组织工程骨神经化构建的组织学研究

[目的]通过观察不同神经束植入组织工程骨后组织学的变化,探讨组织工程骨神经化构建的效果.[方法]将新西兰大白兔的骨髓基质干细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs )进行诱导分化为成骨细胞,与β-磷酸三钙(β-tricalcium phosphate,β-TCP)复合制作组织工程骨,分别将不同类型神经束植入组织工程骨,进行以下分组:A组,组织工程骨组; B组,感觉神经束植入组; C组,运动神经束植入组; D组,血管束(含有自主神经)植入组; E组,感觉、运动神经束联合植入组.分别用于修复兔股骨1.5 cm大段骨缺损;各组分别在12周进行组织学的Masson染色,降钙素基因相关肽(calcitonin gene-related peptide,CGRP)的免疫组织化学检测,并进行统计学分析,以比较骨缺损修复情况.[结果]在观察期内,有感觉神经植入的组别和血管束植入的组别在组织学上具有明显骨化作用,而运动神经束植入却没有明显的促进作用.[结论]感觉神经束和血管束具有明显的促组织工程骨成骨作用,可以作为组织工程骨神经化构建的一种方法.     

神经植入对大段组织工程骨成骨效果的一年观察

目的 观察在组织工程骨内植入神经束后大段组织工程骨的长期成骨效果.方法 新西兰大白兔64只,随机分为四组:A组,单纯组织工程骨组;B组,运动神经束植入组(股神经肌支);C组,感觉神经束植入组(隐神经);D组,感觉、运动神经束联合植入组.每只动物均在左侧股骨制作长1.5 cm的段缺性骨与骨膜缺损,钢板固定后在骨缺损处分别植入四种方法制备的组织工程骨.术后1、3、6、12个月行大体观察、X线和组织学定量观察成骨情况. 结果 术后1、3、6个月时,在组织工程骨内植入感觉神经或联合植入两种神经后,比单纯组织工程骨和运动神经束植入的修复效果均有明显提高.术后12个月时,各组骨再生情况基本一致,但新生骨组织出现一定程度的吸收,其外观较正常股骨细,新生骨组织与兔股骨牢固愈合,并开始塑形且出现髓腔再通. 结论 在组织工程骨内植入感觉神经可促进成骨,而植入运动神经未见促进作用;组织工程骨可以修复兔大段骨缺损;该实验新生骨组织的吸收可能与模型的制作方法有关.     

组织工程骨软骨复合物的构建与形态学观察

目的探讨采用组织工程技术构建骨软骨复合物的可行性。方法将骨髓基质细胞(BMSCs)成诱导软骨后接种于快速成形的三维支架材料聚乳酸／聚羟乙酸共聚物(PLGA)构建组织工程软骨，经成骨诱导的BMSCs接种于聚乳酸／聚羟乙酸共聚物／磷酸三钙(PLGA／TCP)构建组织工程骨，在体外分别培养2周后，将两种工程化组织及两者以无损伤线缝合形成的组织工程骨软复合体分别植入自体股部肌袋，术后8周取材，行组织学观察。结果术后组织学观察表明。组织工程软骨在体内可形成软骨组织组织工程骨在体内可形成骨组织，两者的复合体在体内可形成骨软骨复合物。结论以骨髓基质细胞为种子细胞、以快速成形的生物降解材料为支架体外构建的组织工程骨软骨复合物，可在体内形成骨软骨组织，有望用于骨软骨缺损的修复。     

组织工程骨修复骨缺损的研究进展

复习相关文献,综合性报道种子细胞、生物材料及组织工程骨替代被修复重建组织的研究,指出目前存在的问题和今后研究的方向。     

组织工程骨血管化策略的研究进展

骨组织工程的发展为大段骨缺损的修复提供了新的途径,众多的动物实验研究和逐渐兴起的临床应用研究已充分显示出其巨大的应用前景。然而,组织工程骨细胞支架复合物在植入体内后,尤其植入血供不佳的受区时,因不能及时地与机体建立起血供连接,使得成骨效果不稳定。近年来的研究表明,组织工程骨的血管化已成为构建大段组织工程骨的一个关键因素。我们对组织工程骨血管化策略的研究进展进行综述。     

