雷公藤内酯醇(T10)通过抑制脊髓背角内p38-MAPK的磷酸化发挥镇痛作用的机制研究

目的:观察鞘内给予雷公藤内酯(triptolide,T10)对于慢性炎性痛和神经病理性痛模型大鼠脊髓背角小胶质细胞内p38丝裂原激活的蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase,MAPK)的磷酸化水平的影响。方法:采用大鼠足底注射完全弗式佐剂(complete Freund’s adjuvant,CFA)构建慢性炎性痛模型,L5脊神经结扎(spinal nerve ligation,SNL)和坐骨神经分支选择性结扎(spared nerve injury,SNI)的方法制作慢性神经病理性痛模型。利用von Frey丝刺激法连续观察造模后大鼠的痛行为变化;应用免疫荧光染色方法观察大鼠腰膨大节段胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)和电离钙绑定衔接分子1(ionized calcium binding adaptor molecule-1,Iba-1)的表达水平;应用Western Blot方法观察大鼠腰膨大节段p38 MAPK的磷酸化水平。结果:(1)行为学结果显示:CFA、SNL、SNI模型大鼠机械性痛阈均明显降低,且术后一周内与正常对照组相比均保持在较低水平(P0.01)。从术后第1 d起鞘内连续给予T10至第7 d,分别观察到T10能够明显提高上述模型大鼠手术侧后足的机械性痛阈(P0.05);但T10在SNL模型和SNI模型大鼠中的效果要弱于CFA引起的慢性炎性痛(P0.05)。(2)免疫荧光染色结果显示:CFA、SNL和SNI模型大鼠腰膨大脊髓背角内GFAP、Iba-1的表达明显高于正常对照组,而p-p38 MAPK阳性产物主要表达于小胶质细胞内。(3)Western Blot结果显示:造模后7 d脊髓背角内p-p38 MAPK的表达明显上调,鞘内给予T10后可以显著下调脊髓背角内p38的磷酸化水平(P0.05)。结论:鞘内给予T10有效缓解由于CFA、SNL和SNI诱导的慢性痛模型大鼠的机械性痛阈的机制可能是通过下调脊髓背角内p38 MAPK信号通路的磷酸化水平,进而达到抑制小胶质细胞和星形胶质细胞的活化。其次,T10对不同类型的疼痛模型的作用效果存在差异,对由CFA引起的慢性炎性痛的作用效果要强于由SNL和SNI诱导的慢性神经病理性痛。     

雷公藤内酯醇(T10)通过抑制脊髓内胶质细胞的激活改善大鼠CFA诱导的炎性痛的机制研究

目的:观察腹腔注射雷公藤内酯醇(Triptolide,T10)对完全弗氏佐剂(complete Freund’s adjuvant,CFA)诱导的大鼠慢性炎性痛行为的改善作用并探讨其机制。方法:SD大鼠随机分为四组,即Saline+Veh组、Saline+T10组、CFA+Veh组和CFA+T10组。后两组大鼠于右侧足底注射CFA制备大鼠慢性炎性痛模型,前两组则在相同部位注射生理盐水。第二组和第四组大鼠分别于造模前1 h给予T10腹腔注射,随后每12 h给予腹腔注射药物1次,持续用药7 d;第一组和第三组则以相同方式给予100 ml/kg的生理盐水作为对照。采用辐射热法和机械刺激法连续观察给药后大鼠的痛行为;应用免疫组织化学染色和Western Blot方法观察连续给予T10 3d和7 d后大鼠腰膨大平面脊髓背角内小胶质细胞和星形胶质细胞的活化程度;应用实时定量PCR(RT-PCR)方法观察连续给药7 d后大鼠腰5背根神经节内炎性因子,如白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、白细胞介素-1β(interleukin-1 beta,IL-1β)和肿瘤坏死因子-α(tumour necrosis factor-α,TNF-α)的表达变化。结果:(1)与CFA+Veh组相比,CFA+T10组大鼠机械缩足阈值及辐射热痛潜伏期显著下降(P0.05),并持续到造模成功后7 d,表明腹腔注射T10可以明显改善CFA诱导的大鼠机械痛敏和辐射热痛敏。(2)免疫组织化学染色和Western Blot结果显示:造模后3 d和7 d后CFA+Veh组大鼠脊髓背角出现大量CFA诱导活化的小胶质细胞和星形胶质细胞;小胶质细胞标记物IBa-1和星形胶质细胞标记物GFAP的表达量分别在CFA造模后3 d和7 d显著增高(P0.05),而给予T10 3 d和7 d后炎性痛大鼠腰膨大平面IBa-1和GFAP的活化程度均显著减轻(P0.05)。(3)RT-PCR结果显示:与Saline+Veh组相比,CFA造模7 d后腰5背根神经节内炎性因子IL-1β、IL-6 mRNA和TNF-αmRNA的表达显著增高(P0.05),腹腔注射T10 7 d后上述炎性因子的表达则显著降低(P0.05)。结论:腹腔注射T10可以显著改善CFA诱导的大鼠慢性炎性痛,其机制可能与抑制脊髓背角小胶质细胞和星形胶质细胞的活化以及炎性因子IL-1β、IL-6和TNF-α的合成有关。     

