金葡菌TG-TPase嵌合基因在甲醇营养型酵母中的表达

目的 设计耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)耐药相关TG-Tpase嵌合基因,构建其真核表达质粒,为嵌合基因的高效、分泌型表达奠定基础.方法 在序列结构分析的基础上,设计引物从MRSA菌株中扩增其耐药性相关转糖基酶(Tgase)和转肽酶(Tpase)活性片段,进一步用酶切连接等分子生物学操作构建TG-Tpase嵌合基因,亚克隆至酵母表达质粒pPIC9K中,转化DH5a大肠埃希菌.经酶切、PCR和核苷酸测序鉴定正确的重组质粒用Sal I线性化,整合入甲醇营养型毕赤酵母GS115中,在DNA和基因转录水平鉴定出阳性重组酵母.结果 采用PCR从MRSA基因组中扩增得到了873 bp的Tgase片段和1 044 bp的Tpase片段.以酶切连接构建的TG-Tpase嵌合基因经酶切、PCR鉴定,能获得约1 900 bp的融合片段,与预期结果 相符,测序表明序列和阅读框均正确.线性化的重组质粒转化GS115后,得到5个高拷贝阳性转化子,经诱导表达和PCR鉴定,这些转化子能转录出目的基因的mRNA.结论 成功构建了含TG-Tpase嵌合基因的重组毕赤酵母工程菌,为进一步高效制备嵌合蛋白、进而利用其酶学活性进行抗耐药性金葡菌抑制剂的筛选创造前提.     

毕赤酵母表达肽抗生素hPAB-β的纯化

目的 在成功构建肽抗生素hPAB-β重组毕赤酵母的基础上,深入探讨酵母表达hPAB-β的规模化纯化方法.方法 采用高密度发酵法在3.7L发酵罐中对pPIC9K-hPAB-β/GS115优5重组菌株进行发酵,收集发酵液,依次采用W-UF-II过滤系统超滤、反相层析、阳离子交换、分子筛层析等纯化技术对目标表达产物逐级进行纯化,目的 蛋白用15%的Tricine-SDS-PAGE电泳进行跟踪分析.最终纯化产物的生物学活性用平板琼脂扩散法进行测定.结果 在培养至工程菌菌体湿重约200~250g/L时,以甲醇诱导培养基诱导目的 蛋白表达,48h后菌体湿重达280g/L,目标产物表达量约75mg/L.发酵液经Mr10000膜超滤,达到去除大部分酵母色素和浓缩样品的目的 (体积浓缩约2/3).再经反相层析、离子交换、分子筛层析纯化,最终目的 产物的纯度达98%以上,得率达32.5%.且纯化的目的 蛋白具有良好的杀灭金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的活性.结论 酵母表达肽抗生素hPAB-β经膜超滤、反相层析、离子交换和分子筛层析四步纯化,实现了去除非目的 蛋白、酵母色素及脱盐的目的 ,为规模化制备hPAB-β创造了前提.     

人组织因子途径抑制因子在毕赤酵母中高拷贝表达

目的 构建高拷贝表达重组人组织因子途径抑制因子的毕赤酵母并对蛋白表达条件进行初步优化,为相关研究奠定基础.方法 将PCR扩增得到的TFPI cDNA片段与表达质粒pPIC9K连接构建重组质粒rhTFPI-pPIC9K,采用PCR方法及DNA测序对其进行鉴定.将重组质粒转化酵母细胞GS115,利用G418抗性实验筛选含有...     

鸡IL-18在毕赤酵母中的表达与活性分析

目的:在毕赤酵母中表达鸡白介素18,并鉴定其活性.方法:应用PCR技术从重组质粒pMD18-T-ChIL-18中扩增出鸡IL-18成熟肽基因,亚克隆于毕赤酵母表达载体pPICZαA上,构建重组质粒pPICZαA-ChIL-18.经酶切、PCR和测序鉴定正确后,电转化入毕赤酵母菌X-33,筛选多拷贝单克隆进行诱导表达.表达产物纯化后用Western blot、ELISA和淋巴细胞转化试验分析其生物学活性.结果:重组菌正确表达了具有免疫原性的鸡IL-18,经分析该rchIL-18具有诱导淋巴细胞分泌γ干扰素和刺激淋巴细胞增殖的活性.结论:成功的在毕赤酵母中表达了具有生物活性的鸡IL-18.     

