CTGF反义寡核苷酸对高糖培养人肾小球系膜细胞细胞外基质表达的影响

目的: 观察体外转染结缔组织生长因子(CTGF)反义寡核苷酸(ASODN)对高糖培养的人肾小球系膜细胞(HMC)细胞外基质表达的影响.方法: 体外培养HMC, 予以高糖(30 mmol/L)和正常糖(5 mmol/L)培养液培养, 高糖培养后应用脂质体Lipofectamine2000转染CTGF ASODN, 在不同时间收集培养液上清.用ELISA检测培养液上清中的纤连蛋白(FN)和层黏连蛋白(LN)含量.结果: 高糖呈时间依赖促进体外培养的HMC表达 FN和LN, 而转染CTGF ASODN可抑制高糖所致的FN和LN分泌增加.结论: 高糖培养可促进HMC细胞外基质的表达, 转染CTGF ASODN可抑制上述高糖的作用.故调控HMC的CTGF表达水平可能成为防治糖尿病肾病(DN)、特别是早期病变的有效途径之一.     

高糖对大鼠肾小球系膜细胞ERK转导通路的影响

目的： 探讨高糖环境下系膜细胞中ERK转导途径的活性变化及其对TGF-β1 mRNA表达的影响。方法： 分离培养大鼠肾脏系膜细胞，调整培养液浓度为以下3组，即正常糖组、高糖组、甘露醇组。分别于干预24 h、48 h、72 h后用免疫细胞化学法和Western blotting法对系膜细胞中磷酸化ERK1/2（pERK1/2）的表达进行定位、定性及半定量分析，用RT-PCR法检测细胞中TGF-β1 mRNA的表达。结果： 高糖组系膜细胞中pERK1/2蛋白的表达明显高于正常糖组，并由胞浆向胞核内转移，随培养时间延长其表达上升(P<0.01)，高糖组TGF-β1mRNA的含量也明显高于正常糖组(P<0.01)，甘露醇组上述指标与正常糖组差异不显著(P>0.05)。结论： 高糖环境下系膜细胞中ERK信号转导通路可被激活，进而使TGF-β1 mRNA表达上调，这可能是糖尿病肾病系膜细胞受损、肾小球硬化的机制之一。     

TGFβ1基因对血管内皮细胞细胞外基质表达及与基质黏附的影响

了解TGFβ1基因对血管内皮细胞表达细胞外基质蛋白及与基质黏附力的影响。用DOTAP脂质体转染p MAMneo TGFβ1于原代培养的脐静脉内皮细胞,经G4 18筛选,TGFβ1表达经免疫荧光鉴定。Western blot确定 型胶原、纤黏连蛋白的表达,微管吸吮系统确定内皮细胞与基质的黏附力。结果表明生理情况下的内皮细胞能表达少量的TGFβ1及胶原、纤黏连蛋白。经G4 18筛选,外源性TGFβ1在血管内皮细胞中稳定表达,能显著提高胶原、纤黏连蛋白纤维的表达及细胞与基质的黏附。说明TGFβ1在血管组织工程中促进内皮细胞的黏附具有一定的应用价值。     

丹酚酸B对高糖诱导的肾小球系膜细胞表型转化及细胞外基质分泌的影响

目的:研究丹酚酸对高糖诱导的肾小球系膜细胞表型转化及细胞外基质分泌的影响及其机制。方法:培养人肾小球系膜细胞(HGMCs),随机分为正常对照组、高糖组及高糖+丹酚酸B高、中、低剂量组,高糖组和丹酚酸B各组用含高浓度(33.3 mmol/L)葡萄糖的培养基培养72 h,丹酚酸B各组同时加人相应浓度丹酚酸B共同孵育。Western blot法检测α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达水平,ELISA法检测细胞Ⅰ型胶原(ColⅠ)、Ⅲ型胶原(ColⅢ)、纤维连接蛋白(FN)和层粘连蛋白(LN)的分泌水平,Western blot法检测转化生长因子β1(TGF-β1)的表达及Smad2和p38丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)的磷酸化水平。结果:高糖孵育72 h后,肾小球系膜细胞α-SMA的蛋白表达水平明显升高,ColⅠ、ColⅢ、FN及LN蛋白的分泌水平显著增加(P 0.01),TGF-β1的表达及Smad2、p38 MAPK的磷酸化水平也明显升高(P 0.01);与丹酚酸B共同孵育可明显降低α-SMA蛋白的表达水平,ColⅠ、ColⅢ、FN和LN的分泌明显减少,TGF-β1的表达及Smad2、p38 MAPK的磷酸化水平显著下降(P 0.01或P 0.05)。结论:丹酚酸B可明显抑制高糖诱导的肾小球系膜细胞表型转化,减少ColⅠ和ColⅢ等细胞外基质分泌,其机制与抑制TGF-β1/Smad信号通路及p38 MAPK活化有关。     

