食品微生物检测中PCR技术的应用

食品微生物检测是检验食品中微生物的种类、数量、性质及其对人们健康的影响,以判别食品是否符合质量标准的检测方法。传统微生物检测方法（如培养法、显微镜观察法等）虽然准确性较强,但常因耗时长、操作繁琐而难以满足迅速反应的需求。本文基于PCR技术的原理与优势,选取大肠埃希氏菌检测、沙门氏菌检测、金黄色葡萄球菌检测以及非致病菌检测,分析PCR技术的实际应用流程及应用效果,以期为PCR技术的高效应用提供参考借鉴。     

4种致泻大肠埃希氏菌数字PCR检测方法的建立

针对常见致泻大肠埃希氏菌特征基因stx2、escV、lt、pic,研究建立了一套微滴数字PCR(ddPCR)方法。优化了引物探针浓度,退火温度等条件,考察了方法特异性、线性范围、精密度。结果表明,特征基因stx2在2.0～24506.67个拷贝,escV在8.8～24756.67个拷贝,lt在1.63～19990.00个拷贝,pic在1.63～26500.00个拷贝均呈线性关系,线性系数均大于0.99;确定了各基因的定量限(stx2、esc V、lt、pic分别为21个拷贝、20.60个拷贝、21.67个拷贝、27.67个拷贝);方法精密度小于10%,特异性良好。采用该方法对实际样品进行检测,结果显示,加标样品显示有阳性微滴,而其余样品均未检出阳性微滴,表明建立的数字PCR方法可用于食品中致泻大肠埃希氏菌的检测。该方法可为监管部门对生产牛肉制品、即食生肉制品、生食果蔬制品等重点企业生产环境卫生的检查提供技术支撑,有利于提高我国食品生产中原料、环境及加工过程的卫生水平,防止微生物污染和交叉污染,为食品生产全链条进行食品安全风险防范提供有力保障。     

单核细胞增生李斯特氏菌的PCR检测方法

研究比较了裂解法、热煮沸法、试验盒法提取单增李斯特氏菌DNA的效果 ,认为Promega试剂盒法提取的DNA ,得率高、纯度好。同时根据单增李斯特氏菌的毒力相关基因的 5对引物 ,进行了引物的特异性研究 ,结果发现inlA引物、inlB引物、plcA引物特异性好 ,可以用于食品中单增李斯特氏菌的检测     

Taqman荧光实时PCR快速检测原料乳中EPEC

建立可对原料乳中肠致病性大肠埃希氏菌(enteropathogenic Escherichia coli,EPEC)进行快速检测的Taqman光实时PCR方法.以eae致病基因为靶基因,用特异性引物和Taqman探针进行实时PCR扩增,研究反应的特异性和检测限,并用所建立的方法对16份市售原料乳进行EPEC检测.结果表明,所用引物和探针可高效扩增出目的片段,与原料乳中其他常见致病菌无交叉反应,经2 h增菌后检测限为8.8 mL-1.对16份市售原料乳样品,检出2份含有EPEC,血清型分别为O111:K58(B4)和O127a:K63(B18).全部检测过程只需5h,可用于原料乳中EPEC的快速检测和污染调查.     

不对称PCR技术结合免疫层析法快速检测产志贺毒素大肠埃希氏菌

产志贺毒素大肠埃希氏菌(Shiga toxin-producing Escherichia coli,STEC)可分泌志贺毒素,致病性强,建立简便快速的STEC检测方法对控制食源性疾病的发生和蔓延极为重要.使用生物素标记STEC的标志性毒力基因stx1与stx2的下游引物进行不对称聚合酶链式反应,获得生物素化的目标单链...     

