胃癌及癌前病变组织中hMLH1基因启动子甲基化与MSI的关系

目的研究散发性胃癌中hMLH1基因启动子区5′端CpG岛甲基化、微卫星不稳定性（MSI）发生的情况及两者之间的关系，探讨胃癌发生的分子机制。方法采用PCR扩增-聚丙烯酰胺凝胶电泳-硝酸银染法检测（BAT25、BAT26、BAT40、D2S123、D5S346）5个位点的MSI，甲基化特异性-PCR（MSP）检测hMLH1甲基化异常情况。结果30例胃癌标本中检出hMLH1甲基化8例．占26．7％；50例胃癌前病变中检出hMLH1甲基化9例．占18．0％；30例正常胃黏膜未见hMLH1甲基化。30例胃癌中微卫星高度不稳定（MSI-H）7例，均榆测到hMLH1甲基化（100．0％）；低度不稳定（MSI-L）1例，未检测到hMLH1甲基化；稳定（MSS）22例，hMLH1甲基化仅1例（4．5％）。微卫星不稳定的15例胃癌前病变组织中，hMI，H1甲基化8例（53．3％），而微卫星稳定35例胃癌前病变组织中，hMLH1甲基化仅1例（2．9%）。结论①胃癌中存在hMLH1基因启动子甲基化，hMLH1基因甲基化可能参与了胃癌的发生。②hMLH1基因启动子甲魅化在胃癌前病变阶段就已经存在，町能是胃癌发生的早期事件之一。③hMLH1基因甲基化和MSI密切相关，它是导致胃癌组织出现MSI的重要吲索，MSI在胃癌发生、发展过程中发挥一定作用。     

卵巢粘液性肿瘤hMLH1启动子甲基化及微卫星不稳定性

目的观察卵巢粘液性肿瘤中错配修复基因hMLH1启动子甲基化,及与微卫星不稳定性(MSI)间的关系。方法1995～2001年浙江大学医学院附属妇产科医院卵巢粘液性肿瘤组织块共107例(恶性49例,交界性35例和良性23例)。选取BAT-25、BAT-26、BAT-40、D5S346、D17S250和D2S1236个位点用PCR法进行MSI分析;限制性内切酶聚合酶链反应(PCR)法分析hMLH1启动子甲基化。结果良性、交界性和恶性肿瘤的hMLH1启动子甲基化阳性率分别为4.3%(1/23)、14.3%(5/35)和36.7%(18/49)。其中恶性组与交界性、良性组之间存在显著性差异(P=0.023和P=0.004),交界性和良性组之间无显著性差异(P=0.438);良性、交界性和恶性肿瘤的MSI表型阳性率分别为4.3%(1/23)、8.6%(3/35)和16.3%(8/49),有上升趋势,但无统计学意义;75%(9/12)MSI表型阳性的肿瘤存在hMLH1启动子甲基化,MSI表型阴性的肿瘤中84.2%(80/95)不存在hMLH1启动子甲基化,MSI表型阳性和hMLH1启动子甲基化之间显著相关(P=0.000),在恶性组和交界性组中两者均存在相关性(P=0.004,P=0.047)。结论卵巢粘液性肿瘤存在hMLH1启动子甲基化,且可能是造成MSI表型阳性的主要因素,两者可能在卵巢粘液性囊腺癌发生过程中起关键作用。     

散发性结直肠癌中hMLH1基因甲基化的实验研究

[目的]检测散发性结直肠癌患者hMLH1基因启动子区CpG岛甲基化状态,分析该基因甲基化与患者临床病理特征的相关性.[方法]采用重亚硫酸盐修饰测序法检测患者肿瘤组织和配对正常组织hMLH1基因甲基化状态,采用免疫组化方法检测其蛋白表达水平,并将甲基化状态与相应的蛋白表达水平及临床病理学资料进行统计学分析.[结果]正常组织的所有CpG位点均为非甲基化.肿瘤组织中CpG岛1(CGI-Ⅰ)甲基化阳性率为20%(6/30).hMLH1蛋白表达阳性率为50%(15/30).经X2检验,CGI-Ⅰ甲基化组与非甲基化组的hMLH1蛋白表达阴性率有显著性差异(P<0.05);低分化组的甲基化阳性率(100%)显著高于高中分化组(14.29%)(P<0.05).[结论]hMLH1基因启动子区CpG岛1甲基化可能导致hMLH1蛋白不表达;甲基化还与肿瘤的分化程度存在关联,提示甲基化还可作为结直肠癌预后的参考指标之一.     