鞘内应用右美托咪定改善完全弗氏佐剂诱导的大鼠慢性炎性痛行为及其机制研究

目的:观察鞘内应用右美托咪定(dexmedetomidine,DEX)对完全弗氏佐剂(complete Freund’s adjuvant,CFA)诱导的大鼠慢性炎性痛行为的改善作用并探讨其机制。方法:足底注射CFA制备大鼠慢性炎性痛模型,经鞘内给予不同剂量的DEX,采用辐射热法连续观察给药后大鼠痛行为,评价单次给药后的镇痛持续时间,并计算半数有效量(50%effective dose,ED50);旷场和转棒试验观察鞘内应用不同剂量DEX对大鼠运动功能的影响;应用免疫组织化学染色和Western Blot方法观察连续给予DEXED507 d后大鼠腰膨大平面脊髓背角星形胶质细胞活化程度。结果:鞘内应用DEX呈剂量依赖性地改善CFA诱导的大鼠辐射热痛敏且不影响运动功能;鞘内持续应用DEXED50可产生持久的镇痛效应;免疫组织化学染色和Western Blot结果均表明,与对照组相比,持续给药7 d后慢性炎性痛大鼠腰膨大平面脊髓背角星形胶质细胞的活化程度显著减轻(P0.05)。结论:鞘内应用DEX可剂量依赖性改善CFA诱导的大鼠慢性炎性痛,连续给药可产生持久的镇痛效果,其机制可能与抑制脊髓星形胶质细胞活化有关。     

电针抑制脊髓内趋化因子CX3CL1表达减轻炎性痛的实验研究

目的:通过观察电针对完全弗氏佐剂(CFA)所致大鼠炎性痛急性期脊髓组织内趋化因子CX3CL1(Fractalkine,FKN)及其受体CX3CR1表达的影响,探讨FKN是否可能参与电针镇痛的相关机制。方法:清洁级雄性SD大鼠82只,分两批进行实验。第1批大鼠40只,随机分为4组(n=10):空白对照组(Control组),CFA模型组(CFA组),电针治疗组(EA组)和非穴位电针组(Sham组),其中CFA、EA和Sham组使用CFA足底注射造成炎性痛模型;造模后EA组给予电针刺激双侧"足三里"(30 min,2 Hz连续波,1~2 m A),而Sham组接受非穴位针刺处理;分别于造模前及造模后1~7 d观察并测量大鼠机械缩足反应阈值(paw withdrawal mechanical threshold,PWMT)及热缩足反应阈值(paw withdrawal thermal latency,PWTL),观察电针对CFA所致慢性痛的治疗作用。第2批大鼠42只,仍按上述分组方法随机分入7组(其中CFA、EA、Sham组取造模后1、3 d两个时间点,Control组取一个时间点),在相应时间点处死实验动物取腰段脊髓组织进行Western Blot检验,观察电针干预对FKN及CX3CR1表达的影响。结果:CFA造模致实验动物PWMT及PWTL显著下降(P0.01),提示电针处理部分拮抗了CFA的致痛作用(P0.05);Western Blot结果显示,电针处理能够降低CFA所致动物脊髓组织升高的FKN表达,在造模后3 d最为显著(P0.01),但其受体CX3CR1表达无显著性差异。结论:电针刺激大鼠"足三里"能够改善CFA所致炎性痛症状,其中抑制脊髓的FKN表达可能是电针镇痛的机制之一。     

