用显微注射法建立转bcl—x1基因小鼠

建立转bcl-x1基因小鼠，继而传代建系，用于缺血性脑血管疾病的研究。采用显微注射法，将人bcl-x1基因注入昆明小白鼠受精卵获得子代鼠,然后作PCR，Southern-blot,mRNA,Western-blot检测以获得阳性鼠。实验中注射受精卵1654枚，移植卵数1448枚，受体鼠49只，怀孕鼠7只，子代鼠13只，整合数4只并均有表达，植入受精卵的存活率83％，受精卵的总存活率0．78％，移植鼠的怀孕率14．3％，整合效率30．7％，总有效率为0．24％。初步获得了转bcl-x1基因小鼠。     

用显微注射法建立转bcl-x_l基因小鼠

建立转bcl xl基因小鼠 ,继而传代建系 ,用于缺血性脑血管疾病的研究。采用显微注射法 ,将人bcl xl基因注入昆明小白鼠受精卵获得子代鼠 ,然后作PCR ,Southern blot ,mRNA ,Western blot检测以获得阳性鼠。实验中注射受精卵 16 5 4枚 ,移植卵数 14 4 8枚 ,受体鼠 4 9只 ,怀孕鼠 7只 ,子代鼠 13只 ,整合数 4只并均有表达 ,植入受精卵的存活率 83% ,受精卵的总存活率 0 .78% ,移植鼠的怀孕率 14 .3% ,整合效率 30 .7% ,总有效率为 0 .2 4 %。初步获得了转bcl xl基因小鼠     

转突变型淀粉样蛋白前体双荧光融合基因阿尔茨海默病小鼠模型的建立及初步鉴定

目的 探索建立转突变型淀粉样蛋白前体(APP)双荧光融合基因(CFP-54 bp-YFP-C99)转基因小鼠模型的可行性和基因整合效率.方法 采用显微注射法,将构建的突变型APP双荧光融合基因注入昆明小白鼠的受精卵,获取子代鼠,通过聚合酶链反应(PCR)方法初步鉴定基因的整合情况,以获得阳性鼠.结果 注射昆明小白鼠受精卵共2202枚,移植1806枚.受体鼠56只,怀孕鼠13只,共生产52只子代鼠,其中存活32只.PCR初步检查整合有突变型APP双荧光融合基因的阳性鼠2只,均为活鼠.移植鼠的总怀孕率为23.2%(13/56),突变型APP双荧光融合基因的整合效率为3.9%(2/52).结论 显微注射法建立转突变型APP双荧光融合基因的阿尔茨海默病小鼠模型是可行的,但转基因效率较低.     

视神经脊髓炎转基因(2D2)鼠的繁殖和鉴定

目的建立视神经脊髓炎转基因(2D2)小鼠的繁育方法,并对其子代鼠进行基因鉴定。方法将雌雄2D2转基因小鼠各1只与C57BL/6野生型小鼠(1∶1)进行交配,由鼠尾血提取基因组DNA,应用PCR技术扩增,电泳后观察2D2转基因传代小鼠的基因表型。结果共繁育产生56只子代小鼠,其中36只子代小鼠基因组DNA扩增出657bp的2D2条带,阳性率为64.3%。结论成功利用杂交方式有效繁殖2D2转基因鼠和应用PCR技术进行基因鉴定,为后续视神经脊髓炎的实验研究奠定了基础。     

基于一个伴发脑血管狭窄的NF1家系的点突变小鼠建模

目的利用CRISPR/Cas9技术构建Nf1基因Q181X定点突变的小鼠模型,为研究该点突变与脑血管狭窄的关系提供实验工具。方法根据Nf1基因点突变的位置和基因组结构设计针对Nf1基因Q181X位点的g RNA,经活性检测后,将有活性的gRNA、Cas9 mRNA以及含有点突变序列的donor DNA通过显微注射到小鼠受精卵中,并移植至假孕鼠体内。获得F0代小鼠后,通过PCR和基因测序技术对Nf1基因进行检测和鉴定。对所获的F0代基因突变阳性小鼠继续繁育后获得F1、F2代目标基因阳性小鼠。结果成功构建Nf1-Q181X基因点突变F0代杂合型小鼠3只,F1代杂合型小鼠2只,F2代杂合小鼠6只,经PCR及基因测序鉴定可稳定遗传Nf1-Q181X点突变。结论 H通过CRISPR/Cas9技术成功获得Nf1基因Q181X点突变小鼠模型,为研究该特定点突变与脑血管异常的关系提供了实验工具。     