应用二维DNA电泳检测大肠癌错配修复基因hMLH1突变

目的　探讨大肠癌错配修复基因hMLH1突变与微卫星不稳 (MSI)的关系。方法　采用二维DNA电泳和DNA测序技术检测hMLH1突变 ;采用PCR为基础的方法检测MSI。结果　 76例大肠癌中检出hMLH1基因突变 8例 ,突变率为 10 .5% ,检出MSI 2 0例 ,检出率为 2 6 .3%。右侧大肠癌hMLH1突变和MSI的检出率显著高于左侧大肠癌 (P <0 .0 5 ) ,hMLH1突变与肿瘤大小、分化程度、组织学类型、浸润深度、淋巴结转移和临床病理分期无显著相关。将MSI分为高频率MSI(MSI H ,≥ 2个位点 ) 10例、低频率MSI(MSI L ,仅为 1个位点 ) 10例和MSI阴性 (MSS) 5 6例 3组 ,8例hMLH1基因突变均发生于MSI H组 ,而MSI L和MSS组未见有突变者。结论　hMLH1基因突变与MSI多发生于右侧大肠癌 ,MSI的发生与hMLH1突变有关     

胃癌组织hMLH1和hMSH2基因启动子区甲基化状态研究

目的 探讨hMSH2基因启动子区的甲基化状态与微卫星DNA不稳的关系。方法 采用甲基化特异性PCR方法检测hMLH1和hMSH2基因启动子区的甲基化状态，采用PCR为基础的方法检测微卫星DNA不稳。结果 正常胃粘膜未见hMLH1和hMSH2基因启动子区的高甲基化。68例胃癌中检出hMLH1高甲基化11例，占16．2％，而且均为去甲基化和高基化并存，未见有hMSH2高甲基化者。将MSI分为高频率MSI（MSI－H，≥2个位点）8例、低频率MSI（MSI－L,仅为1个位点）9例和MSI阴性（MSS）51例3组，结果MSI－H组hMLH1高甲基化的检出率显著高于MSI－L和MSS组（P＜0．01）。结论 hMLH1高甲基化可能参与了MSI病理途径，而hMSH2甲基化状态可能与MSI途径无关。     

散发性大肠癌O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶基因启动子过甲基化状况及K-ras表达与临床病理特征相关性分析

目的 探讨散发性大肠癌中DNA修复酶O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(MGMT)的过甲基化状况、K-ras的表达及其相关性.方法 采用甲基化特异性PCR(MSP)及免疫组织化学的方法,检测130份病理证实的散发性大肠癌患者癌组织MGMT基因过甲基化状况、K-ras的表达及它们的相关性.结果 在130例散发性大肠癌组织中MGMT基因启动子甲基化率35%,K-ras的阳性表达率47%,呈正相关(r=0.765,P<0.01).在分化程度低、淋巴结转移、肥胖、P-TNM分期皿～Ⅳ期的患者中,MGMT基因过甲基化率较高,K-ras的阳性表达率亦高.另外K-ras的阳性表达在腺癌中高于非腺癌类型.结论 在散发性大肠癌中,MGMT基因启动子甲基化可能导致K-ras基因的激活,共同参与散发性大肠癌的发生、发展.     