电针刺激对炎性痛大鼠脊髓背角小胶质细胞活化的影响

目的:探索电针(EA)刺激是否通过下调糖原合成酶激酶3β(GSK3β),抑制小胶质细胞活化缓解大鼠慢性炎性痛。方法:利用完全随机数字法将Sprague Dawley (SD)雄性大鼠分为对照组(control)、完全弗氏佐剂注射组(CFA)、CFA+电针刺激组(CFA+EA)和CFA+GSK3β抑制剂TDZD-8组(CFA+TDZD-8)。通过足底注射CFA方法制备大鼠炎性痛模型,利用电针刺激和给予不同的药物处理各组大鼠。采用经典von Frey丝检测各组大鼠机械缩足反射阈值(PWT),用Western Blot法或免疫荧光检测脊髓背角GSK3β和小胶质细胞离子钙接头蛋白(Iba-1)表达的变化情况。结果:与control组相比,CFA组大鼠在各时间节点的PWT值均显著降低(P <0.01);脊髓背角中GSK3β和Iba-1表达明显增加(P <0.05)。与CFA组相比,CFA+EA组大鼠PWT显著升高(P <0.01),GSK3β和Iba-1表达量显著下调(P <0.05); CFA+TDZD-8组大鼠PWT显著升高(P <0.01),Iba-1的表达量...     

曲古抑菌素A通过抑制脊髓背角内的炎症反应减轻大鼠神经病理性痛

目的:观察曲古抑菌素A (TSA)对脊神经结扎(SNL)大鼠镇痛效果及分子机制。方法:40只健康雄性Sprague Dawley(SD)大鼠随机分为假手术组(sham)、曲古抑菌素A处理组(TSA)、脊神经结扎组(SNL)和SNL+TSA组(SNL+TSA)。采用L5脊神经结扎(SNL)的方法建立神经病理性痛模型,鞘内注射TSA进行干预,通过von Frey丝和热板实验检测大鼠的痛敏,应用免疫荧光染色方法观察大鼠脊髓背角内HDAC1的表达情况;应用Western Blot方法观察大鼠脊髓背角内胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和离子钙接头蛋白分子1(Iba-1)的表达水平;应用real time RT-PCR方法检测大鼠脊髓背角内TNF-α、IL-1β和IL-6的mRNA表达水平。结果:SNL模型大鼠术后机械性痛阈值和热痛阈值均显著降低(P <0.05),鞘内给予TSA能够明显缓解大鼠患侧后足机械性痛敏和热痛敏; SNL模型大鼠脊髓背角内HDAC1的表达较对照组明显增加,而鞘内注射TSA可显著抑制其表达; SNL术后脊髓背角内GFAP和Iba-1的表达显著升高(P <0.05),...     

电针对慢性内脏痛大鼠脊髓背角降钙素基因相关肽的影响

目的:检测电针对慢性内脏痛大鼠脊髓背角内降钙素基因相关肽(calcitonin gene-related peptide,CGRP)表达的影响。方法:SD大鼠随机分成正常对照组,慢性内脏痛模型组和模型加电针组,每组6只。慢性内脏痛模型采用新生幼鼠结直肠刺激方法制备;模型加电针组选取双侧"足三里"和"上巨虚",疏密波,强度1mA,持续30min,隔日一次,持续四次。记录结直肠扩张刺激下腹外斜肌放电幅值;免疫组织化学法检测各组大鼠胸腰段、腰骶段脊髓背角内CGRP的表达变化。结果:电针能够显著降低内脏痛大鼠结直肠扩张刺激诱导的腹外斜肌放电幅值(P0.05);免疫组织化学染色法显示:CGRP样免疫阳性物质的表达在模型组大鼠的胸腰段、腰骶段脊髓背角内均显著升高(P0.01),而模型加电针组的胸腰段、腰骶段脊髓背角内CGRP的表达与模型组相比有显著降低(P0.01)。结论:电针降低慢性内脏痛敏反应的镇痛机制与减少脊髓背角内CGRP样免疫阳性物质的表达有关。     

DHA对糖尿病大鼠神经病理性痛和背根节JNK/CXCL1信号通路的影响

目的:研究DHA对糖尿病神经病理性痛大鼠机械痛敏和热痛敏的作用,探讨DHA对糖尿病大鼠背根节JNK磷酸化和CXCL1水平及其受体表达的影响。方法:采用SD大鼠,随机分为对照组、对照+DHA组、糖尿病组和糖尿病+DHA组。以链脲佐菌素诱发大鼠糖尿病,DHA组给予DHA(200mg/kg体重)干预,对照组和糖尿病组给予玉米油(0.2 ml/kg体重)。检测各组大鼠机械痛和热痛阈值,ELISA法、PCR法检测背根节中CXCL1含量,免疫荧光法检测CXCR2受体表达情况,Western Blot法检测背根节中JNK磷酸化水平。结果:糖尿病大鼠机械痛敏和热痛敏阈值下降,DHA可在一定程度上缓解大鼠痛反应。糖尿病大鼠背根节JNK磷酸化水平升高,CXCL1水平明显升高,CXCR2受体阳性神经元数量明显升高。DHA干预明显抑制JNK磷酸化水平和CXCR2的表达,降低CXCL1的含量。结论:DHA具有减轻糖尿病神经病理性痛大鼠机械痛敏和热痛敏的作用,其机制可能与抑制背根节JNK磷酸化,降低炎性因子水平有关。     