Sca-1+造血干/祖细胞重建致死剂量辐射小鼠造血功能的作用**☆

背景：近年来,造血干细胞移植在国内外已广泛开展,移植的造血干细胞能否有效重建造血成为造血干细胞移植领域的研究热点问题之一。 目的：观察Sca-1+造血干/祖细胞(hematopoietic stem/progenitor cell,Sca-1+HSC/HPC)对造血衰竭小鼠造血功能重建的作用。 方法：雌性C57BL/6受体鼠给予致死剂量60Coγ射线照射后分2组,对照组：输注无菌PBS;移植组：移植免疫磁性分选法分离纯化的同系雄性C57BL/6小鼠Sca-1+HSC/HPC;检测受体鼠生存时间;外周血白细胞、红细胞比容、血小板的变化;脾湿质量及脾集落数;PCR检测Y染色体(Sry基因)表达确定受体小鼠重建造血的细胞来源。 结果与结论：移植组受体鼠30 d存活率、白细胞、红细胞比容、血小板、脾湿质量及脾集落数均明显高于对照组(P < 0.05);Y染色体PCR分析,证实雌性受体小鼠重建造血的细胞来源于雄性供体。提示Sca-1+HSC/HPC移植后能重建造血衰竭小鼠造血功能。     

移植物化学修饰减轻小鼠半相合骨髓移植后的急性移植物抗宿主病

背景: 甲氧基聚乙二醇是一种无免疫原性的兼性聚合分子，可以共价结合方式修饰各种蛋白质，减少其免疫原性。因此，在进行半相合造血干细胞移植时，若能用甲氧基聚乙二醇对移植物的T细胞进行化学修饰，阻断其激活的途径，就可能减轻移植物抗宿主病反应，提高移植成功率。 目的：构建小鼠半相合骨髓移植模型，观察甲氧基聚乙二醇修饰移植物对小鼠H2半相合骨髓移植后移植物抗宿主病的影响。 设计、时间及地点：随机化配对设计实验，于2003-03/11在解放军总医院医学动物实验中心和小儿内科实验室完成。 材料：纳入20只8~10周龄雄性近交系BALB/cH-2d小鼠作为供鼠，60只8~10周龄杂交获得的雌性CB6 F1 代H-2d/b小鼠作为受鼠。甲氧基聚乙二醇为美国Sigma公司产品。 方法：常规制备供鼠骨髓及脾细胞混合悬液。受鼠行总剂量8.0 Gy 60Co γ射线全身均匀照射，照射后随机分为3组，每组20只。照射对照组每只受鼠经尾静脉输入RPMI-1640培养基0.5 mL，单纯移植组照射后12 h内经尾静脉输入未处理的半相合供鼠骨髓及脾细胞混合悬液0.5 mL，修饰移植组照射后12 h内经尾静脉输入甲氧基聚乙二醇修饰的半相合供鼠骨髓及脾细胞混合悬液0.5 mL。 主要观察指标：移植后观察动物存活率、急性移植物抗宿主病理表现及存活小鼠的染色体核型。 结果：照射对照组小鼠均在2周内死亡；修饰移植组小鼠30 d存活率显著高于单纯移植组（75%，40%，χ2=5.01，P=0.025）。取死亡小鼠的爪垫皮肤、肝及小肠肠管作病理组织学检查，修饰移植组急性移植物抗宿主病病理表现减轻，Thomas 病理分级轻于单纯移植组。移植后75 d应用染色体C带显色法检测存活受鼠的嵌合体，证实为完全供者型植入。 结论：甲氧基聚乙二醇修饰移植物可明显减轻急性移植物抗宿主病，提高半相合骨髓移植存活率。     

杆状病毒修饰后的脂肪干细胞移植治疗mdx鼠的实验研究

目的利用经杆状病毒基因载体系统进行micro-dystrophin基因修饰后的脂肪干细胞(ADSCs)移植治疗Duchenne型肌营养不良症模型(mdx)鼠,探讨ADSCs移植治疗DMD的安全性及可行性。方法 Mdx鼠60只,分为mdx对照组(30只)和mdx移植组(30只);正常C57小鼠为C57对照组(30只)。体外分离培养小鼠ADSCs,利用杆状病毒基因载体进行micro-dystrophin基因修饰;将基因修饰后的ADSCs经尾静脉移植到mdx鼠体内。于移植后检测mdx鼠的运动功能(采用主动牵引实验和被动转棒实验)、血清CK水平、肌肉病理改变以及肌肉micro-dystrophin表达水平。结果经micro-dystrophin基因修饰的ADSCs移植后,能够重建mdx鼠的micro-dystrophin表达,一定程度上减轻并逆转肌肉的病理损害,进而降低血清CK水平,mdx鼠整体运动功能也有一定改善。结论 ADSCs治疗mdx鼠后,可部分重建模型鼠的dystrophin表达,改善肌肉的病理损害,表明ADSCs是有希望治愈DMD的方法之一。     