组织工程骨血管化的研究进展

组织工程骨具有巨大的临床需要及应用前景,用组织工程骨（tissue engineering bone,TEB）修复骨缺损的研究方兴未艾.目前大部分的研究都停留在小动物（如鼠、兔）体内原位或异位成骨,修复部位大都为非负重骨缺损,新生的骨组织还不能满足临床应用的需要.目前应用大块TEB修复大段骨缺损时,其核心部位往往发生缺血坏死,使修复归于失败,其主要原因在于未能很好解决TEB的血管化问题。     

血管化组织工程骨修复猕猴胫骨缺损模型的建立及初步观察

目的通过对猕猴的解剖和实验,初步建立一种可行的利用血管化组织工程骨修复猕猴胫骨段性缺损的动物模型。方法对一只自然死亡的猕猴进行新鲜解剖,观察其胫骨的形态及周围知名血管束的解剖路径;将10只猕猴双侧胫骨(共20处)制成中段20mm骨-骨膜缺损模型,随机平均分成2组,实验组在缺损处填塞由骨髓基质干细胞(BMSCs)和具有特殊外型(侧槽和中空管)的β-磷酸三钙(β-TCP)支架体外构建的复合物,在中空管内移入隐动、静脉的一段,组织工程骨外被带蒂深筋膜;对照组只填塞组织工程骨。另取2只猕猴的无填充物胫骨缺损作对照。钢板螺钉固定。在4、8、12周时间点分别行放射线检测,墨汁灌注标本,组织学检测及标本大体观察。结果各时间点上,实验组在成骨、血管化程度及材料吸收方面明显优于对照组。未填充任何材料的缺损无愈合。各组猕猴术后一般表现无差异;术前、术后表现无明显变化。结论本组实验所建立的猕猴胫骨段性缺损修复模型及组织工程骨血管化方法是有效的、可行的,为组织工程骨的临床应用提供参考。     

低温保存的组织工程骨修复骨缺损的实验研究

目的探讨低温保存的组织工程骨修复骨缺损的能力及低温保存的可行性。方法将人源性生物衍生骨材料复合成骨细胞构建的组织工程骨,在4℃和-196℃的温度环境中保存3个月和6个月,同时以未行低温保存的组织工程骨和生物衍生骨材料作为对照,分别修复实验兔桡骨的长段骨缺损。80只成年日本大耳白兔,随机分为4个实验组(左前肢植入材料):A3组:组织工程骨在4℃保存3个月;A6组:组织工程骨在4℃保存6个月;B3组:组织工程骨在-196℃保存3个月;B6组:组织工程骨在-196℃保存6个月。2个对照组(右前肢植入材料):C组:组织工程骨未行低温保存;D组:单纯生物衍生骨材料。于术后2、4、6和12周行大体和组织学观察,并于6周和12周行X线片检查和生物力学检测。结果术后大体观察,A3、A6、B3、B6和C组间无显著差异,D组骨痂少且断端更为明显。各时间点组织学观察,A3、A6、B3、B6和C组植入材料周围胶原及骨痂均较D组明显,术后12周组织学评分,D组与其它各组比较P值<0.05。X线片示D组植入材料皮质骨无明显变化,骨痂较少;余各组12周植入材料与自体骨融合,髓腔开通,骨折线消失,塑形好。生物力学检测D组与其它各组比较P值<0.05。结论以4℃和-196℃保存方法能有效保存组织工程骨,对修复骨缺损有明显效果,这一方法适宜推广应用。     