炎性痛致大鼠脊髓后角ProBDNF及其受体的表达变化

目的:探讨完全弗氏佐剂(complete Freund’s Adjuvant,CFA)致炎性疼痛后大鼠脊髓后角内ProBDNF及受体P75NTR和Sortilin的表达变化及意义。方法:大鼠随机分为正常组和实验组,实验组大鼠左侧足底皮下注射CFA和生理盐水混合溶剂100μl,建立炎性疼痛模型,实验组包括注射CFA后6 h、1、3、7和14 d组。采用Von Frey纤维测定不同时间点大鼠机械缩足阈值(pawwithdrawal threshold,PWT)的变化;采用免疫组织化学方法检测ProBDNF及P75NTR、Sortilin在脊髓后角的表达变化。结果:足底注射CFA后1 h PWT即下降,并在6 h后达到最低值,3 d后逐渐上调,至14 d仍低于基础值。ProBDNF在正常脊髓后角可见阳性表达;注射CFA后1 d注射侧脊髓后角较对侧其ProBDNF的表达明显上调,上调持续到7 d左右,至14 d逐渐恢复。正常大鼠脊髓后角P75NTR有较弱表达,主要集中在后角I、II层纤维;注射CFA后6 h开始,注射侧脊髓后角内P75NTR的表达明显上调,III-V层的阳性产物也逐渐增加,这种上调持续到7 d左右达高峰,至14 d逐渐下降。Sortilin在正常脊髓后角浅层仅有较弱阳性产物表达,注射CFA后不同时间点脊髓后角Sortilin的表达无明显差异。结论:CFA能诱导大鼠产生为期2周以上的炎性痛病程;脊髓后角ProBDNF和P75NTR的表达上调可能与炎性疼痛中外周痛觉信号的传导和中枢敏化有关。     

依达拉奉通过JNK通路抑制蛛网膜下腔出血大鼠海马区神经细胞自噬

目的:通过研究应用依达拉奉前后JNK通路及自噬因子Beclin-1、LC3-Ⅱ表达的变化,探讨依达拉奉对蛛网膜下腔出血(SAH)大鼠海马区c-Jun氨基端激酶(JNK)-自噬通路的影响。方法:选取雄性清洁级健康SD大鼠(350~450 g),随机分为假手术组(Sham组)、SAH模型组(SAH组)、SAH应用JNK抑制剂组(SP600125组)、SAH联合应用依达拉奉干预组(Edaravone组)。利用颅内动脉穿刺法制成大鼠SAH模型,SP600125组于造模前30 min,利用立体定向仪行侧脑室注射SP600125溶液;Edaravone组在建模成功后予以依达拉奉干预治疗。利用H-E染色观察每组大鼠海马区神经元形态及数量变化;应用免疫组织化学显色检测p-JNK以及自噬标志物Beclin-1和LC3-Ⅱ在大鼠海马区的表达情况。结果:与Sham组比较,SAH组在各时间点海马区神经元存活数量减少,与SAH组比较,SP600125组和Edaravone组正常形态细胞数量明显增多;SAH组大鼠海马区Beclin-1、LC3-Ⅱ阳性细胞数量多于Sham组,且均在24 h达到高峰,与SAH组比较,SP600125组和Edaravone组海马区Beclin-1、LC3-Ⅱ阳性细胞数均显著减少;与Sham组比较,SAH组大鼠海马区p-JNK阳性细胞数量明显增加,与SAH组比较,SP600125组和Edaravone组海马区p-JNK阳性细胞数均显著减少。结论:依达拉奉可抑制SAH后海马区JNK信号过度激活,降低自噬激活的程度,从而对SAH后海马区神经元细胞起到保护作用。     

