体外原代培养人视网膜色素上皮细胞

目的：探讨建立体外原代培养人类视网膜色素上皮细胞(RPE)技术。为研究溶血磷脂酸(lysophosphatidic acid，LPA)对培养的人类视网膜色素上皮细胞DNA合成与增殖的作用。方法：取自愿贡献的意外事故成年眼球，用2．5g／L胰酶消化获取人RPE细胞、150mL／L胎牛血清的DMEM培养液培养，细胞接近融合状态时进行传代培养。取自愿贡献的眼球并游离其视网膜色素上皮细胞，用DMEM加100mL／L血清及MEM氨基酸和庆大霉素，进行细胞传代培养。用溶血磷脂酸、转移因子β2(TGF—β2)及LPA TGF—β2进行视网膜色素上皮细胞增殖试验，用细胞染色法进行细胞计数，提取视网膜色素上皮细胞DNA，用Spectrophotometer进行DNA定量测定。结果：RPE原代细胞镜下为圆形，大小不一，内含较多的色素颗粒，胞核无法辨认。原代细胞培养贴壁后3d增殖速度明显加快，至4～5d即可基本融合，细胞浆内色素颗粒则随传代次数增多而逐渐减少。第3代培养的视网膜色素上皮细胞膜表面可见微绒毛，细胞质内细胞器丰富，线粒体量多，体积较小，内外膜分界清晰，嵴较短。色素颗粒散在分布于胞浆内，多数细胞质内数量较少呈高电子密度包含物。LPA对原代培养的视网膜色素上皮细胞增殖有促进作用。含有和／或缺乏10mL／L小牛血清的两种LPA(10μmol／L)均明显刺激视网膜色素上皮细胞增殖，但这种细胞的增殖被TGF-β2所抑制，LPA(10μmol／L)引起视网膜的色素上皮细胞DNA合成增加是正常对照组的两倍。     

人角膜内皮细胞的原代培养及形态学观察

人角膜内皮细胞体外培养的成功,为现代研究角膜内皮细胞的生物学、病理学以及内皮细胞移植等方面开拓了广阔的前景.近年来,我国在角膜内皮细胞培养方面已获得成功,并且在细胞培养技术方面有所改进,这些无疑将促进我国角膜病基础学研究的进展.我们在国内对人角膜内皮细胞体外原代培养成功的基础上,对其某些生物学特点进行观察研究,现将结果报告如下:     

大鼠视网膜神经元的原代培养方法

目的:探求视网膜神经元的最佳分离和培养方法,提高原代培养神经元的纯度及活性。方法:采用新生大鼠视网膜神经元,应用含100mL/L新生牛血清、100g/LF-12 Nutrient Mixtures的DMEM培养基进行接种培养,含20g/LB-27 Serum-Free Supplements的Neurobasal Medium进行维持培养,利用尼氏染色进行神经元鉴定。结果:培养的神经元生长良好,胞体饱满,突起长。尼氏染色示神经元比例大于90%。结论:采用机械分离法和Neurobasal Medium培养基可以使新生大鼠视网膜神经元得到良好的生长和较高的纯度。     

视网膜Muellerx细胞原代培养的技术研究

目的：介绍一种新的视网膜Mueller细胞条件化原代培养的方法。方法：使用Con A活化脾细胞培养上清液作为条件化培养基，分别培养人、大鼠、小鼠的视网膜Mueller细胞，并进行形态学观察及免疫组织化学染色。结果：用该方法原代培养不同种类的视网膜Mueller细胞，免疫组织化学染色显示90%以上的视网膜Mueller细胞的神经胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein,GFAP)和S-100蛋白染色阳性。结论：视网膜Mueller细胞的条件化原代培养是一种可靠的、快速获得不同种类视网膜Mueller细胞的理想方法。     

免角膜细胞的原代培养实验研究

报告了兔角膜三种细胞的体外培养技术，成功地建立了角膜上皮、基质和内皮细胞的原代纯培养且形成良好的细胞单层，可用于对角膜组织细胞的体外实验研究。     

角膜内皮细胞培养方法的改进

介绍三种角膜内皮细胞的原代培养方法，这三种方法的特点是简便、易行、不需特殊的试剂和设备。应用这些方法，均获得良好的单层角膜内皮原代培养细胞。     

大鼠视皮层神经元原代培养

目的通过原代培养新生大鼠视皮层神经元，探求视皮层神经元的最佳分离和培养方法，提高原代培养神经元的纯度及活性．为视皮层相关性眼病的临床基础研究提供实验模型。方法分离新生大鼠视皮层神经元，应用含10％新生牛血清、10％F—12 Nutrient Mixtures的DMEM培养基进行接种培养．含2％B-27 Serum—Free Supplements的Neu—robasal Medium进行维持培养，利用尼氏染色进行神经元鉴定。结果培养的神经元生长良好，胞体饱满，突起长。尼氏染色示神经元比例大于50％。结论采用上述培养方法可以使新生大鼠视皮层神经元得到良好的生长和较高的纯度。     