BMSCs来源成骨细胞和内皮细胞复合壳聚糖-羟基磷灰石多孔支架构建血管化组织工程骨研究

目的探讨大鼠BMSCs来源的成骨细胞和内皮细胞复合壳聚糖-羟基磷灰石多孔支架植入大鼠桡骨缺损处的成骨作用和成血管作用。方法取分离培养至第3代的SD大鼠BMSCs行成骨和成内皮细胞诱导并鉴定。分别将内皮细胞(A组)、成骨细胞(B组)、混合细胞(成骨细胞和内皮细胞比例为1∶1,C组)均匀滴加于壳聚糖-羟基磷灰石多孔支架上制备3组细胞-支架复合物,MTT检测支架内细胞增殖活性。取2月龄雄性SD大鼠30只,制作大鼠桡骨5 mm长缺损模型并分别植入3组细胞-支架复合物(n=10)。术后4、8、12周分别取移植物行HE染色观察,CD34免疫组织化学染色计数微血管密度,RT-PCR法检测骨桥蛋白(osteopontin,OPN)和骨保护素(osteoprotegrin,OPG)mRNA表达。结果 BMSCs成骨诱导7 d后ALP染色可见细胞质内蓝染颗粒,细胞核呈红染;内皮细胞诱导14 d后,CD34免疫细胞化学染色可见细胞内棕色颗粒。MTT检测示3组细胞活性随时间延长逐渐升高。HE染色示,术后12周A组未见明显类骨质形成,而有较密集的微血管结构及较多纤维组织形成;B、C组可见均质的类骨质,呈条索状和岛状分布,可见大量成骨样细胞存在。术后各时间点A、C组微血管密度均显著高于B组(P<0.05);A组术后12周微血管密度高于C组(P<0.05),其余2个时间点A、C组间差异无统计学意义(P>0.05)。A组3个时间点OPN和OPG mRNA表达水平均较低,与B、C组比较差异有统计学意义(P<0.05);B、C组分别于术后8、12周OPN mRNA表达达峰值,4周时OPG mRNA表达达峰值。结论 BMSCs来源的成骨细胞和内皮细胞按1∶1比例共培养于壳聚糖-羟基磷灰石多孔支架作为组织工程骨移植物,可以促进大鼠桡骨缺损部位骨的形成和血管化,促进骨缺损愈合。     

组织工程化人工骨血管化研究

目的 比较三种促进组织工程化人工骨体内血管化方法的效果及研究血管化与成骨的相关关系。方法 将HA/β-TCP与PDLLA形成复合支架材料，再复合Ⅰ型胶原、rhBMP-2，与成骨细胞联合培养，仿生制备成组织工程化人工骨，采用包裹带血管蒂筋膜，复合血管内皮细胞或两者联合的促血管化手段。将人工骨修复兔桡骨干骨膜-骨完全缺损，手术后4、8、12周，观察移植物组织学，体视学方法观察血管化，成骨作用及其两者的关系。结果 3种方法均有促血管作用。其优劣依次为；材料包裹带血管蒂筋膜及复合血管内皮细胞大于材料单纯复合血管内皮细胞，后者又大于材料单纯包裹带血管蒂筋膜，术后4周为快速血管化阶段。4-8周间血管化有平缓发展，12周完全血管化，血管化与新骨生成数量成正相关。结论 促血管化手术对组织工程化人工骨移植修复骨缺损的效果起重要促进作用。     

比较带蒂筋膜瓣包裹接种自体红骨髓的组织工程骨修复骨缺损时促血管化成骨与膜诱导成骨作用

目的比较带蒂筋膜瓣包裹组织工程骨在修复骨缺损时促血管化成骨与膜诱导成骨的作用,为临床修复骨缺损提供参考依据。方法采用兔自体红骨髓(autologous red bone marrow,ARBM)及含重组人BMP-2的骨诱导活性材料构建组织工程骨。将4～5月龄新西兰大白兔60只(体重2.0～2.5 kg),随机分为A、B、C 3组,A组16只,B、C组各22只。制备长1.5 cm的右尺骨长段骨-骨膜完全缺损模型,A组于骨缺损处植入组织工程骨;B、C组在骨缺损邻近处制备一筋膜瓣包裹组织工程骨后植入骨缺损,B组将筋膜瓣蒂部切断形成游离筋膜瓣,C组为带蒂筋膜瓣。术后4、8、12、16周,每组随机取4只实验动物,取骨缺损区组织进行大体观察、组织学及免疫组织化学染色观察;8、12、16周B、C组各另取2只实验动物行腋动脉墨汁灌注观察。结果大体观察示,术后4、8周A组有纤维结缔组织形成,B、C组筋膜瓣形成类似骨膜样纤维组织,其中B组有软骨样组织形成,C组有新生骨形成;12、16周A组骨痂形成少,B组新生骨较多,C组骨干形成。组织学观察示,术后4、8周A、B组新生血管和骨小梁极少,C组血管丰富且成熟骨小梁及软骨组织形成;12、16周A组新生血管及骨小梁仍较少,B组血管数量较多且成熟骨小梁显著增加,髓腔结构形成但闭阻;C组血管数量减少,成熟骨结构形成,骨髓腔再通。免疫组织化学染色示,C组各时间点CD105、CD34、Ⅷ因子表达均高于A、B组。骨形态计量分析显示,术后各时间点C组新生骨小梁体积明显大于A、B组(P<0.05);A、B组间除4周差异无统计学意义(P>0.05)外,其余时间点差异均有统计学意义(P<0.05)。血管图像分析显示术后各时间点C组骨修复区内血管再生面积比值明显大于A、B组(P<0.05)。墨汁灌注检查示,各时间点B组成骨区为稀疏的墨染区;C组成骨区墨染数量多且较密集,8周达高峰,之后逐渐减少。结论 带蒂筋膜瓣包裹复合自体ARBM的组织工程骨,早期以促血管化成骨作用占主导地位,后期血管化成骨作用逐渐消失,以膜诱导成骨作用为主。     