热休克反应及热休克因子1对慢性心理应激小鼠探索行为的保护作用及其机制

目的采用热休克因子1(HSF1)基因敲除小鼠模型,探讨HSF1基因及热休克预处理在慢性心理应激中对小鼠探索行为的保护作用,以及其机制是否与CA1区神经元凋亡有关。方法选取HSF1基因野生型小鼠40只和HSF1基因敲除小鼠36只,均随机分为热应激组、心理应激组、热应激加心理应激组和对照组,除对照组外各组给予相应的应激措施2个月,热应激加心理应激组小鼠在暴露于慢性心理应激前给予热休克预处理。2个月后检测各组小鼠高架十字迷宫中总探索次数、简易迷津探索格数及小鼠海马CA1区神经元的凋亡。结果野生型小鼠和基因敲除小鼠中心理应激组高架十字迷宫中总探索次数、简易迷津探索格数均较对照组减少(P0.05)。野生型小鼠热应激加心理应激组高架十字迷宫中总探索次数、简易迷津探索格数均较心理应激组多(P0.05),而基因敲除小鼠中不存在这一差异(P0.05)。基因敲除小鼠心理应激组CA1区海马神经元凋亡数目多于对照组(P0.05)。在全部76只小鼠中进行分析,小鼠高架十字迷宫总探索次数、简易迷津探索总格数与CA1区神经元凋亡负相关(r=-0.50,P0.01;r=-0.51,P0.01)。结论热应激预处理通过HSF1基因,抑制慢性心理应激所致探索行为减少,热应激预处理及HSF1基因对CA1区神经元的内源性保护作用可能是维持小鼠探索行为的重要机制。     

卵黄囊移植人脐血CD34+细胞构建人源化血液系统小鼠模型

背景：与较为成功的羊等大型动物宫内移植方法相比，利用小鼠等小型动物宫内移植异种造血干细胞仍面临困境，在外周血内检测到的异种血液细胞重建率仍在1%以下。 目的：观察小鼠卵黄囊移植人脐血来源CD34+造血干细胞后的异种造血重建效率，并与腹腔移植的效果进行比较。 设计、时间及地点：细胞学体内移植实验，于2007-10在北京大学干细胞与再生生物学实验室完成。 材料：健康新生儿脐血取自北京海淀区妇幼保健院。ICR小鼠由北京大学医学部实验动物中心提供，孕8.5 d鼠8只，孕 12.5 d鼠9只。藻红蛋白标记的抗人CD45单克隆抗体与流式细胞仪均为BD公司产品。 方法：采用Ficol1法梯度离心获得人脐血单个核细胞，经磁珠分选系统纯化获得CD34+细胞。将孕8.5 d鼠麻醉后，打开腹腔并暴露子宫，显微镜下抽取5~10 μL脐血CD34+细胞（5×104个），缓慢注入胎鼠的卵黄囊中。相同操作条件下将等量脐血CD34+细胞注射到孕12.5 d胎鼠的腹腔中。快速抽针，将孕鼠子宫归位并缝合腹腔，继续妊娠，等待分娩。待小鼠出生后3个月，经尾静脉取血，在避光状态下加入藻红蛋白标记的抗人CD45单克隆荧光抗体，流式细胞仪检测血细胞表面标记CD45的表达，通过其阳性率判断人血液细胞在小鼠体内的重建效果。 主要观察指标：不同移植方式对小鼠造血重建的影响。 结果：CD34+细胞通过卵黄囊移植方式共获得健康出生小鼠52只，3个月后86.5%（45/52）小鼠CD45呈阳性表达，嵌合率高达4.34%。通过腹腔移植方式共获得健康出生小鼠48只，3个月后81.3%（39/48）小鼠CD45呈阳性表达，明显低于卵黄囊移植方式（t=2.363, P < 0.05）。 结论：早期卵黄囊移植可以获得人造血干细胞在小鼠体内的长期重建，效果优于腹腔移植，同时也证明了通过胎鼠卵黄囊移植人脐血造血干细胞取得人源化造血系统小鼠模型的可行性。