人补体受体1型SCR1-3功能域基因的克隆表达及生物活性鉴定

目的实现人补体受体1型功能域SCR1-3基因的克隆、表达及生物学活性鉴定。方法从人外周血中提取总RNA,通过逆转录获得cDNA,PCR扩增获得编码CR1-SCR1-3基因序列;克隆到毕赤酵母分泌表达质粒pPIC9K,构建重组质粒pPIC9K-CR1-SCR1-3,菌落PCR、双酶切鉴定后测序;线性化重组质粒电转化毕赤酵母KM71基因组中,经菌落PCR技术筛选在G418平板上生长的多拷贝阳性转化子;摇瓶发酵和甲醇诱导,SDS-PAGE和Western-blot鉴定目的蛋白表达;镍柱亲和层析纯化目的蛋白;用体外抑制补体溶血反应实验测定目的蛋白的生物活性。结果获得了人CR1-SCR1-3编码区序列,测序结果与与GenBank中的相应序列一致;SDS-PAGE和Western-blot表明目的基因在毕赤酵母中实现了分泌表达;体外实验证实经纯化后的CR1-SCR1-3能够明显抑制补体溶血。结论成功构建重组表达质粒pPIC9K-CR1-SCR1-3,在毕赤酵母中实现了CR1-SCR1-3的分泌表达,该蛋白具有较高的抑制补体生物活性。     

BPIm23重组抗菌蛋白在巴斯德毕赤酵母中的分泌表达

目的：采用巴斯德毕赤酵母表达系统表达分泌型功能性rBPIm23抗菌蛋白。方法：利用构建的pUC18-synBPI414质粒和PBV220-BPIm120质粒，按分子克隆方法构建pPICZa-synBPIm600重组表达载体；用线性化pVICZa-synBPIm600质粒电转化Pichia pastoris GS115，筛选抗性转化子，进行PCR和Mut表型鉴定；用甲醇诱导目的蛋白rBPIm23的表达；用离子交换层析纯化rBPIm23，并进行SDS-PAGE分析、Western blot鉴定和用BCA法定量。结果：①成功构建了pPICZa-synBPIm600重组表达载体；②获得稳定整合目的基因的GS115菌株；③表达产物相对分子量约为23kD，可与抗BPI抗体特异性结合；④培养上清液中目的蛋白表达量约为2.9mg／L。结论：BPIm23重组抗菌蛋白在毕赤酵母GS115中得到分泌表达。     

人源性抗角蛋白单链抗体在巴氏毕赤酵母的分泌表达

目的：用巴氏毕赤酵母表达人源性抗角蛋白单链抗体。方法：从已构建好的质粒p3MH／ScFv中亚克隆目的片段ScFv并插入酵母表达载体p^PIC9K，构建成重组质粒p^PIC9K／ScFv，并测序鉴定。通过电转将重组质粒p^PIC9K／ScFv整合到巴氏毕赤酵母菌GS115的染色体上。经G418筛选得到高拷贝转化子及Mut表型鉴定后，用含0．5％甲醇的培养基诱导其分泌表达。结果：通过6天的诱导，该系统成功表达了抗角蛋白单链抗体，Western blot实验证实表达产物具有特异性。结论：获得了真核表达的抗角蛋白单链抗体，为其应用研究打下了基础。     

异亮氨酸拉链修饰的可溶性CD40L在巴斯德毕赤酵母中的表达

为了获得异亮氨酸拉链修饰的可溶性CD40L（IZ—sCD40L）在巴斯德毕赤酵母中的分泌表达。首先用PCR和重叠PCR的方法得到了IZ—sCD40L基因片段。然后构建了巴斯德毕赤酵母表达质粒pPICZaA—IZ—sCD40L．核酸测序分析表明IZ—sCD40L的基因片段正确克隆到pPICZaA质粒中。将其线性化后。电转化到巴斯德毕赤酵母GS115中，PCR筛选阳性重组菌株，经表型鉴定后，用甲醇进行诱导表达。经SDS—PAGE和Western blot印迹杂交结果证实了表达产物为重组IZ—sCD40L的融合蛋白。     