散发性结直肠癌中CpG岛甲基化表型研究及其与微卫星不稳定的关系

目的 研究散发性结直肠癌(SCRC)中CpG岛甲基化表型(CIMP)阳性的发生率及其临床病理特征,并探讨其与微卫星不稳定(MSI)的关系.方法 采用甲基化特异性PCR(MSP)方法对91例散发性结直肠癌患者行P16、hMLH1、MINT1、MINT2和MINT31共5个基因启动子甲基化检测,分析散发性结直肠癌中CIMP阳性病例的临床病理特征.同时应用荧光标记多重PCR法扩增两个微卫星位点BAT25和BAT26,分析两个微卫星位点状况,探讨CIMP与MSI的关系.结果 91例散发性结直肠癌患者中共检出CIMP阳性者22例,阳性率为24.2％.CIMP阳性者与CIMP阴性者相比,前者好发于近端结肠(P=0.02)、分化程度上低分化癌多见(p=0.03)、组织学类型上黏液腺癌或印戒细胞多见(P=0.04).27.3％的CIMP阳性病例表现为MSI,54.5％的MSI病例表现为CIMP阳性(P=0.02).结论 CIMP的散发性结直肠癌具有好发于近端结肠、低分化癌及黏液腺癌或印戒细胞多见等特点,CIMP与MSI两者具有密切关系.     

基因hMSH2、hMLH1与p53突变型在散发性大肠癌患者的表达

目的:探讨错配修复基因hMSH2、hMLH1与p53突变型在散发性大肠癌发生中的作用。方法:用聚合酶链反应和单链DNA多态性分析(PCR-SSCP)对45例散发性大肠癌患者肿瘤组织及正常组织基因hMSH2、hMLH1、p53进行检测。结果:45例散发性大肠癌患者中,发生hMSH2、hMLH1、p53基因突变分别为2、6、22例,分别占4.44%、13.33%和48.89%。hMLH1、hMSH2基因在突变型p53患者中的突变率为27.27%明显高于在p53未发生突变的患者中的突变率8.69%(P<0.05)。结论:一定比例的散发性大肠癌患者中存在MMR基因缺陷,其中hMLH1所起的作用大于hMSH2,散发性大肠癌中MMR基因突变与p53突变密切相关。     

胶质瘤中MGMT和hMLH1甲基化与表达水平的变化及意义

目的探讨胶质瘤组织中,O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(O6-methylguanine DNA methyltransferase,MGMT)和错配修复基因mutLhomolog1(Homo sapiens,hMLH1)的甲基化及蛋白水平的变化,及其在胶质瘤发生中的作用。方法应用甲基化特异性PCR(methylation-specific PCR,MSP)方法检测了78例胶质瘤患者组织中MGMT和hMLH1的启动子区甲基化状态;应用免疫组织化学方法检测其蛋白表达水平。结果MGMT启动子区甲基化43例(55.1%),hMLH1启动子区甲基化32例(41.0%)。MGMT与hMLH1在胶质瘤中表达的阳性细胞百分比的中位数分别为15.9%和84.6%。两种基因的启动子区甲基化状态与蛋白表达的阳性率没有明显的相关性,且均与年龄、性别、病理类型无关。结论胶质瘤细胞中同属于DNA修复系统的MGMT蛋白表达率远低于hMLH1表达率,这提示胶质瘤发生发展过程中可能存在着与DNA修复系统紊乱有关的一些独特的路径。     

散发性结直肠癌中hMLH1基因启动子区CpG岛MVPs图谱的绘制与分析

目的 绘制散发性结直肠癌患者hMLH1基因启动子区CpG岛甲基化可变位点(methylation variable positions, MVPs)图谱,分析MVPs图谱与hMLH1蛋白表达的关系,寻找CpG岛中影响蛋白表达的关键CpG位点.方法 采用重亚硫酸盐测序方法检测患者hMLH1基因启动子区CpG岛甲基化状态;采用免疫组化方法检测相应蛋白表达水平.结果 CpG岛1(CGI-Ⅰ)甲基化阳性率为20 %(6/30);CpG岛2(CGI-Ⅱ)甲基化阳性率为13.33 %(4/30).hMLH1蛋白表达阳性率为50 %(15/30).经χ2检验,CGI-Ⅰ甲基化与hMLH1蛋白表达缺失存在显著性差异(P＜0.05)、CGI-Ⅱ甲基化与hMLH1蛋白表达缺失无差异(P＞0.05).结论 CGI-Ⅰ甲基化可能导致hMLH1蛋白不表达,其中1～28 CpG位点为导致hMLH1蛋白表达缺失的关键区域.     