基于特征基因的不同类型致泻大肠埃希氏菌的分子鉴定

致泻大肠埃希氏菌是引起人体以腹泻症状为主的常见病原菌。将传统微生物学方法和分子鉴定方法相结合鉴定致泻大肠埃希氏菌。根据聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增和测序建立5种不同类型致泻大肠埃希氏菌的分子鉴定标准,并对试验过程进行安全性评价,最后通过检测鲜肉中肠道集聚性大肠埃希氏菌验证此方法的适用性。结果显示5种致泻大肠埃希氏菌标准菌株的特征基因都有明显的条带,且与该特征基因的产物条带大小一致。同时,胶回收测序的结果与特征基因的序列一致性为100%,可利用PCR和测序鉴定5种致泻大肠埃希氏菌;在安全性评价试验中,利用细菌裂解液进行涂板,培养后均未发现菌落生成,因此没有生物安全隐患;肉样中的检测结果显示,有astA基因的目的条带,且测序结果与此基因序列一致,说明此方法能够准确鉴定出鲜肉中肠道集聚性大肠埃希氏菌。成功建立5种不同类型大肠埃希氏菌的分子鉴定方法,评价试验过程的安全性,并准确鉴定出肉样中的肠道集聚性大肠埃希氏菌,为实验室相关标准的制定和修订提供理论依据和有益借鉴。     

5种食源性致病菌PCR检测方法的建立

目的建立食品中的沙门氏菌、副溶血性弧菌、大肠埃希氏菌O157:H7、金黄色葡萄球菌和单核细胞增生李斯特氏菌的PCR快速检测方法。方法以缓冲蛋白胨水为增菌培养基,采用直接提取法提取DNA并测定其核酸浓度。对PCR的退火温度、模板浓度进行优化,把5种目标菌分为两组进行检测分析,并进行特异性和灵敏度实验。结果 5种目标菌培养后均表现出良好的生长趋势。PCR扩增最佳退火温度为59℃, 5种目标菌的引物特异性好,方法的检测灵敏度高。沙门氏菌、副溶血性弧菌、大肠埃希氏菌O157:H7、金黄色葡萄球菌和单核细胞增生李斯特氏菌最低检出核酸浓度分别为0.0202、0.158、0.187、2.30和1.05μg/mL。结论该方法简便、快速、灵敏度高,能满足食品安全检测要求。     

6类致泻大肠埃希氏菌多重PCR检测体系的建

目的 构建食源性致泻大肠埃希氏菌高效、快速、特异性强的检验方法。方法 根据6类致泻大肠埃希菌11种毒力基因引物, 采用煮沸法制备细菌基因组DNA作为模板构建致泻大肠埃希氏菌单菌多重PCR检测体系; 采用试剂盒法制备细菌基因组DNA作为模板构建6类菌十重PCR检测体系, 对2种检测体系进行优化并对其进行特异性、重复性验证。结果 构建了6类致泻大肠埃希氏菌多重PCR检测体系, 包括单菌多重PCR、6类菌十重PCR检测体系。仅6类致泻大肠埃希氏菌阳性菌株有特异性条带产生; 不同类型致泻大肠埃希氏菌菌株均检出其特异性阳性条带, 该多重PCR检测方法重复性好, 稳定性强。结论 该方法可高效快速地确定待测样是否为大肠埃希氏菌及其致病型, 为食品中致泻大肠埃希氏菌的监控、预警及爆发引起食物中毒后溯源等提供参考。     

基于TaqMan探针荧光PCR检测致泻性大肠埃希氏菌

建立快速检测致泻性大肠埃希氏菌的(DEC)方法,根据DEC的uidA(GenBank:JQ068101.1)、bfpB(Sequence:NG_034726.1)、eaeA(GenBank:AJ579305.1)、LT(GenBank:M17873.1)、ST(GenBank:M18346.1)、Stx1(GenBan...     