融合基因EGFRi-IL-24真核表达载体的构建与表达

人工合成表皮生长因子受体干扰序列(epithelial growth factor receptor interference,EGFRi),应用重叠延伸PCR(Overlapping PCR)技术将其与白细胞介素-24(IL-24)连接,并在其间引入一段柔软短肽(Gly4Ser3)。进行序列分析后,将融合基因EGFRi-IL-24重组到表达质粒pPIC9k中,Sal I酶切线性化重组质粒EGFRi-IL-24/pPIC9k,电击转化毕赤酵母GS115,经G418抗性和PCR筛选得到阳性重组菌株。重组菌株用甲醇进行诱导表达后,通过SDS-PAGE和MTT法分析鉴定蛋白表达产物。结果证实EGFRi-IL-24在毕赤酵母中获得了分泌性表达的活性蛋白,为进一步研究其生物学功能及临床应用奠定了基础。     

Ⅰ型单纯疱疹病毒糖蛋白D成熟肽基因毕赤酵母表达载体的构建及序列分析

目的构建单纯疱疹病毒Ⅰ型包膜糖蛋白D成熟肽基因毕赤酵母表达载体,并对序列进行分析,为进行高抗原性的真核表达重组gD蛋白奠定基础.方法PCR扩增HSV1-gD成熟肽基因,将该段基因克隆于pGEM-T克隆载体,转化鉴定后,与巴斯德毕赤酵母表达载体(pPIC9K)酶切连接,转化大肠杆菌DH5α,筛选测序确定构建了pPIC9K-gD的真核表达载体,对克隆的序列进行分析,预测表达产物的理化特性及抗原性.结果获得了重组的酵母表达载体pPIC9K-gD.测序结果证实为HSV1-gD成熟肽基因,序列分析其高度保守,预测蛋白分子量为40.52 ku,pI为7.67,包含完整成熟肽分值达1.7的多个抗原决定簇.结论成功构建了HSV1-gD成熟肽基因的毕赤酵母表达载体.     

乙型肝炎病毒C基因在毕赤酵母中的表达

目的:研究乙肝病毒核心(C)基因在毕赤(Pichia pastoris)酵母中的表达,以期获得高效表达的具有良好免疫反应性和特异性的重组乙肝病毒核心蛋白(HBcAg)。方法:采用PCR法从含HBV全基因序列的质粒pHBV1中扩增C基因,亚克隆到pGEM-T载体中,经DNA序列分析后将目的基因定向克隆到酵母表达载体pPIC9中,构建重组质粒pPIC9-cAg。然后用电转法将重组质粒转化入酵母菌GS115,0.5%甲醇诱导表达。采用SDS-PAGE、Western blot和ELISA法对表达产物进行分析。结果:限制性内切酶酶切和DNA序列分析证实HBV C基因已正确克隆到酵母表达载体pPIC9中;SDS-PAGE结果显示重组HBcAg在毕赤酵母细胞中表达;ELISA及Western blot分析表明,表达产物具有良好的免疫反应性和特异性,重组HBcAg的滴度可达1∶12 800。结论:成功构建了pPIC9-cAg重组质粒,并在毕赤酵母中高效表达了具有良好免疫反应性和特异性的重组HBcAg,为进一步研制抗-HBc诊断试剂盒奠定了基础。     

抗血管生成肽βpep-25重组原核表达质粒的构建及鉴定

目的： 合成抗血管生成肽βpep-25片断, 构建并鉴定含βpep-25肽的重组原核表达质粒.方法： 人工设计合成βpep-25肽序列片断, 经测序正确后, 利用基因克隆技术将其克隆到pGEM-T easy载体中, 构建重组质粒pGEM-T-βpep-25;用Nae I和BamH I双酶切pGEM-T-βpep-25后, 将T-βpep-25肽片断克隆到经Nae I和BamH I双酶切的重组载体pBV220-NT4中, 构建重组原核表达质粒pBV220-NT4-βpep-25, 并对其分别用BamH I酶切, EcoR I和BamH I双酶切分析.结果： 经酶切分析和DNA测序人工合成的肽βpep-25序列（113 bp）与文献报道结果一致;分别用BamH I酶切, EcoR I和BamH I双酶切重组原核表达质粒pBV220-NT4-βpep-25可以得到4 030 bp、 364 bp和3 666 bp的片段, 结果表明目的肽片段已经成功地克隆到了重组表达载体中, 说明重组原核表达质粒构建成功.结论： 抗血管生成肽βpep-25重组原核表达质粒的构建成功, 为进一步在细胞内外及动物模型研究其作用机制和抗肿瘤作用奠定了基础.     