组织工程骨低温保存后修复兔骨缺损的影像及形态学分析

目的 探讨低温保存的组织工程骨修复兔骨缺损的能力以及低温保存组织工程骨的可行性。方法 将人源性生物衍生骨材料复合成骨细胞构建的组织工程骨，在4℃和-196℃的温度环境中保存3个月和6个月，同时以未行低温保存的组织工程骨和生物衍生骨材料作为对照，分别修复实验兔桡骨的长段骨缺损，于术后2、4、6、12周时行大体和组织学观察，并于6、12周行x线检查。结果 4℃和．196℃的温度保存组和未行低温保存的组织工程骨组在动物体内相同时间点影像学和形态学观察无明显区别，低温保存3个月与6个月组在动物体内相同时间点影像学和形态学无明显区别；组织工程骨各组与单纯生物衍生骨材料组比较，前者在骨缺损处产生更多的胶原与新骨，其修复骨缺损是通过多点方式成骨，成骨迅速，骨愈合更快；而单纯生物衍生骨材料组从两端“爬行替代”方式成骨；所有各组无明显排斥反应。结论 本研究采用的低温(4℃和一196℃)保存方法均能有效保存组织工程骨，从影像学和形态学研究证实该保存方法是有效可行的。     

复合血管生成素1基因及富血小板血浆的组织工程骨修复桡骨骨缺损

目的探讨以β磷酸三钙(β tricalcium phosphate,β-TCP)为支架,复合富血小板血浆(platelet-rich plasma,PRP)和转染血管生成素1(angiopoietin1,Ang-1)基因的组织工程骨修复节段性骨缺损的能力。方法取兔股骨骨髓分离培养BMSCs,将Ang-1基因通过慢病毒转染至第2代BMSCs,转染后48h接种于β-TCP上培养,然后复合0.5mLPRP,制备复合PRP的组织工程骨。取20只3月龄新西兰大白兔制备双侧桡骨15mm骨缺损模型,采用自身对照,分别于每只动物左侧和右侧骨缺损处植入未转染Ang-1基因的组织工程骨(对照组)及转染Ang-1基因的组织工程骨(实验组)。术后行大体观察,于2、4、8、12周行X线片观察,取材行HE染色、免疫组织化学染色及生物力学检测。结果细胞转染48h后转染效率>90%,通过RT-PCR检测到转染细胞内Ang-1基因表达显著增高。术后所有动物患肢活动良好。X线片观察示实验组术后4周骨缺损处已有骨痂形成,8周有部分骨性愈合,12周骨缺损处完全骨性愈合;对照组至术后12周时无骨性愈合。HE染色示实验组术后8周有毛细血管出现,12周大量毛细血管生长于新生骨中;对照组8周未见新生毛细血管,12周见少量毛细血管。术后8、12周实验组微血管密度分别为(50.1±7.8)个/mm2和(66.1±3.5)个/mm2,对照组分别为0和(30.3±7.2)个/mm2;术后12周两组间比较差异有统计学意义(Z=—2.107,P=0.031)。免疫组织化学染色观察示术后8周实验组仍有Ang-1分泌。生物力学测试结果显示术后12周实验组三点弯曲试验和压缩试验的最大负荷均显著高于对照组(P<0.05)。结论复合PRP和转染Ang-1基因的组织工程骨修复兔桡骨节段性骨缺损后,组织工程骨内可形成新生血管,促进骨愈合。     