茶多酚对高糖所致人肾小球系膜细胞活性氧和TGF-β1表达的影响

目的 探讨高糖对人肾小球系膜细胞活性氧(ROS)和转化生长因子β1，(TGF-β1)表达的影响及茶多酚的干预作用。方法 培养人肾小球系膜细胞，分为正常对照组、高糖组、茶多酚组和茶多酚干预组，培养0、12、36h后，用分光光度比色法测定细胞上清液超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量，用半定量RT-PCR和免疫细胞化学法检测细胞内TGF-β1，mRNA和蛋白表达的变化。结果 高糖导致系膜细胞SOD活性下降和MDA含量升高，上调TGF-β1，mRNA和蛋白表达，随时间延长更为明显；茶多酚干预可拮抗高糖时系膜细胞的上述改变。结论 高糖能促进人肾小球系膜细胞ROS产生增加，上调TGF-β1 mRNA和蛋白表达，茶多酚能抑制高糖对系膜细胞的作用。     

RNA干扰抑制肝星状细胞CTGF表达对细胞外基质分泌的影响

目的：利用pEGFP质粒载体构建介导结缔组织生长因子(CTGF)短发夹RNA表达的质粒，筛选有效的抑制序列后，研究其对HSC-T6中TGF-β₁、CTGF及细胞外基质表达的影响。方法:1.分别设计3对针对CTGF的有小发夹结构的两条DNA序列及1对非特异对照序列，构建重组体成功后转染HSC-T6，24 h后通过RT-PCR及Western blotting分析HSC-T6 CTGFmRNA及蛋白表达水平，筛选出有效抑制CTGF表达的序列。2.将已构建并筛选出有最高抑制效率的pEGFP-CTGFshRNA转染HSC-T6 ，培养24、48 h后用RT-PCR和/或Western blotting检测各组细胞中TGF-β₁、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原基因的表达;放免法分析细胞上清液中Ⅲ型前胶原、IV型胶原、透明质酸和层黏连蛋白的含量。结果:将构建成功的3组pEGFP-CTGFshRNA转染肝星状细胞后，筛选出两组能高效抑制CTGF表达的序列; pEGFP-CTGFshRNA能明显抑制HSC-T6 CTGF、Ⅰ型、Ⅲ型胶原mRNA及蛋白的表达，降低上清液中Ⅲ型前胶原、IV型胶原、透明质酸和层黏连蛋白的含量(P<0.01或P<0.05)，而对TGF-β₁的基因表达则无影响。结论:pEGFP-CTGFshRNA能高效抑制肝星状细胞中CTGF及细胞外基质的表达;CTGFshRNA介导的RNA干扰有望对慢性肝病所致肝纤维化具有治疗潜力。     

缬沙坦抑制高糖培养的大鼠肾小球系膜细胞细胞外基质及CTGF的表达

目的　探讨高糖状态下体外培养的肾小球系膜细胞中结缔组织生长因子（CTGF）的表达以及缬沙坦的影响。方法 体外培养大鼠系膜细胞,分别给予高糖和缬沙坦干预,采用Western blot检测CTGF、p38丝裂原活化蛋白激酶 （p38 MAPK）、cAMP反应元件结合蛋白1（CREB1）及各自磷酸化蛋白的表达,RT-PCR检测CTGF mRNA和纤维黏连蛋白（FN）mRNA的表达。放免法测定细胞上清液中层黏连蛋白(LN)和IV型胶原的含量。结果 与低糖组相比,高糖组系膜细胞CTGF、p-p38 MAPK、p-CREB1表达明显上调,CTGF mRNA和FN mRNA表达增加,细胞上清中LN和IV型胶原含量增加。缬沙坦组CTGF、p-p38 MAPK、p-CREB1的表达明显下调,CTGF mRNA和FN mRNA表达降低, LN和IV型胶原的含量减少。 结论　缬沙坦抑制高糖状态系膜细胞CTGF表达 和细胞外基质的分泌可能部分是通过影响p38 MAPK及其下游核因子CREB1的激活而实现。     