人,狗,兔视网膜神经胶质细胞的原代培养

目的 了解同一方法能否培养不同哺乳动物的视网膜神经胶质细胞（ＲＧＣ）。方法 用酶消化法培养人，狗，兔的ＲＧＣ；根据细胞生长特点，电镜和免疫组织化学对照细胞进行鉴定。结果 培养细胞贴壁生长，形态不规则，生长周期较长（４周）电镜下可见细胞内均含有特征性中间丝（直径８～１０ｎｍ）免疫组化显示细胞呈神经胶质纤维酸性蛋白（ＧＦＡＰ）和波纹蛋白阳性，证实为ＲＧＣ，结论酶消化法是一种获取ＲＧＣ的可靠方法，用同一     

Wistar大鼠乳鼠晶体上皮细胞的原代培养与鉴定

晶体是由完整囊膜包绕的透明组织．其透明聚焦功能的维持，晶体的物质代谢，对外界有害因素的反应及防御，几乎全部依赖于晶体上皮细胞；晶体上皮细胞一旦生成，便终生存活于晶体内；它有特异的高丰度的晶体蛋白的表达，便于鉴定；中央区的晶体上皮细胞通常处于GO期，一级看不到有丝分裂，但在受到外伤等刺激时，又会处于分裂状态；晶体悬浮于房水之中，使我们较易得到纯净的晶体上皮细胞．由于以上特点，晶体上皮细胞不仅可用作体外研究白内障的发病机制[1，2]，对抗日内障药物的筛选[3]，还被广泛用来供体外研究抽胞分裂增殖、分地、蛋白…     

添加晶体皮质提高晶体上皮细胞原代培养成功率

目的介绍一种提高晶体上皮细胞原代培养成功率的方法。方法基本步骤为将一晶体前囊膜剪碎后加纯胎牛血清０．５ｍｌ和冰冻过的新生牛晶体皮质０．５～１ｍｌ，密封培养２４～４８ｈ后添加约３ｍｌ含１０％胎牛血清的ＤＭＥＭ培养液继续培养。结果用该方法原代培养新生牛、幼年兔和人胚胎及角膜移植后的中青年供体标本，成功率为１００％，老年白内障手术取出标本成功率为８７％。结论添加晶体皮质可提高晶体上皮细胞原代培养成功率。     

四种不同种属晶状体上皮细胞的原代培养及生长特性

目的：：探索大鼠、兔、犬及人四种不同种属晶状体上皮细胞( lens epithelial cells, LECs)的原代培养条件,并观察其生长特性。方法：采用不同方法取出四种晶状体囊或前囊组织,改良组织块法进行原代培养,并在倒置显微镜下观察四种LECs的形态学特征及变化。结果：大鼠、兔、犬及人四种LECs均可采用改良组织块贴壁法进行原代培养。随着种属级别的升高,LECs贴壁能力逐渐增强,细胞由不规则的多角形向卵圆形发展、胞核渐渐圆润、胞浆越来越丰富,经多次传代后四种LECs均有向纤维化发展的趋势。结论：成功改良了大鼠、兔、犬及人 LECs 的原代培养方法,在细胞及分子水平为白内障及其相关领域的研究提供了技术支撑。     