卵巢粘液性肿瘤hMLHl启动子甲基化及微卫星不稳定性

目的 观察卵巢粘液性肿瘤中错配修复基因hMLH1启动子甲基化,及与微卫星不稳定性(MSI)间的关系。方法 1995～2001年浙江大学医学院附属妇产科医院卵巢粘液性肿瘤组织块共：107例(恶性49例,交界性35例和良性23例)。选取BAT-25、BAT-26、BAT-40、D5S346、D17S250和D2S123 6个位点用PCR法进行MSI分析;限制性内切酶聚合酶链反应(PCR)法分析hMLHl启动子甲基化。结果 良性、交界性和恶性肿瘤的hMLHl启动子甲基化阳性率分别为4．3％(1／23)、14．3％(5／35)和36．7％(18／49)。其中恶性组与交界性、良性组之间存在显著性差异(P=0．023和P=0．004),交界性和良性组之间无显著性差异(P=0．438);良性、交界性和恶性肿瘤的MSI表型阳性率分别为4．3％(1／23)、8．6％(3／35)和16．3％(8／49),有上升趋势,但无统计学意义;75％(9／12)MSI表型阳性的肿瘤存在hMLHl启动子甲基化,MSI表型阴性的肿瘤中84．2％(80／95)不存在hMLHl启动子甲基化,MSI表型阳性和hMLH1启动子甲基化之间显著相关(P=0．000),在恶性组和交界性组中两者均存在相关性(P=0．004,P=0．047)。结论 卵巢粘液性肿瘤存在hMLH1启动子甲基化,且可能是造成MSI表型阳性的主要因素,两者可能在卵巢粘液性囊腺癌发生过程中起关键作用。     

Infrequent microsatellite instability mutator phenotype in Chinese hepatocellular carcinomas

Objective: In order to elucidate the molecular mechanisms that might be responsible for hepatocarcinogenesis, we examined microsatellite instability (MSI), mismatch repair gene hMLH1 mutation and methylation in hepatocellular carcinoma. Methods: Fifty-two cases of surgically resected sporadic hepatocellular carcinoma (HCC) were studied, hMLH1 mutation was examined by two-dimensional electrophoresis and DNA sequencing; hMLH1 methylation was determined by methylation-specific PCR (MSP); and MSI at BAT26 was analyzed by PCR-based methods. Results: MSI at BAT26 was found in 3 of 52 cases (5.8%) of the tumors analyzed. No hMLH1 mutation or hypermethylation was found in these 52 cancerous tissues. No correlation existed between MSI and clinico-pathological characteristics of the patients. Conclusion: Our results suggest that MSI at BAT26 is rarely associated with carcinogenesis of chinese HCC. The genesis of sporadic HCC may occur in an alternative pathway that is probably different from MSI pathway.     

分泌型卷曲相关蛋白2基因超甲基化与大肠癌的研究

目的:研究分泌型卷曲相关蛋白2(SFRP2)基因启动子超甲基化与大肠癌的关系.方法:用甲基化荧光定量PCR(MethyLight)技术检测44例散发型大肠癌和20例癌旁组织中SFRP2基因的启动子甲基化状况,20例健康志愿者大肠组织作为对照组.同时分析SFRP2基因超甲基化与临床病理特征的关系.结果:44例大肠癌组织中检出SFRP2基因超甲基化36例(36/44,81.8%),20例大肠癌旁组织中检出SFRP2基因超甲基化8例(8/20,40%),20例正常大肠黏膜组织中没有显示SFRP2基因任何甲基化条带.大肠癌中SFRP2基因甲基化较正常黏膜和邻近的正常黏膜更频繁.并且SFRP2基因超甲基化与任何包括性别、年龄、肿瘤分期、位置、组织学分级等临床病理特征之间没有显著的关联.结论:SFRP2基因超甲基化与大肠癌的发生有关,SFRP2基因超甲基化可以作为大肠癌筛检的高潜力标记.     