乙型肝炎病毒S基因密码子最佳化及在毕赤酵母中的高效表达

目的 制备适合酵母表达的乙型肝炎病毒S基因,在毕赤酵母中高效表达重组乙型肝炎病毒S蛋白.方法 选用酵母偏爱的同义密码子替换野生型S基因的酵母稀有密码子,采取基因搭桥法及递归式聚合酶链反应,制备合成基因,捕入酵母表达载体pPICZB.携带有合成S基因的重组质粒转化毕赤酵母菌株KM71 H,经甲醇诱导表达乙型肝炎病毒S蛋白.结果 酶切电泳及DNA测序证实合成的S基因正确克隆到表达载体中;聚丙烯酰胺凝胶电泳及免疫印迹显示优化后的乙型肝炎病毒S基因在毕赤酵母中的重组蛋白表达量远高于野生型基因.结论 密码子优化的S基因能明显提高重组S蛋白在毕赤酵母表达系统中的表达量.     

表达HBsAg重组毕赤酵母用于抗乙型肝炎病毒治疗的实验研究

本研究旨在借助毕赤酵母的表达和免疫特点,设计一种新型抗HBV治疗性疫苗,探索一种全新的可有效活化机体抗乙型肝炎病毒细胞免疫应答的方式。用PCR法于质粒pEcob6 (含HBVadw2双拷贝基因全序列)和pcDNA3.1 HSP70中扩增出靶基因片段,以双酶切后定向克隆到载体中,再分别借助酶切、PCR和测序进行鉴定。利用电穿孔仪(Bio RadGenepulserⅡ)将重组质粒分别导入毕赤酵母GS115中,常规筛选阳性株后,再用含甲醇培养基BMMY进行诱导表达(30℃30 0r min ,72h)。免疫所用小鼠为BALB c小鼠,雌性,6～8周龄,购自重庆医科大学实验动物中心,每组6～8…     

人Delta-like1ext-Fc融合蛋白毕赤酵母表达载体的构建及表达

目的:构建人Delta-like1ext-Fc融合蛋白毕赤酵母表达载体PIC-hDll1ext -Fc,并在毕赤酵母GS115中表达.方法:以pEF-BOSneo-hdll1ext-Fc为模板PCR扩增人Delta-like1胞外段.通过DNA重组构建毕赤酵母表达载体PIC-hDll1ext.-Fc.用MD平板筛选重组子,G418筛选高拷贝转化子,经甲醇诱导表达后,SDS-PAGE、Western blot分析表达蛋白.结果:hDll1基因的胞外段被有效地扩增.序列分析表明,所构建的含hDll1ext-Fc融合基因的质粒与设计相同,融合蛋白hDll1extFc得到正确表达.结论:成功地扩增了人Delta-likel胞外段,构建了hDll1ext-Fc融合基因的毕赤酵母表达载体PIC-hDll1extFc,并在毕赤酵母中正确表达,为进一步研究奠定了实验基础.     

鹌鹑血管内皮生长因子受体Quek1胞外段第2～4 区cDNA在毕赤酵母中的表达和鉴定

以PCR法从携带有鹌鹑血管内皮生长因子受体quek1(qVEGFR)的质粒中扩增获得qVEFR胞外段第2～4区cDNA片段,并将其定向克隆到毕赤酵母表达载体pPICZαA中,获得重组表达质粒pPICZαA-qVEGFR2.然后将用SacI酶线性化的pPICZαA-qVEGFR2质粒电转化到毕赤酵母菌GS115中,经Zeocin抗性和PCR筛选得到阳性重组菌株.重组菌株用甲醇进行诱导表达后,通过SDS-PAGE和Western blot分析鉴定蛋白表达产物,结果证实qVEGFR2胞外段第2～4区cDNA在毕赤酵母中获得了分泌性表达,为进一步研究和制备肿瘤蛋白疫苗打下了基础.     

人乙醛脱氢酶2基因在毕赤酵母SMD1168中的表达研究

目的得到一株产人乙醛脱氢酶2(acetaldehyde dehydrogenase-2,ALDH2)的重组毕赤酵母菌株,优化其发酵条件以满足生产和科研需求。方法将ALDH2基因整合到质粒pPIC9K,构建重组表达载体pPIC9K-ALDH2,将重组表达质粒pPIC9K-ALDH2经电转化到毕赤酵母SMD1168中,转化子经MD平板筛选后,用G418筛选多拷贝重组子,测序鉴定。通过改变诱导温度、pH、初始OD值、甲醇浓度等诱导条件,对SMD1168(pPIC9K-ALDH2)发酵的条件进行优化。结果ALDH2cDNA整合到毕赤酵母基因组中,得到SMD1168(pPIC9K-ALDH2);获得最佳的诱导表达优化条件:在28℃、pH=7.0、诱导初始OD600=12、每隔24h添加1.5%甲醇、转速为300r/min,发酵所产生的人ALDH2酶活可达到0.115U/ml,相对较高。结论以蛋白酶缺陷型毕赤酵母SMD1168为宿主,分泌表达质粒pPIC9K为载体,能够成功构建重组子SMD1168(pPIC9K-ALDH2)。     

