类芽孢杆菌Bg1抗真菌蛋白的分离及其特性分析

为了明确类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)Bg1的主要抗真菌物质及其特性,本文利用抑菌圈法测定了Bg1抗菌蛋白在各种处理条件下抑菌活性的稳定性;通过60%硫酸铵沉淀、DEAE-Sephadex A50离子交换层析及Sephadex G100凝胶过滤层析进行了抗菌蛋白的分离纯化,以SDS-PAGE进行了其纯度检测。结果表明,28~100℃处理30 min、4℃存放55 d及在pH值3~7范围内菌株Bg1抗菌蛋白抑菌活性均无显著性变化,但pH值!8显著影响其抑菌活性,蛋白酶处理则使其抑菌活性完全丧失;纯化后所得抗菌蛋白分子量约10 KD。据此可知,类芽孢杆菌Bg1主要抗菌活性物质为低分子量蛋白,其对热和酸性条件及贮存时间稳定性好,具有进一步开发应用的潜能。     

枯草芽孢杆菌产芽孢条件的优化

为了提高枯草芽孢杆菌的芽孢数量及产芽孢率,采用分批培养法研究了营养条件、初始pH值、溶氧量对其生孢的影响。结果表明,麸皮和玉米粉分别是枯草芽孢杆菌生孢的最佳碳、氮源;无机盐和锰元素对芽孢生成有显著的影响。最佳生孢培养基组成:麸皮5 g,玉米粉10 g,NaCl 5 g,KH2PO41 g,MnSO4.H2O 0.4 g,水1 000 mL;最佳生孢条件:初始pH值为7.0,最佳装液量为250 mL锥形瓶装50 mL培养液。在150 r.min-1、30℃恒温培养72 h后,芽孢数可达到3.4×109cfu.mL-1,产芽孢率可达82.9%。     

脱酚棉籽蛋白培养腐熟用枯草芽孢杆菌DK36的研究

以脱酚棉籽蛋白为氮源,研究了腐熟用枯草芽孢杆菌DK36的生长及产芽孢条件。结果发现,当脱酚棉籽蛋白为氮源时,菌体生长良好,可完全代替豆饼粉,甚至代替酵母粉。当葡萄糖为碳源时,枯草芽孢杆菌DK36不形成芽孢。当玉米粉作碳源时,枯草芽孢杆菌DK36可大量形成芽孢,其芽孢数和芽孢率分别达到2.7×109CFU/m L和93.4%。培养基中添加钙、镁、锰和钾盐时芽孢数和芽孢率均明显提高,而且钾盐与钙、镁和锰盐在促进生长和产芽孢上具有协同作用,其中协同效果最好的组合是KH2PO4与Mg SO4,其芽孢数和芽孢率分别为3.2×109CFU/m L和98.4%。然而,脱酚棉籽蛋白会造成芽孢形成缓慢,生产效率降低。     

枯草芽孢杆菌与巨大芽孢杆菌对土壤有效态Cd的影响研究

将枯草芽孢杆菌和巨大芽孢杆菌接种于Cd污染土壤中,研究了短期与长期恒温培养条件下枯草芽孢杆菌和巨大芽孢杆菌对土壤有效态Cd含量的影响。短期试验结果表明,枯草芽孢杆菌可降低土壤有效态Cd含量的5.07%~42.63%,在培养72h时,接种25ml枯草芽孢杆菌处理的有效态Cd含量较对照组显著降低了42.63%;巨大芽孢杆菌可活化土壤中的Cd,在培养48h时,接种5ml巨大芽孢杆菌的处理土壤有效态Cd含量较对照组显著增加了24.58%。长期培养试验结果表明,接种枯草芽孢杆菌可降低土壤中有效态Cd含量,且随着培养时间的延长,钝化效果更为显著,有效态Cd的含量与土壤pH值呈现显著负相关关系,r=-0.325(P0.05);长期培养条件下,接种巨大芽孢杆菌可降低土壤pH,且在培养30d时接种5ml巨大芽孢杆菌显著增加了土壤有效态Cd含量。综上所述,枯草芽孢杆菌可以钝化土壤Cd,而巨大芽孢杆菌对土壤Cd有一定的活化作用。     