脊髓刺激术对神经病理性痛模型大鼠痛行为和脊髓背角内小胶质细胞激活的影响

目的:探讨脊髓刺激术(spinal cord stimulation,SCS)对神经病理性痛(neuropathic pain,NP)模型大鼠痛行为及脊髓背角内小胶质细胞激活的影响。方法:成年大鼠20只,随机分为4组:(1)正常对照组(control组);(2)SCS组:正常大鼠给予SCS刺激;(3)脊神经结扎(spinal nerve ligation,SNL)假刺激组(SNL+shamSCS组):SNL且植入SCS装置,但不刺激;(4)SNL+SCS组:SNL且给予SCS刺激。术前连续3 d、术后第5 d检测各组大鼠足底机械痛敏阈值(mechanical withdrawal threshold,MWT)。SCS组和SNL+SCS组术后第2-5 d给予SCS刺激,每d持续8 h;且在每次给予SCS 8 h刺激前进行90 min行为学测试,即SCS刺激30 min,以及刺激结束后的60 min内(共90 min),每15 min测量一次MWT。在第5 d给予SCS 8 h刺激结束后处死动物,利用免疫组织化学染色结合平均光密度(average optical density,AOD)分析的方法检测各组大鼠腰5节段脊髓背角内小胶质细胞特异性标志物OX-42的表达情况。结果:(1)行为学结果显示:术后第5 d,SNL+shamSCS组和SNL+SCS组大鼠手术侧后爪的MWT由术前26.00±0.0 g分别降至5.50±0.96 g和6.40±0.40 g(P<0.05);SNL+SCS组给予SCS刺激30 min后大鼠手术侧后爪的MWT明显有所提高,达16.20±2.60 g,与刺激前(6.40±0.40 g)相比有显著性差异(P<0.05);但停止SCS刺激60 min后,大鼠的MWT明显有所下降,与刺激前几乎没有明显差别。(2)免疫组化染色结果显示:术后第5 d,SNL+SCS组脊髓背角内OX-42的表达明显弱于SNL+shamSCS组,但二者都强于control组和SCS组;AOD结果也证实:SNL+SCS组大鼠脊髓背角内OX-42的AOD(1.29±0.28)明显低于SNL+shamSCS组(2.66±0.38),但仍高于control组(0.14±0.21)和SCS组(0.24±0.08)。结论:SCS对SNL模型大鼠的神经病理性痛有较好的镇痛效果;该作用可能与SCS刺激显著抑制脊髓背角内小胶质细胞的激活密切相关。     

糖尿病大鼠背根神经节JNK的表达水平对足部皮肤组织学变化的影响

目的:观察糖尿病(DM)大鼠皮肤组织学改变,探讨背根神经节(DRG)内c-Jun氨基端激酶(JNK)蛋白在其中的可能作用机制。方法:雄性SD大鼠腹腔注射链脲佐菌素制备DM模型,分别取正常对照(control)组、DM 2周(DM2)组、DM 4周(DM4)组和DM 8周(DM8)组大鼠足底皮肤标本进行PGP 9.5免疫组化染色和HE染色,观察皮肤PGP 9.5免疫阳性神经末梢和皮肤组织结构变化;同时采用Western blotting法分别检测上述各组大鼠足底皮肤组织内PGP 9.5蛋白和脊髓腰5~6(L5,6)、骶1(S1)节段DRG内JNK和p-JNK蛋白的表达。结果:大鼠足底皮肤PGP 9.5免疫阳性神经末梢主要分布于表皮基底层和真皮乳头层,与正常对照组比较,DM4组大鼠表皮阳性神经末梢密度减少,分布稀疏,DM8组大鼠表皮阳性神经末梢分布明显减少,神经直径变细,长度变短,走形扭曲;组织学观察可见,DM4组大鼠表皮组织变薄,表皮细胞层次减少,细胞分布及排列不均匀,DM8组大鼠表皮细胞层次明显减少,细胞肿胀模糊,细胞间隙增大,部分表皮缺乏复层排列,真皮层胶原纤维萎缩、变性,皮下脂肪明显减少。蛋白印迹检测发现皮肤组织内PGP 9.5蛋白的表达随病程呈渐进性减弱;同时L5,6-DRG和S1-DRG内p-JNK蛋白的水平呈现渐进性增强趋势。DM大鼠皮肤PGP 9.5免疫阳性神经末梢吸光度值与L5,6-DRG和S1-DRG内的p-JNK蛋白灰度值之间呈负相关(P0.01);与表皮厚度值之间呈显著正相关。结论:DM大鼠皮肤组织和皮肤神经均存在明显形态结构改变,同时存在L5,6-DRG和S1-DRG内p-JNK蛋白的渐进性高表达,DM大鼠皮肤PGP 9.5免疫阳性神经末梢密度变化与L5,6-DRG和S1-DRG内p-JNK蛋白水平的变化之间呈负相关;与表皮厚度的变化呈显著正相关。皮肤神经形态结构的改变可能与背根神经节细胞JNK/SAPK通路活化有关,阻断或抑制JNK/SAPK通路可以起到延缓糖尿病周围神经病变,减轻皮肤组织病变发生的作用。