC-1细胞。免疫组化染色检测显示，转染PF4基因的GRC—1细胞的胞浆及胞膜均有VEGF表达，但较转染前明显减弱。细胞计数及MTT法显示，转染后GRC-1细胞的培养上清对ECV304细胞的生长具有抑制作用，吸光度值(A)明显降低。结论：构建了真核表达载体pcDNA3-PF4-SS，并稳定转染GRC-1细胞。转染细胞的培养上清对ECV304细胞的生长及VEGF的表达，均具有明显的抑制作用，为探讨抗肿瘤生长机制和肿瘤疫苗的研制奠定了一定的基础。     

单纯疱疹病毒Ⅱ型潜伏相关转录体真核表达载体的构建及表达

背景：单纯疱疹病毒Ⅱ型潜伏相关转录体开放读码框1真核表达载体的构建可以为研究单纯疱疹病毒Ⅱ型潜伏相关转录体开放读码框1在病毒潜伏复发中的功能奠定基础。 目的：构建含存单纯疱疹病毒Ⅱ型潜伏相关转录体开放读码框1的真核表达载体,并通过转染非洲绿猴肾细胞(Vero),验证载体的体外表达情况。 方法：根据单纯疱疹病毒Ⅱ型潜伏相关转录体开放读码框1基因序列设计一对引物,以单纯疱疹病毒Ⅱ型 333标准株基因组为模板PCR法扩增出开放读码框1基因,克隆至真核表达载体上,并进行酶切鉴定以及测序;利用X-fect转染试剂盒将重组质粒pEGFP-C2/潜伏相关转录体开放读码框1转染vero细胞,RT-PCR检测其mRNA水平的表达,并用荧光倒置显微镜观察融合蛋白的表达。 结果与结论：开放读码框1基因的体外扩增目的片段为741 bp,所构建的真核表达载体pEGFP-C2/潜伏相关转录体开放读码框1经双酶切鉴定,与预期大小一致,测序结果与NCBI收录的开放读码框1基因序列一致;重组质粒pEGFP-C2/潜伏相关转录体开放读码框1转染vero细胞后,RT-PCR 验证有目的基因的转录,荧光显微镜观察到融合蛋白在转染的Vero细胞中表达。表明成功构建pEGFP-C2/潜伏相关转录体开放读码框1真核表达载体,并且实现其在非洲绿猴肾细胞(Vero)中的表达。