溶血磷脂酸对人视网膜色素上皮细胞增殖的影响

目的 :探讨建立体外原代培养人类视网膜色素上皮细胞 (RPE)方法。方法 :取自愿者贡献的意外事故成年眼球 ,用 0 .2 5 %胰酶消化获取人RPE细胞、置 15 %胎牛血清的DMEM培养液中培养 ,细胞接近融合状态时进行传代培养。用溶血磷脂酸 (lysophosphatidicacid ,LPA)观察RPE增殖的影响。结果 :RPE原代细胞镜下为圆形 ,大小不一 ,内含较多的色素颗粒 ,胞核无法辨认。原代细胞培养贴壁后第 3天增殖速度明显加快 ,至 4～ 5d即可基本融合 ,细胞浆内色素颗粒则随传代次数增多而逐渐减少。第 3代培养的视网膜色素上皮细胞膜表面可见微绒毛 ,细胞质内细胞器丰富 ,线粒体量多 ,体积较小 ,内外膜分界清晰 ,嵴较短。色素颗粒散在分布于胞浆内 ,多数细胞质内含量较少 ,呈高电子密度包含物。LPA对原代培养的视网膜色素上皮细胞增殖有促进作用。结论 :LPA可促进人类RPE细胞体外培养的增殖 ,第 3代培养的视网膜色素上皮细胞可保留原代细胞的生物学特性     

人角膜缘干细胞的原代培养和生物学鉴别

目的 探讨人角膜缘干细胞（stem cell,SC)体外培养方法并观察其生物学活性。方法 应用消化培养法对人角膜缘组织进行原代培养,记录其生长特性。待细胞生长至80％汇合时,分别采用针对64KD角蛋白的AE5、针对一组酸性角蛋白的AE1单克隆抗体,抗增殖细胞核抗原单克隆抗体（anti-proliferatin cell nuclear antigen,PCNA),针对50KD烯醇酶特异的单克隆抗体4G 10．3,通过间接免疫荧光细胞化学染色对培养细胞进行鉴别。结果 人角膜缘组织应用消化培养法在6－7d达到80％汇合状态,应用间接免疫细胞化学染色,AE1、AE5染色,胞浆染色呈阳性。PCNA染色、细胞核染色阳性,4G 10．3亦可见阳性结果。结论 应用消化培养法可成功地对人角膜缘组织进行原代培养,培养后细胞既可保持角膜上皮特性,又含有具有强增殖潜力的原始细胞,适合用于临床移植治疗眼表疾病。     

新生大鼠视皮层神经元的原代培养及鉴定

目的 探讨新生大鼠视皮层神经元的原代培养方法,以获取数量多、纯度高的视皮层神经元.方法 取新生1d内的SD大鼠视皮层,通过胰酶消化法获取单细胞悬液,倒置相差显微镜下计数后种植于6孔培养板内培养.培养24 h后用终浓度10μmol·L-1阿糖胞苷处理,抑制非神经元的生长,作用24h后半量换液,以后每隔1d半量换液1次.每天倒置相差显微镜下观察细胞的生长状况和形态变化,Nissl染色法进行视皮层神经元鉴定,免疫荧光显示神经元特异性烯醇化酶鉴定培养视皮层神经元的纯度.结果 接种4h后,大部分细胞已贴壁,细胞立体感较强;接种后24h,大部分细胞长出短的突起,细胞形态发生变化,胞体呈多边形或三角形,细胞周围有或多或少的光晕;培养4d后,细胞突起伸长、增粗;培养6～8d后,细胞状态较佳,细胞胞体饱满,光晕明显,突起进一步伸长、增粗,且分支多,突起交织成网状,非神经元细胞减少,为实验的最佳时间;培养14 d后,细胞开始退化.培养6d行焦油紫染后,倒置相差显微镜下观察,可见细胞内的尼氏体呈蓝紫色的颗粒或斑块.免疫荧光染色结果显示,原代培养的细胞中,大部分细胞为绿染细胞,形态良好,核大而清晰,神经元所占比例高.结论 本研究获得视皮层神经元的方法简单经济,通过形态学观察、Nissl染色及免疫荧光染色可以对体外培养的视皮层神经元细胞进行准确鉴定.     

盖玻片辅助人晶状体上皮细胞原代培养法

目的：建立人晶状体上皮细胞原代培养的简便方法并比较不同来源人品状体上皮细胞的生物学特性。方法：取胎龄20周合法引产胚胎眼晶状体囊膜、中山眼科中心眼库眼晶状体囊膜和白内障患者术中撕取的前囊膜，分别在培养皿中铺平，加10乩10％DMEM培养液润湿后加盖盖玻片防止卷曲并促进粘贴．添加培养液浸没盖玻片，37℃培养。同时取相同来源的囊膜按照组织块法培养。观察细胞增殖情况并比较原代人晶状体上皮细胞与人晶状体上皮细胞系SRA01／0413晶体蛋白的表达差异。结果：在盖玻片辅助下，胚胎眼晶状体囊膜第2天即可见明显的增殖细胞由囊膜缘长出，眼库眼囊膜和白内障患者术中撕取的囊膜在3～4d的潜伏期后亦可见增殖细胞长出；组织块法培养出现部分组织块漂浮，且胚胎眼囊膜潜伏期延长至3-4d，眼库眼囊膜和白内障患者晶状体囊膜潜伏期延长至4-5d。结论：盖玻片辅助的改良组织块培养法能尽快获得体外培养的原代晶状体上皮细胞，且操作简便，值得推广应用于品状体病的研究。     