MSI-H单发性肠癌中hMLHI基因启动区甲基化测定在癌症临床诊断和早期治疗中的作用和意义

目的探讨MSI，MMR和hMLHI基因启动区甲基化之间的关系以及可能存在的致癌机制。强调甲基化测定在癌症的早期诊断与跟踪治疗中所应引起的重视。方法详细阐述了从病人肿瘤组织样品中基因组DNA的粹取以及MSP的具体测定方法步骤，以及引物的选用。结果90％的MSI—H单发性肠癌病人存在着hMLHI基因启动区甲基化现象。结论在MSI—H型的单发性肠癌中，hMLHI基因启动区甲基化是造成MMR缺损的原因。在这个背景下，一个非遗传性的后生环境也许会导致在肿瘤中多种遗传性变化。该结论将为抗癌药物的设计提供重要信息。DNA甲基化测定是一个很有潜力的癌症生化诊断标志，它不但在临床诊断与跟踪治疗过程中发挥着作用，同时也将一步步揭示致癌的机制。     

DLEC1基因在结直肠癌中的甲基化水平及临床意义

目的 检测DLEC1 (deleted in lung and esophageal cancer 1) 基因在结直肠癌 (colorectal cancer, CRC) 患者组织和血清中的甲基化状态,分析其临床意义。方法 留取71例CRC患者癌组织、相应正常组织及术前血清标本,20例肠道良性病变及20例健康志愿者血清标本,甲基化特异性聚合酶链反应(MSP)检测DLEC1基因启动子区域甲基化情况。结果 71例CRC组织中,DLEC1基因启动子甲基化比例为45.1%(32/71),而正常组织为7.1%(4/56),差异有统计学意义(P<0.001);DLEC1基因启动子甲基化与患者临床病理特征及CEA、CA19-9水平之间无相关性。相应CRC血清DNA中DLEC1甲基化比例为39.4%(28/71),而对照组为2.5%(1/40),差异有统计学意义(P<0.001),且血清DNA甲基化状况与组织中具有良好的一致性。结论 DLEC1基因启动子甲基化在CRC患者中有着较高的检出率,可望成为CRC辅助诊断的新型分子标记。     

胃癌及癌旁组织多个肿瘤相关基因超甲基化

目的检测胃癌及癌旁组织肿瘤相关基因超甲基化状态,探讨多个肿瘤相关基因启动子超甲基化与胃癌发生的关系。方法应用甲基化特异性聚合酶链反应,检测23例手术切除的胃癌组织、癌旁组织和10例胃镜活检正常的胃黏膜组织的hMLH1、E-cadherin、GSTP1、p16和p15基因启动子区域的超甲基化状态。结果正常胃黏膜组织未检测到所选基因的超甲基化,22例(95.7%)胃癌组织和7例(30.4%)癌旁组织中检测到超甲基化。在17例(73.9%)胃癌组织和5例(21.7%)癌旁组织可以检测到2个以上基因的超甲基化;E-cadherin、p15和p16三个基因的甲基化率分别为78.3%、82.6%、60.8%,明显高于hMLH1和GSTP1的34.8%和17.4%。结论胃癌组织和邻近的癌旁组织中可以同时检测到多个肿瘤相关基因的甲基化,启动子区域超甲基化导致的基因功能失活可能发生在胃癌肿瘤形成的早期。     

乳腺癌组织与血清BRCA1基因异常甲基化的临床意义

目的:探讨乳腺癌BRCA1基因启动子异常甲基化状况及其在乳腺癌早期诊断中的价值。方法:用甲基化特异PCR方法对乳腺癌患者癌组织、癌旁组织及对应血浆进行BRCA1异常甲基化检测。结果:乳腺癌组织中BRCA1启动子异常甲基化检出频率为35/102(34%),血浆的检出率为32/102(32%),而癌旁组织中没有检出BRCA1异常甲基化。根据不同病理特征将35例散发性乳腺癌按组织类型、不同分级、有无淋巴结转移和年龄进行分类分析。结果显示,MSP法检测肿瘤组织与对应血浆BRCA1异常甲基化有很好的一致性(P>0.05)。102例患者的组织与血清中甲基化检出率的一致性良好(Kappa=0.765)。BRCA1基因甲基化结合病理特征表明,BRCA1基因在原位癌中甲基化检出率明显低于浸润性癌(P<0.05),有淋巴结转移相应标本BRCA1基因甲基化检出率也明显高于无淋巴结转移的标本(P<0.05),而BRCA1基因甲基化与否与肿瘤分级及年龄(绝经前后)无明显关联(P>0.05)。结论:BRCA1基因异常甲基化在乳腺癌组织与血清有相似的甲基化模式,且在乳腺癌的组织分型与转移方面有一定的鉴别诊断价值。