荧光PCR法检测原料乳中大肠埃希氏菌喹诺酮类的耐药基因

目的 建立喹诺酮类抗生素主要耐药基因的TaqMan荧光PCR检测方法,为原料乳中耐药大肠埃希氏菌的监测提供技术方案。方法 利用Chelex 100法快速获取细菌基因组DNA,通过对aac(6’)-Ib-cr和qepA基因的序列分析,利用Primer Express 3.0软件设计特异性引物和探针,建立单重和双重TaqMan荧光PCR方法。通过耐药基因阳性菌株和原料乳中分离大肠埃希氏菌菌株,对方法进行评估。结果 以Chelex 100法快速提取耐药基因阳性菌株细菌基因组DNA为模板,建立的aac(6’)-Ib-cr和qepA基因的单重和双重荧光PCR反应均有特异性曲线扩增,方法灵敏度为菌液浓度10_^-4 CFU/mL。北京地区52份原料乳中共分离出32株大肠埃希氏菌,利用建立的双重荧光PCR方法检测aac(6’)-Ib-cr和qepA基因结果为阴性,和环丙沙星肉汤稀释法药敏结果一致。结论 本方法的建立为原料乳中大肠埃希氏菌常见喹诺酮类耐药基因的快速检测提供了新的技术手段。     

Quantitative Detection ofVibrio vulnificus in Shellfish by Competitive Polymerase Chain Reaction

Quantitative detection of V. vulnificus in shellfish via competitive PCR was herein developed. We designed a forward primer, a reverse primer and a hybrid forward primer based on the V. vulnificus specific hemolysin gene (vvh), which was used to amplify target DNA and an internal competitive PCR standard. The specificity of the primers for V. vulnificus was proven by gel electrophoresis. The detection sensitivity for V. vulnificus was 220 CFU per PCR reaction with cells from a pure culture and 270 CFU/g of tissue without enrichment. After 10 hours of enrichment at 37° C the minimum detection level was reduced to 7 CFU/g of tissue.     

Quantitative Detection ofVibrio vulnificus in Shellfish by Competitive Polymerase Chain Reaction

Quantitative detection of V. vulnificus in shellfish via competitive PCR was herein developed. We designed a forward primer, a reverse primer and a hybrid forward primer based on the V. vulnificus specific hemolysin gene (vvh), which was used to amplify target DNA and an internal competitive PCR standard. The specificity of the primers for V. vulnificus was proven by gel electrophoresis. The detection sensitivity for V. vulnificus was 220 CFU per PCR reaction with cells from a pure culture and 270 CFU/g of tissue without enrichment. After 10 hours of enrichment at 37° C the minimum detection level was reduced to 7 CFU/g of tissue.     

聚合酶链式反应快速检测畜肉食品中鸭源性成分

目的：建立一种快速、特异、灵敏的鸭源性成分检测方法。方法：以鸭细胞色素C氧化酶Ⅲ（COⅢ ）基因序列为靶位点设计引物,进行聚合酶链式反应扩增,建立鸭源性成分检测方法;以常见畜禽肉,包括羊肉、牛肉、鸡肉、鹅肉、猪肉、兔肉、马肉、鹿肉等参考动物物种进行特异性检测;以50 mg/kg羊肉DNA作为稀释液,对鸭肉DNA进行梯度稀释,检测灵敏度。结果：该方法能够有效的对鸭源性成分进行快速检测,具有较强的特异性,灵敏度较高（0.1 μg/kg）,且羊肉成分的存在对鸭肉灵敏度检测没有影响,可以快速、准确检测畜肉食品中掺杂的鸭源性成分。     

应用PCR技术检测猪肉中沙门氏菌的研究

用聚合酶链式反应(PCR)技术检测猪肉中沙门氏菌,对已知和未知被沙门氏菌污染的猪肉的培养物均能准确检测;取不同稀释度的样品进行PCR扩增,当DNA含量只有0.01pg时,还能扩增出条带,说明本方法对检测猪肉中沙门氏菌具有特异性高且灵敏、快速等特点,适用于快速、准确地检测猪肉中沙门氏菌的需要。     

乳粉中阪琦肠杆菌的PCR检测

针对我国食品进出口和生产卫生的需要,使用以16 S rRNA基因为靶序列设计合成了一对可扩增282 bp的目的片段的引物,建立了检测阪琦肠杆菌的PCR方法.结果表明,阪琦肠杆菌PCR产物有282 bp的特异性片段,而金黄色葡萄球菌无此目的条带,证实该引物具有特异性.该方法快速、可靠、灵敏,特异性强,可用于食品中阪琦肠杆菌的检测.     