改良兔角膜上皮细胞原代培养及纯化的方法

目的 改良原代培养及纯化兔角膜上皮细胞的方法,提高角膜上皮细胞原代培养的成功率.方法 采用全角膜组织培养法培养兔角膜上皮细胞,利用机械刮除和差速贴壁法进行纯化并传代,通过倒置显微镜对细胞进行形态学观察并应用免疫组织化学的方法对细胞进行鉴定.结果 兔全角膜24 h贴壁,48 h后即可见有细胞自角膜缘爬出,5d后细胞大量爬出可见成纤维细胞和角膜上皮细胞共存,界限明显;角膜上皮细胞复层生长.在界限融合前刮除成纤维细胞,角膜上皮细胞继续旺盛生长,10 d后达到融合.兔角膜上皮细胞传至第4代后细胞体积明显变大,传至第5代,细胞衰老、凋亡.兔角膜上皮细胞免疫组织化学显示PCK单克隆抗体阳性.结论 改良原代培养及纯化兔角膜上皮细胞的方法简单、经济、有效,并可获得具有良好生物学特性的角膜上皮细胞,为角膜及角膜疾病的研究奠定实验基础.     

眼睑基底细胞癌相关成纤维细胞与正常成纤维细胞形态与生长增殖特性差异

目的　对眼睑基底细胞癌相关成纤维细胞（ｂａｓａｌｃｅｌｌｃａｒｃｉｎｏｍａ-ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ,ＢＣＡＦｓ）及眼睑正常成纤维细胞（ｎｏｒｍａｌｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ,ＮＦｓ）进行分离、培养、纯化和鉴定,初步研究ＢＣＡＦｓ与ＮＦｓ细胞形态、生长增殖等生物学性状的差异。方法　用组织块贴壁法培养获得原代眼睑ＢＣＡＦｓ和眼睑ＮＦｓ,通过胰蛋白酶差速消化法和反复传代法进行细胞的分离、纯化;通过倒置相差显微镜对照观察ＢＣＡＦｓ和ＮＦｓ细胞形态,应用免疫细胞化学染色检测细胞表达的特异性蛋白鉴定ＢＣＡＦｓ,ＭＴＴ法检测细胞生长增殖特性。结果　在接种后３ｄ便可见原代ＢＣＡＦｓ从组织块爬出,呈放射状生长,约７ｄ铺满瓶底。ＮＦｓ生长缓慢,接种后４ｄ才见稀疏的ＮＦｓ在组织块周围生长,约１１ｄ铺满瓶底。传代后的ＢＣＡＦｓ在形态上未发生明显改变,但生长速度增快,与ＮＦｓ在形态结构特征和生长方式上存在差异;眼睑ＢＣＡＦｓ和ＮＦｓ的免疫细胞化学染色,前者波形蛋白、α-平滑肌肌动蛋白、成纤维细胞活化蛋白呈阳性,细胞角蛋白呈阴性,后者仅波形蛋白呈阳性,角蛋白、α-平滑肌肌动蛋白、成纤维细胞活化蛋白均呈阴性;与ＮＦｓ相比,眼睑ＢＣＡＦｓ生长增殖较快,倍增时间较短。结论　与眼睑ＮＦｓ相比,ＢＣＡＦｓ在形态结构、蛋白表达、生长方式等方面均有差异,且增殖能力强。     

SD大鼠视网膜神经节细胞体外分离培养及高糖模型建立

目的：体外分离新生SD大鼠视网膜神经节细胞(RGCs),建立新生SD大鼠RGCs体外原代培养方法及高糖模型。

方法：取15～20只出生1～3d SD大鼠的视网膜组织,分离纯化RGCs进行原代培养。甲苯胺蓝法及免疫荧光细胞染色法进行鉴定。细胞连续培养48～72h后,随机分为6组并分别加入含不同葡萄糖浓度5.5、20、25、30、35、40mmol/L的培养基培养24、48、72h,采用CCK8法及TUNEL凋亡检测法分析各组细胞存活率及凋亡率。