蜡质芽孢杆菌超氧化物歧化酶(SOD)的纯化研究

蜡质芽孢杆菌经培养后,离心收集菌体,将菌体破碎,离心,经（ＮＨ４）２ＳＯ４分级沉淀,Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－７５凝胶过滤和ＤＥＡＥ－５２柱层析所获得的超氧化物歧化酶进行了ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳为一条带,亚基分子量为１７７８３Ｄ,表明制备得到了电泳纯品。将该样品经氰化钾,双氧水,氯仿－乙醇抑制实验和特征吸收光谱分析,鉴定出此酶为Ｆｅ－ＳＯＤ,比活为：１７５３．８ｕ。     

枯草芽孢杆菌sacB基因的功能验证及应用

本研究将枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)基因组DNA中克隆的1.4 kbsacB基因片段连接到表达载体pET-28a(+),构建了sacB基因表达载体pSacB。通过测定蔗糖水解产生的葡萄糖具有的还原性,确定sacB基因产物具有蔗糖果聚糖酶活性。该基因表达后,导致大肠杆菌(Escherichia coli)细胞不能在含5%蔗糖的培养基中生存。同时发现sacB基因也能赋予耐辐射菌株Deinococcussp.BR501蔗糖敏感性。利用条件致死sacB基因的这一特性,我们分析了D.sp.BR501的突变率,结果表明DNA错配修复缺失突变株(ΔmutS1)的突变频率明显高于野生型。因此枯草芽孢杆菌sacB基因可作为验证DNA损伤修复能力的一种筛选标记。     

海洋枯草芽孢杆菌UMBR1027产抑金黄色葡萄球菌活性蛋白分离鉴定及发酵条件优化

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是一种能引起严重传染性疾病的人兽共患病原菌,由于其严重的致病性及其易产生耐药性的特点,使得探索新的具有活性的药物的需求越发迫切.为了研究对S.autrgus有抑制作用的活性蛋白,本实验采用硫酸铵沉淀法对海洋枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)UMBR1027产抑S.aureus活性蛋白进行提取,并利用葡聚糖凝胶SephadexLH-20柱层析、十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)凝胶电泳进行分离、ABI 4800 plus MALDI-TOF进行鉴定;为了提高活性蛋白在B.subtilis UMBR1027发酵过程中的产量实验采用滤纸片扩散法,以抑菌圈直径为指标,分别从培养基pH、培养基的盐度以及培养温度这3个关键因素对B.subtilis UMBR1027产抑S.aureus活性蛋白的影响进行考察,并设计Box-Behnken实验以优化其发酵条件.结果显示活性蛋白主要含有碱性丝氨酸蛋白酶、α-淀粉酶、枯草杆菌蛋白酶和内切-β-1,3-1,4葡聚糖酶,优化实验得出B.subtilis UMBR1027产活性蛋白的最佳发酵条件组合为培养基pH为6.95、培养基盐度为10.38％、发酵培养温度为34.95℃;拟合实验中选取发酵培养基pH为6.95,发酵培养基盐度为10.38％,发酵温度为35℃进行验证,抑菌圈直径为20.4 mm,与理论值基本吻合.本研究对B.subtilis UMBR1027所产抗菌粗蛋白进行了分离,并成功对抗菌粗蛋白分离纯化后的各个部分进行了鉴定.响应曲面法有效提高了B.subtilis UMBR1027产抑制S.aureus的抗菌蛋白类物质,此研究为探索来自海洋的活性抗菌蛋白类天然药物分子提供了理论依据.     