聚合酶链反应检测食品中的沙门氏菌

参考沙门氏菌侵袭性基因invA的序列,设计合成一对引物扩增其中一段序列,建立了特异性检测沙门氏菌的PCR方法。引物两端分别加了Bam HI和EcoR I切点,扩增片段大小为300bp。对收集的50个血清型123株沙门氏菌及7种23株非沙门氏菌进行PCR检测,结果仅沙门氏菌有300bp的扩增产物,显示了很强的特异性,为下一步克隆而设计的两个酶切位点对引物的特异性没有影响。经琼脂糖凝胶电泳,PCR的检出极限是10pg染色体DNA和10~2 cfu的细菌。将扩增产物经slot—blot与辣根过氧化物酶(HRP)直接标记的invA基因探针杂交,经增强型化学发光反应(ECL)及化学发光自显影(CPD)检测,可提高检测的敏感性一个数量级,同时增加了特异性。为推广应用,本文试验了8种模拟食品样品对PCR反应的影响,结果除奶酪外,其余都得到较好扩增。对120份污水及食品样品进行检测,该检测系统检出70份阳性结果,检出率高于常规分离。初步应用显示,PCR检测方法敏感、特异、简便、快速,适合于食品卫生检验和临床标本检验的现场应用。     

顶空固相微萃取/气质联用(HS-SPME/GC-MS)对奶牛大肠杆菌性乳腺炎诊断方法的建立

采用50/30 um DVB/CAR/PDMS(二乙基苯/碳分子筛/聚二甲基硅氧烷)萃取头,萃取条件:45℃加热10 min,吸附20 min,解吸附5 min;进样口温度270℃,分流比10∶1,载气为氦气,流速1 mL/min,色谱柱Thermo(30 m×0.25 mm×0.25μm),升温程序:40℃保持3 min,5℃/min升到150℃,10℃/min升到250℃,保持5 min,整个程序40 min。质谱条件:EI离子源,离子源温度:280℃,传输线温度:280℃,扫描质量范围:45~500 amu的检测条件,通过应用顶空固相微萃取/气质联用(HS-SPME/GC-MS)技术,对大肠杆菌污染鲜牛奶与空白组进行对照试验,结果表明:大肠杆菌污染鲜牛奶特征性的挥发性代谢产物为乙醇、乙酸、正辛酸、正癸酸、苯并噻唑,为奶牛大肠杆菌性乳房炎早期诊断方法的建立提供理论基础。     

肉中单核细胞增生李斯特菌PCR快速检测方法建立

目的:建立单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes,LM)快速、敏感、特异的PCR诊断方法。方法:采用聚合酶链式反应技术(PCR)特异性扩增单核细胞增生李斯特菌内化素基因(ivlA),并评价该方法的特异性与敏感性。结果:在445bp处出现inlA基因的目的片断,只有单增李斯特菌的目的片段获得扩增,其他菌种扩增均呈阴性;该方法可以检测到DNA的检测限。结论:PCR方法比传统细菌检测方法更特异、快速、灵敏和简便;为肉中单增李斯特菌的快速检测提供了新的手段。     

利用PCR方法检测转BT基因水稻

应用PCR技术进行转基因水稻检测研究。本文以转基因水稻为材料，以聚合酶链式反应（PCR）方法为基础，选择适用于转基因食品安全性检验的核酸检测技术，针对转基因水稻中普遍存在的花椰菜花叶病毒（CaMV35S）启动子、胭脂碱合成酶（NOS）终止子、和转入苏云金杆菌（Bacillus thuringiensis，简写为Bt）基因水稻的CrylAc片段进行PCR检测，建立适合转BT基因水稻的检测方法。该方法简便快速、检测结果与标准及其他文献资料相符。