p53激动剂nutlin-3对高糖培养的肾系膜细胞增殖的影响

目的:观察p53激动剂nutlin-3对高糖培养的肾系膜细胞增殖、凋亡和细胞外基质表达的影响。方法:制备糖尿病肾病(DN)小鼠动物模型,对小鼠肾组织行PAS染色,观察病理形态学变化,免疫组化染色检测肾组织中p53的表达。对肾小球系膜细胞株SV40进行体外培养,根据实验需要将细胞分为甘露醇(Motl)组、正常糖浓度对照(NG)组、高糖(HG)组,高糖+nutlin-3(HG+Nut)组及nutlin-3对照(Nut)组,CCK-8法和台盼蓝染色活细胞计数检测细胞增殖情况,流式细胞术检测细胞凋亡情况,Western blot法检测Ⅳ型胶原蛋白(Col-Ⅳ)、p53、p-p53、Bcl-2和Bax的蛋白水平。结果:DN小鼠肾组织中系膜细胞增生,细胞外基质增多,p53水平明显升高。高糖环境可以增强系膜细胞的活力,40μmol/L的nutlin-3对高糖培养下的系膜细胞有抑制作用。与HG组比较,HG+Nut组的p53、Bax和p-p53的蛋白水平显著升高(P0.05),Bcl-2和Col-IV的蛋白水平降低(P0.05),Bax/Bcl-2的比值大于1。与HG组比较,nutlin-3可促进高糖培养下的系膜细胞凋亡,凋亡率明显增高(P0.05)。结论:高糖环境增强肾系膜细胞的增殖能力。p53激动剂可抑制高糖培养的肾系膜细胞的活力和Col-IV的表达,促进其凋亡。     

Decorin基因转染对人胃癌裸鼠移植瘤生长的影响

目的:探讨核心蛋白聚糖(DCN)对人胃癌细胞SGC-7901裸鼠移植瘤生长的影响及可能的机制。方法:构建裸鼠胃癌移植瘤模型,将重组质粒pEGFP-N1-DCN注入肿瘤中央及基底部,以空质粒组和生理盐水组作为对照,测量肿瘤体积和质量的变化,RT-PCR及Western blot法检测DCN的表达,Western blot法检测转化生长因子-β1(TGF-β1)和基质金属蛋白酶-9(MMP-9)的表达,免疫组织化学染色方法检测血管内皮生长因子(VEGF)的表达。结果:裸鼠胃癌移植瘤模型构建成功,与对照组比较,重组质粒组肿瘤生长速度减慢,肿瘤体积和质量明显变小(P<0.05);RT-PCR显示重组质粒组DCN表达增强(P<0.05),Western blot结果显示重组质粒组有融合蛋白的表达,重组质粒组TGF-β1及MMP-9蛋白表达均降低(P<0.05);免疫组化显示重组质粒组VEGF表达降低(P<0.05)。结论:DCN基因可以抑制裸鼠移植瘤生长,其机制可能与转化生长因子-β1及基质金属蛋白酶-9蛋白的表达降低和肿瘤新生血管形成抑制有关。     