重组毕赤酵母高密度发酵表达肽抗生素hPAB-β及其抑菌活性初步鉴定

目的探讨hPAB-β工程菌的高密度发酵方法,鉴定发酵产物中目的肽的活性。方法采用补料分批培养方法,在3.7 L发酵罐中对重组酵母菌进行高密度发酵,温度控制在30℃,pH值范围为4.95～5.05,在菌体湿重达到200～250 g/L后开始诱导,经过约50 h甲醇诱导后结束发酵。对发酵上清进行反相层析、分子筛层析以及反相高效液相色谱纯化,通过抑菌实验对纯化产物进行活性鉴定。结果3次高密度发酵在菌体湿重分别达到235.0 g/L、210 g/L和264.8g/L时进行诱导表达,发酵上清中目标肽的表达量分别达73.7 mg/L、76.6 mg/L和74.3 mg/L。发酵上清通过反相层析、分子筛层析以及反相高效液相色谱纯化,获得重组肽抗生素hPAB-β,该重组蛋白经抑菌实验显示了较好的抑菌活性。结论成功实现了酵母工程菌的高密度发酵,为下一步规模化制备hPAB-β奠定了基础。     

汉坦病毒部分S基因在毕赤酵母中的分泌表达

目的 构建并表达汉坦病毒(HV)Z10株(HV-Z10)S基因蛋白编码区前300 bp核苷酸序列,研究该基因在毕赤酵母(Pichia pastoris)中的表达及其产物的生物活性.方法 根据HV-Z10 S基因前300 bp(S300)的核苷酸序列,按照编码氨基酸的密码子转换成酵母偏爱的形式,设计合成8条引物,通过连续PCR,获得人工合成Z10株S基因前300 bp的基因序列SP300,经测序,SP300与S300的核苷酸相似性为76.2%,但编码的氨基酸序列完全一致.将SP300克隆到酵母穿梭载体pPICZaA,构建含α-factor分沁信号肽的重组表达载体pPICZaA-SP300.将pPICZaA-SP300、pPICZaA-S300化学法转化酵母GS115菌株,筛选重组转化子.结果 重组了SP300与S300的酵母转化子经甲醇诱导,表达出重组蛋白rNP300及rN300,SDS-PAGE显示相对分子质量为12×10~3左右.经ELISA检测及Westem Blot分析,表达产物能与抗汉坦病毒抗体起免疫反应.结论 SP300和S300基因在毕赤酵母中获得分泌表达,使用酵母偏爱密码子的SP300基因在毕赤酵母中的表达量与S300的表达量基本一致,表达量在诱导24 h后最高.     

pPICZα-LL37-Fcγ1重组质粒的构建及其在毕赤酵母GS115中的表达

目的:构建pPICZα-LL37-Fcγ1重组表达载体,实现LL37-Fcγ1重组融合蛋白在巴斯德毕赤酵母中的高效分泌表达,获得功能性抗菌蛋白。方法:通过合成LL37全基因,将其与人IgG1Fc(Fcγ1)基因相连后,插入到毕赤酵母菌表达载体pPICZα中。电转化毕赤酵母菌GS115后,经Zeocin抗性筛选阳性菌株。用RT-PCR和斑点杂交鉴定目的基因的表达。通过亲和层析法纯化目的蛋白,并以SDS-PAGE和Western blot进行鉴定。用BCA法测定目的蛋白的浓度,鲎试剂鉴定其中和内毒素的能力。结果:成功地构建了pPICZα-LL37-Fcγ1重组质粒,并证明目的基因已整合于毕赤酵母菌的基因组中。通过亲和层析获得具有结合蛋白A及中和内毒素能力的重组融合蛋白LL37-Fcγ1。结论:在毕赤酵母菌GS115中高效表达功能性的LL37-Fcγ1融合蛋白,为进一步研究奠定了基础。