枯草芽孢杆菌B11基因文库的构建及与拮抗物质的生物合成相关基因的克隆

枯草芽孢杆菌菌株B 11对广泛的植物病原真菌和细菌都具有拮抗作用。以柯斯质粒pW EB∷TNC为载体构建了枯草芽孢杆菌菌株B 11的基因文库,文库含9 000个克隆。文库克隆中插入的DNA片段平均为42.1 kb,该文库含有菌株B 11基因组中任一基因的概率为99.99%。采用平板活性检测法筛选文库,筛选到1个对茄青枯假单胞菌菌株P 13具有拮抗活性的文库克隆GXN 9527,该克隆的重组质粒pGXN 9527含有50 kb的菌株B 11的DNA。文库克隆对革兰氏阴性植物病原细菌如水稻黄单胞菌水稻变种也具有拮抗活性,而对革兰氏阳性细菌如地衣芽孢杆菌和植物病原真菌如尖孢镰刀菌西瓜专化型、立枯丝核菌、水稻稻灰梨孢菌则没有拮抗活性。分别含有pGXN 9527的18、12、9、8 kb B amHⅠ片段的亚克隆对P 13均没有拮抗活性,说明编码该拮抗物质的生物合成基因很可能成簇存在。     

枯草芽孢杆菌KD03液态菌剂的保存方法研究

保质期短是限制液态微生物菌剂在农业生产上广泛应用的主要因素。枯草芽孢杆菌KD03是一株具有良好抗黄瓜枯萎病的生防菌。为了提高KD03液态菌剂的菌体存活率、延长保质期,采用单因素试验研究了添加防腐剂、碳氮源、醇类物质以及菌剂pH值对菌体存活率的影响,在此基础上采用正交试验设计优化菌剂的保存条件。试验结果表明:KD03液态菌剂中添加防腐剂(山梨酸钾和苯甲酸钠)、碳源(葡萄糖)、氮源(酵母浸粉)、醇类物质(甘油和聚乙二醇)均可显著提高KD03的存活率。菌剂pH值为7.0或为接近7.0的弱酸性时,KD03菌体存活率高。KD03液态菌剂的最佳保存条件为:山梨酸钾1.0 g/L、甘油0.5 g/L、葡萄糖3.0 g/L,菌剂pH值自然(pH值6.7)。在此条件下,KD03液态菌剂室温保存6个月后,菌剂活菌数为3.98×109 CFU/mL,菌体存活率为82.2%。     

枯草芽孢杆菌对盐碱土面蒸发及水盐分布的影响

基于室内模拟土面蒸发试验和土壤持水性能试验,设置5种不同含量枯草芽孢杆菌(0,1,3,5,7g/kg)处理,研究不同含量枯草芽孢杆菌对盐碱土面蒸发及水盐分布的影响。结果表明:(1)施加枯草芽孢杆菌后,土壤累积蒸发量、蒸发速率均显著降低,在蒸发开始后2天,枯草芽孢杆菌的保水性能显现,枯草芽孢杆菌含量为0,1,3,5,7g/kg的累积蒸发量和蒸发速率均小于0g/kg,在3g/kg时累积蒸发量和蒸发速率最小,蒸发后41天,处理为1,3,5,7g/kg累积蒸发量较0g/kg分别减少了16.63%,21.39%,11.26%,5.96%,且不同处理间差异极显著(P0.05)。(2)枯草芽孢杆菌同样影响Black和Rose蒸发模型,对于Black蒸发模型,随着枯草芽孢杆菌含量的增大,蒸发参数B呈现先减后增的趋势,与0g/kg相比较为显著(P0.05);对于Rose蒸发模型,随着枯草芽孢杆菌含量的增大,稳定蒸发参数C和水分扩散参数D均呈现先减少后增大的趋势,其中在含量为3g/kg时取得最小值,并且各处理差异性较为显著。(3)枯草芽孢杆菌能增加土壤的保水性能,在6cm深度处,施加量为1,3,5,7g/kg相比0g/kg的剖面含水量分别增加了28.24%,37.40%,20.00%,6.87%。(4)枯草芽孢杆菌的添加使土壤的含盐量显著减少,枯草芽孢杆菌施加量为1,3,5,7g/kg相比0g/kg的处理分别降低了32.26%,46.89%,26.34%,14.65%。(5)当枯草芽孢杆菌含量为3g/kg时,van Genuchten公式中土壤的滞留含水率θr、饱和含水率θs和与进气值有关的参数α最大,形状系数n最小,且各处理差异显著。综上,在盐碱土中施加3g/kg的枯草芽孢杆菌,可使盐碱土壤抑盐,提高土壤的持水性能。     