慢性肾衰竭大鼠肾细胞外基质变化

目的:分析慢性肾衰竭大鼠肾去细胞组织结构特点,探讨慢肾衰大鼠肾细胞外基质的病理变化。方法:SD大鼠实验组腺嘌呤灌胃,行去细胞处理后,H-E、Masson染色及电镜观察慢肾衰大鼠肾形态学结构变化及去细胞支架的生物学特性,免疫荧光分析其细胞外基质成分的变化。结果:腺嘌呤灌胃造模组慢肾衰血尿素氮、血肌酐明显增高,肾大体显示透明度降低,且随灌胃时间延长,H-E染色整体支架更加粗大,同时细胞数目以及小管区结晶数目明显增多;Masson三色染色显示实验组肾支架可见大量蓝色的胶原纤维沉积;扫描电镜显示2组肾细胞外基质三维结构紊乱,细胞外胶原纤维更加致密且有不同程度的增生;进一步免疫荧光检测,显示实验组支架的层黏连蛋白、胶原蛋白Ⅰ及Ⅳ都有明显的绿色荧光表达。结论:慢性肾衰肾支架病理形态结构改变及细胞外基质增生,为进一步研究慢肾衰肾支架是否可作为复细胞支架提供依据。     

非诺贝特对实验性糖尿病大鼠肾脏保护作用的研究

目的：探讨苯氧乙酸类降血脂药非诺贝特（fenofibrate）对实验性糖尿病大鼠肾脏的保护作用。方法：将实验用SD大鼠随机分为正常对照组（C组），糖尿病组（D组），非诺贝特治疗组（F组）。第4、6周分别随机取各组大鼠一半检测血糖、血甘油三酯、血胆固醇、血肌酐、尿白蛋白及肾脏肥大指数。应用免疫组织化学方法检测肾组织转化生长因子-β₁（TGF-β₁）、层粘连蛋白（LN）、IV型胶原蛋白的表达。用计算机图象分析系统测定肾小球平均体积（MGV）、肾小球平均面积（MGA）。结果：非诺贝特治疗组血甘油三酯、血胆固醇、尿白蛋白排泄率均低于糖尿病组（P<0.05, P<0.01）。第6周时，F组TGF-β₁、LN、IV型胶原蛋白表达低于D组（P<0.05）。结论：非诺贝特对糖尿病肾脏有部分保护作用，其机制可能部分通过降血脂、下调糖尿病大鼠TGF-β₁的表达减少细胞外基质的积聚。     

肾上腺髓质素在糖尿病肾病中的变化及作用

目的: 探讨肾上腺髓质素(AM)在糖尿病肾病中的变化及作用。方法: 通过体外人肾小球系膜细胞培养实验,观察高糖条件对系膜细胞AM mRNA、转化生长因子-β₁(TGF-β₁)mRNA表达、分泌及细胞外基质(层粘连蛋白和Ⅳ型胶原)含量的影响及肾上腺髓质素干预对高糖不良作用的影响。结果: 在高糖条件下培养的人肾小球系膜细胞AMmRNA、TGF-β₁mRNA表达和AM、TGF-β₁分泌较低糖对照组分别增加1.01倍、0.59倍和3.49倍、1.61倍;细胞外基质蛋白LN和Ⅳ型胶原含量分别升高0.95倍和1.13倍。用不同浓度AM(10^-7、10^-8和10^-9 mol/L)干预后,TGF-β₁mRNA表达分别下降50%、28%和16.2%,TGF-β₁含量分别下降39%、26%和11%;LN含量分别下降53%、45%和18%,Ⅳ型胶原含量分别下降29%、26%和20%。结论: 葡萄糖水平升高是AM表达分泌的剌激因子之一。AM的肾脏保护作用可能与抑制TGF-β₁的表达与分泌,进而减少基质蛋白和胶原的过度积聚相关。     

可调控性鼠TGF-β1重组腺病毒载体的构建和表达

目的:构建和表达可调控性鼠TGF-β1重组腺病毒载体。方法:采用常规分子生物学方法, 从刀豆A刺激的小鼠脾细胞抽提总RNA, 克隆鼠TGF-β1基因;经穿梭载体与可调控性腺病毒载体骨架连接, 鉴定后在HEK293细胞包装。获得高滴度病毒后, 取上清采用ELISA方法鉴定目的基因的表达。结果:TGF-β1重组腺病毒经测序、限制性内切酶酶切分析、PCR等鉴定, 与预期结果一致;病毒感染细胞的上清液经ELISA检测, TGF-β1的表达量为(91.16±3.70)ng/L。结论:构建的可调控性鼠TGF-β1重组腺病毒载体得到了正确表达, 为进一步的研究和应用奠定了基础。     