结果：离体纯化原代培养的RGCs具有典型的细胞形态且生长良好,细胞之间呈小片状融合聚集生长,轴突相互交错成网络状,胞体周围可见细胞光晕。甲苯胺蓝着染细胞胞质中可见结构清晰的尼式小体,神经元率达95%以上。RGCs特异性抗体Thy-1、Brn-3a定体外纯化培养细胞,阳性率达90%以上。CCK8检测发现随着时间及葡萄糖浓度的增加,各组细胞的存活率降低; 在不同葡萄糖浓度干预细胞24h时,各分组之间OD值均小于正常对照组,但与正常对照组相比较OD值大小无差异(均P>0.05); 随着时间延长,35、40mmol/L葡萄糖浓度干预RGCs 48h,30、35、40mmol/L干预RGCs 72h时的OD值较正常对照组OD值明显降低(均P<0.05)。TUNEL检测发现随着葡萄糖浓度及时间的增加,RGCs凋亡率增加。其中葡萄糖浓度为30、35、40mmol/L培养RGCs 48、72h后RGCs细胞凋亡率与正常对照组相比较有差异(均P<0.05)。

结论：本研究建立的RGCs体外原代培养方法能获得典型且纯度较高的RGCs,随着葡萄糖浓度的增加,体外纯化培养的RGCs存活率降低,凋亡率增加。35mmol/L葡萄糖浓度干预RGCs 48h可为有效诱导RGCs建立高糖模型最佳干预浓度及时间。     

结膜松弛症球结膜成纤维细胞的原代培养及形态学观察

目的：观察原代培养的结膜松弛症(CCH)球结膜成纤维细胞生长状况及形态变化,确定最佳传代时间以获得稳定、一致的CCH球结膜成纤维细胞。

方法：采用组织块贴壁法获得CCH原代球结膜成纤维细胞,胰蛋白酶差速消化法进行成纤维细胞纯化,倒置显微镜下观察并记录不同时期成纤维细胞的生长状况及形态变化,免疫荧光细胞化学染色行成纤维细胞鉴定。

结果：CCH结膜组织贴壁24h即可见少量细胞从组织块周围爬出,第2～7d为细胞生长对数期,细胞生长快、增殖旺盛,轮廓清晰,分布均匀,数目增多,细胞核清晰; 第9～15d细胞生长进入平台期,组织块逐渐老化失去活性,细胞增长缓慢,排列疏松,体积变大,形状扁平,细胞浆内见大量颗粒状物质和小泡产生,部分细胞从培养瓶底脱落,细胞之间出现较大空隙。传代纯化后细胞的大小、形态基本一致,经鉴定为成纤维细胞,呈长梭形、扁平星状或多突的纺锤形,中间宽大,有卵圆形细胞核,两头相对细小,伴向外伸出2～3个长短不一的细长突起。

结论：采用组织块贴壁法可成功获得原代CCH球结膜成纤维细胞,当细胞生长至第8d时行消化、传代可获得稳定、一致的CCH球结膜成纤维细胞。     

DispaseⅡ消化法原代培养兔结膜上皮细胞及鉴定

目的研究DispaseⅡ消化法原代培养兔结膜上皮细胞,观察其体外生长特性,并采用免疫组织化学染色鉴定培养的上皮细胞。方法 DispaseⅡ消化法原代培养兔结膜上皮细胞,观察不同时期细胞的生长情况、细胞形态,做广谱角蛋白、MUC5AC免疫荧光染色及PAS染色鉴定;并比较不同部位结膜上皮细胞增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)表达阳性情况。结果 DispaseⅡ消化法能够获得大量的较纯净的结膜上皮细胞,细胞生长增殖快,能传代4～5代;绝大多数细胞广谱角蛋白免疫荧光染色阳性,少数细胞MUC5AC表达阳性及PAS染色阳性。睑结膜、穹隆部结膜和球结膜细胞PCNA阳性率分别为:(32.14±1.69)%、(27.67±1.20)%、(22.76±1.73)%,兔睑结膜上皮细胞PCNA阳性率较穹隆部及球结膜上皮细胞的PCNA阳性率高,各部位PCNA阳性率间比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论 DispaseⅡ消化法是进行体外结膜上皮细胞培养的理想方法,兔眼睑结膜处可能存在结膜干细胞。