藻酸钙凝胶-成骨细胞-骨粉构建工程化骨修复兔颅骨缺损的实验研究

目的探讨藻酸钙凝胶、成骨细胞、骨粉复合构建的可塑形组织工程骨修补兔颅骨缺损后的形态学变化和成骨效果.方法28只日本大耳白兔,随机分为A(n=20)、B(n=8)两组,手术在兔颅顶骨矢状缝两侧分别各建立一个直径1cm的圆形全层缺损,用两种方法藻酸钙凝胶、成骨细胞、骨粉和藻酸钙凝胶、骨粉分别构建组成可塑形的组织工程骨复合材料,分别填补修复A组兔颅骨左右两侧的缺损,B组为空白对照组,通过大体、组织学、X线观察材料的形态变化、成骨情况,并对X线片和组织学切片进行评分.结果材料植入后,局部未见红肿、积液、渗出等异常反应.①藻酸钙凝胶-成骨细胞-骨粉组修补后12周颅骨缺损基本被硬性组织所修复,镜下见修复材料大多被骨组织替代,骨粉基本被吸收,有块状凝胶残留其中,组织学评分为(5.50±1.00).X线片见兔颅骨缺损处有高密度骨痂影存在,布满整个缺损区,X线片评分为(3.25±0.95).②藻酸钙凝胶-骨粉组修补后12周部分颅骨缺损被硬性组织所修复,镜下见修复材料部分转变成骨组织,骨粉基本被吸收,有凝胶残留其中,组织学评分为(3.25±1.50).X线片见兔颅骨缺损处有高密度骨痂影存在,主要分布在缺损区的边缘部位,X线片评分(2.25±0.25).③空白对照组骨缺损主要被膜样纤维组织修复,在紧邻骨缺损边缘处有硬性组织形成,镜下见修复组织边缘有骨组织存在,中央大部为膜状致密纤维组织,组织学评分为(1.50±0.50),X线片仅见靠近骨缺损边缘的部位存在致密骨痂影,X线片评分为(1.00±0.57).结论藻酸钙凝胶、成骨细胞、骨粉构建的可塑形组织工程骨可根据颅骨缺损的形态进行塑形填补,在体内有良好的成骨能力,可达到对兔颅骨缺损的骨性修复,但部分藻酸盐凝胶吸收缓慢,手术后12周仍不能满意吸收.     

恒河猴体内组织工程骨血管化监测的实验研究

目的探讨不同方法监测组织工程骨血管化的优缺点,寻找较好的监测方法。方法在13只成年恒河猴的25侧胫骨上制备2cm的骨膜与骨缺损模型,根据骨缺损充填材料不同随机分为五组(每组5侧),A组：β-磷酸三钙(β-TCP) 骨髓基质下细胞(BMSCs) 血管束；B组：β-TCP 血管束；C组：β-TCP BMSCs；D组：β-TCP；E组：空白对照。术后4、8、12周行磁共振灌注成像检查并计算信号强度-时间(SI-T)曲线的最大线性斜率(SS_(max))和基线值(SI_(baseline)),拍摄恒河猴胫骨X线片并计算其透光度,行放射性核素骨显像检查并计算摄取比值,同时进行组织学检查。结果术后4、8、12周A组的SS_(max)值最高,术后8周与4周相比SS_(max)有较大幅度的提高(P=0．003)。术后12周A组5个样本的SS_(max)与X线片透光度呈负相关(rs=～0．892,P=0．042),与血管面积比值呈正相关(rs=0．894,P=0．041)。结论SI-T曲线的SS_(max)能够准确地反映组织工程骨的血管化情况,磁共振灌注成像检查具有无创、无辐射、高灵敏度和定量分析的优点。     