肾上腺髓质素拮抗转化生长因子β1的促纤维化作用及其机制

目的:探讨肾上腺髓质素(AM)在人肾小管上皮细胞系(HK-2)对转化生长因子β₁(TGFβ₁)促纤维化作用的影响及机制。方法:细胞总胶原的合成和分泌以[³H]-脯氨酸掺入量及培养液内[³H]-羟脯氨酸放射活性来判断;ELISA法检测培养液中纤维连接蛋白(FN)含量;FN、IV型胶原和组织型金属蛋白酶抑制剂-1(TIMP-1)mRNA的表达采用RT-PCR法;信号蛋白Smad2及Smad6蛋白表达采用Westernblot法。结果:(1)AM在蛋白和mRNA水平均明显抑制TGFβ₁刺激的胶原和纤维连结蛋白的表达;(2)AM抑制TGFβ₁刺激的TIMP-1mRNA的上调;(3)AM(10^-8mol/L)本身对Smad2和Smad6的表达无明显影响,且对TGFβ₁刺激的Smad2的表达也无明显影响;但是可以明显上调被TGFβ₁抑制的Smad6的表达。结论:在HK-2细胞,AM通过上调抑制性Smad6的表达拮抗TGFβ₁的促纤维化作用。     

胰岛素控制血糖对糖尿病大鼠肾组织Smad7表达及纤维化病变的影响

 目的：观察胰岛素控制糖尿病大鼠血糖后是否能上调肾组织Smad7的表达,减轻或延缓糖尿病肾病(DN)肾纤维化病变的发生发展。方法：链脲菌素复制大鼠糖尿病模型,随机分为糖尿病组(DM组) 和胰岛素治疗组(INS组) (n=8);INS组于成模13周起用胰岛素将血糖控制在4~7 mmol/L;同时设正常对照组(NC组)(n=8)。17周处死大鼠,检测相应生化指标,观察胰腺和肾组织病理学改变,免疫组化和Western blotting检测各组大鼠肾组织组织转化生长因子β1 (transforming growth factor β1, TGF-β1)、Smad泛素化调节因子2(Smad ubiquitin regulatory factor 2, Smurf2)、Smad7、 E-钙黏蛋白(E-cadherin)、α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin, α-SMA)、层连蛋白(fibronectin, FN)和胶原蛋白Ⅰ(collagenⅠ)的蛋白表达。结果：与NC组比较,DM组大鼠体重显著减轻,24 h尿蛋白、血糖和甘油三酯显著升高(P<0.05),病理检查显示胰岛被破坏,肾组织TGF-β1、Smurf2、α-SMA、FN和collagenⅠ蛋白的表达均显著增加(P<0.05),并伴有肾小管Smad7和E-cadherin的表达减少(P<0.05);而经胰岛素控制血糖后,INS组大鼠较DM组体重逐渐增加,24 h尿蛋白和血糖均显著降低 (P<0.05),肾纤维化病变明显改善,TGF-β1、Smurf2、α-SMA、FN和collagenⅠ蛋白的表达均显著减少(P< 0.05),Smad7和E-cadherin的表达显著上调(P<0.05)。结论：控制血糖能恢复糖尿病大鼠肾组织Smad7蛋白表达水平,减少细胞外基质的沉积,延缓DN的纤维化进展,其机制可能与肾组织中TGF-β1和Smurf2表达降低、Smad7蛋白的泛素化降解减少有关。     