超声辅助竹节虾头酶解及抗氧化肽分离研究

为了实现竹节虾加工副产物的高值化利用,以竹节虾加工废弃物中的虾头副产物为原料,以水解度和DPPH清除率作为评价指标,采用中性蛋白酶酶解,通过响应面法优化超声辅助酶解工艺,并依次通过超滤、凝胶层析色谱和反相高效液相色谱等分离方法,从竹节虾虾头酶解产物中分离制备抗氧化肽,采用超高压液相色谱串联质谱联用技术对肽的结构进行表征。结果表明,在中性蛋白酶添加量为3 000 U·g~(-1)、p H值7.0条件下,最佳超声辅助酶解工艺参数为超声时间41 min,超声温度55℃,超声频率22 k Hz,料液比1∶9(w/v),在此条件下获得的酶解产物DPPH清除率达69.50%。当水解时间为0.5~2.5 h时,超声辅助酶解的酶解产物水解度和DPPH清除率比非超声辅助酶解工艺分别高17.95%和18.83%,该工艺缩短了酶解时间,节约了能耗。酶解产物经超滤初步分离发现,相对分子质量在3k Da(SHP4)的组分具有显著的抗氧化活性。用凝胶层析法进一步分离纯化SHP4组分后得到4个峰,其中SHP4-II的DPPH清除率最高;SHP4-II通过反相高效液相纯化后也得到4个主要肽峰,在多肽含量为1.5 mg·m L~(-1)时,SHP4-II-4的DPPH清除率最高,达到85.69%,并且具有较好的分离度,质谱分析发现,该抗氧化肽的结构为Gly-Asn-Gly-Leu-Pro(455.99 Da)。本研究结果为虾肽抗氧化保健食品的研发提供了一定的科学依据。     

Synergistic effect of arbuscular mycorrhizal fungi and Bacillus subtilis on the biomass and essential oil yield of rose-scented geranium (Pelargonium graveolens)

Four different arbuscular mycorrhizal (AM) fungi, Glomus aggregatum, Glomus fasciculatum, Glomus intraradices and Glomus mosseae, were used alone and in combinations with Bacillus subtilis to evaluate their capability to increase the productivity of geranium. Mycorrhizal treatment increased the growth and total biomass invariably over non-mycorrhizal control plants. In AM alone treatment, the best result was obtained for G. mosseae treatment, where 380.9 and 335.3 g fresh herb yield per pot was recorded in 2005–2006 and 2006–2007, respectively, an increase of 75.3 and 85.9% over controls. Plants inoculated with B. subtilis alone yielded 287.8 and 252.3 g fresh herb, an increase of 32.4 and 39.9% over uninoculated controls. However, B. subtilis in combination with G. mosseae produced the highest herb yield, i.e. 410.8 and 347.8 g herbs pot^?1, an increase of 89.4 and 92.9% over untreated controls. The field experimental data validated the results of the pot experiment. Treatment with G. mosseae alone increased herb yield by 49.4%, whereas in combination with B. subtilis, it increased herb yield by 59.5%. Treatment with AM fungi and B. subtilis did not affect the essential oil content of the plant, but total oil yield was significantly increased because of the increase in biomass production.