组织工程骨对羊节段性骨缺损的修复

目的探讨自体骨髓间充质干细胞(MSCs)复合生物活性陶瓷材料β磷酸三钙(TCP)修复羊跖骨节段性缺损的能力。方法将24只成年中国美利奴绵羊随机分成3组，制备单侧跖骨21mm长节段性缺损，缺损分别采用相应方法修复：材料 细胞组，缺损区植入β-TCP MSCs复合体(n=10)；单纯材料组，缺损区植入单纯β—TCP(n=10)；空白组，缺损区不作处理(n=4)。术后1、3和6月处死动物并取材，做大体形态学、组织学、X线检查。结果术后6月检查结果显示，在材料 细胞组，骨生成能力明显强于单纯材料组；而空白组仅在骨折断面处生成少量松质骨，骨缺损不能修复。结论生物活性陶瓷β—TCP与MSCs结合能明显提高骨生成速度，在修复长骨干节段性缺损方面具有潜在的临床应用价值。     

组织工程骨联合外固定修复大鼠股骨节段性骨缺损

目的 观察以外固定器固定,骨髓间充质干细胞 (BMSCs) 联合双相磷酸钙(BCP)修复大鼠股骨节段性骨缺损的效果.方法 A组:BMSCs与BCP复合植入缺损区;B组:BCP植入缺损区;C组:空白组.定期摄X线片,术后12周取材.结果 A组随时间延长X线评分递增,12周时平均为4.17分,B组为1.18分,C组为1.08分,差异有统计学意义(P<0.05).组织学检查见A组缺损区有大量的新生骨生成,而B、C组无新生骨生成.A组的抗压刚度和扭转刚度分别为(8.09±2.42)N/mm、(1.89±0.72)Nmm/deg;B组为(1.75±0.90)N/mm、(0.40±0.21)Nmm/deg,差异有统计学意义(P<0.05).结论 组织工程骨联合外固定可以修复节段性骨缺损.

Abstract：

Objective To evaluate the efficacy of bone mesenchymal stem cells (BMSCs) combined with biphasic calcium phosphate (BCP) repair of segmental bone defect, which was stabilized with an adaptable external fixation system.Methods In group A, the femoral defect was filled with BCP combined with BMSCs; In group B, the femoral defect was filled with BCP, and in group C, defects were left empty. Animals were sacrificed 12 weeks post-operation.Results In group A, radiographic scores were average 4.17, significantly (P<0.05) greater than in group B (1.18) and group C (1.08). Histological evaluations displayed the bridging of the defect in group A, with remarkable new bone formation. In contrast, group B and group C showed no formation of new bone. The mechanical testing revealed that axial stiffness was (8.09±2.42) N/mm and torsional stiffness was (1.89±0.72) Nmm/deg in group A, and those in group B were (1.75±0.90) N/mm and (0.40±0.21) Nmm/deg respectively. There was significant difference in biomechanical tests between group A and group B (P<0.05).Conclusion External fixator combined with tissue engineered bone can repair segmental bone defect.     

低温保存对组织工程骨特性影响的实验研究

目的 了解不同低温保存方法对组织工程骨支架生物特性和成骨细胞功能的影响。方法 组织工程骨分别在4℃和-196℃环境下保存3，6个月，以未行保存的组织工程骨和单纯生物衍生骨作为对照。实验分为7组，组织工程骨4℃保存3个月为A3组，保存6个月为A6组，-196℃保存3个月为B3组，保存6个月为B6组，未行保存的组织工程骨为C组，单纯生物衍生骨组为D组，新鲜人体骨为S组（仅作生物力学）。观察细胞的黏附与生长，并行材料的生物力学、碱性磷酸酶活性（ALP）、细胞表面的整合素α2β1表达量、Ⅰ型胶原、钙化能力和成骨细胞成活率等检查。结果 所有组织工程骨各组均可见成骨细胞在材料表面黏附，细胞在材料孔隙内生长、分化和增殖；材料的力学性能检测显示A3、A6、B3、B6、D组各组间最大载荷比较，差异无统计学意义（P〉0．05）；A3、A6、B3、B6、D组分别与S组比较，差异有统计学意义（P〈0．05）；各组成骨细胞ALP活性、细胞表面的整合素α2β1表达量、Ⅰ型胶原、钙化能力和成骨细胞成活率依次为C组〉B3组〉B6组〉A3组〉A6组。结论 4℃保存方法和-196℃保存方法对生物衍生骨的生物力学性能无明显的影响。4℃保存方法和-196℃保存方法对细胞的存活率和细胞的生物活力有明显的影响，但均能在一定程度上保存细胞的存活率和的细胞的生物活力。-196℃保存方法优于4℃保存方法，但4℃保存方法操作简单、方便和经济。