罗格列酮对2型糖尿病大鼠血浆resistin的影响及对肾小球硬化的干预研究

目的： 研究罗格列酮对糖尿病大鼠血清巨噬细胞因子resistin水平的影响,探讨该药物对糖尿病肾小球硬化的干预及可能的作用机制。方法： 20只10周龄Wistar大鼠随机分为糖尿病肾病（DN）模型组和罗格列酮干预组(DN+RSG),另取10只Wistar大鼠作为正常对照组(NC)。DN和罗格列酮干预组大鼠右肾切除后经过阴茎背静脉注射35 mg/kg链脲菌素（STZ）,罗格列酮组按照10 mg·kg-1·d-1的剂量给予罗格列酮灌胃,DN组及正常对照组喂饲普通饮食。STZ注射20周后留取静脉血和24h尿,后处死大鼠并取肾组织。ELISA法检测血浆白细胞介素-1(IL-1)、肿瘤坏死因子-α (TNF-α)及resistin水平,免疫比浊法测定高敏C反应蛋白(hs-CRP),并测定24 h尿微量白蛋白、空腹血糖及肾功能水平。光镜下观察肾组织的病理改变情况,免疫组化检测肾小球转化生长因子-β1(TGF-β1) 的表达,Western blotting检测Smad2磷酸化水平。 结果： 与NC组比较,DN组大鼠血浆炎症因子IL-1、TNF-α、hs-CRP及resistin的水平均显著升高;罗格列酮干预后血浆中上述指标含量均显著低于模型组。与DN组比较,罗格列酮干预组的空腹血糖无明显变化,但24 h尿微量白蛋白定量及肾功能水平均明显下降。罗格列酮干预后肾小球内TGF-β1蛋白表达及Smad2磷酸化水平较DN组显著降低,并且其肾小球系膜增生程度也较DN组明显减轻。结论： 罗格列酮具有延缓及改善糖尿病肾小球硬化的作用,该作用可能与其降低resistin及其它炎症相关因子的表达有关。针对炎症有望控制DN的发生发展。     

Ex vivo transfer of the decorin gene into rat glomerulus via a mesangial cell vector suppressed extracellular matrix accumulation in experimental glomerulonephritis

The activation of transforming growth factor-beta (TGF-beta) is known to be one of the major causes of glomerulosclerosis. Decorin (DCN) is a natural inhibitor of TGF. The purpose of this study was to assess the feasibility of transferring the DCN gene to antithymocyte serum (ATS) glomerulonephritis glomeruli via a mesangial cell vector to treat glomerulonephritis fibrosis. For this process, the recombinant eukaryotic expression plasmid pcDNA3.1A-DCN was constructed and transfected into mesangial cell. The DCN-positive cloned cells were transferred to rat antithymocyte serum glomeruli by a left renal artery injection. Using immunohistochemical staining, approximately 37-60% (48.6% +/- 11.34%; mean +/- SE, n = 8) of the glomeruli were BrdU-positive in the injected-side kidney. DCN proteins were observed in the cytoplast beginning 12 h after injection. TGF-beta1 expression in the injected side glomeruli decreased significantly at day 4 (P < 0.05), compared with that in the uninjected-side kidney. The expression leaves of fibronectin and collagen IV decreased significantly at days 1-2 (P < 0.01) and day 4 (fibronectin, P < 0.01; collagen IV, P < 0.05). These results suggest that the use of DCN can decrease antithymocyte serum glomerulonephritis extracellular matrix (ECM) ingredients and that such use offers a favorable experimental basis for gene therapy for kidney disease.     

黏着斑激酶在2型糖尿病大鼠肾组织中的表达变化及意义

 目的：观察黏着斑激酶（FAK）在2型糖尿病（T2DM）大鼠肾组织中的动态变化,探讨其在糖尿病肾病（DN）发病机制中的作用。方法：复制T2DM模型,随机分为糖尿病8、12和16周(DM8、DM12和DM16)组,另设正常对照(NC)组和高脂高糖对照(HC)组。免疫组织化学检测肾组织中FAK、转化生长因子β1(TGF-β1)、细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)、p-ERK1/2和纤维连接蛋白(FN)的表达;Western blotting检测FAK和p-FAK(Tyr397)蛋白水平;RT-PCR法检测肾皮质FAK mRNA的水平。结果：DM各组TGF-β1、p-ERK1/2和FN蛋白表达显著高于NC组及HC组(P<0.05);DM12和DM16组肾皮质FAK和p-FAK (Tyr397)表达均较NC组、HC组及DM8组显著增多(P< 0.05),且p-FAK(Tyr397)与总FAK蛋白表达趋势一致;FAK与TGF-β1、p-ERK1/2、FN呈显著正相关（P<0.01）。DM12和DM16组FAK mRNA比NC组、HC组及DM8周组表达明显增加(P< 0.05)。结论: 在2型糖尿病中,FAK可能作为TGF-β1的下游分子被活化,并通过活化ERK1/2使FN表达增多,从而参与了糖尿病肾病的发生发展。