芒果4CL基因的克隆及其表达分析

4-香豆酸:辅酶A连接酶(4CL)是植物类黄酮类化合物和木质素等生物合成途径的一种关键酶,为了研究其在芒果果实中的作用机理,采用RACE方法,从芒果果实克隆得到了一个类黄酮合成相关的4CL基因。该基因全长c DNA序列为1 740 bp,开放阅读框为1 653 bp,编码550个氨基酸,分子量为60.47 k Da,等电点为9.51。对基因组扩增得到了2 318 bp长度的片段分析发现,该基因含有5个内含子,分别在1 013~1 139 bp,1 330~1 415 bp,1 564~1 653 bp,1 722~1 802 bp,1 905~2 000 bp。通过在线软件对其二级结构和三级结构进行了预测,系统发育分析发现该基因编码的蛋白与水曲柳、菘蓝等植物具有较近的亲缘关系。对3种不同着色的芒果品种中的4CL基因的RTPCR进行分析发现:红色的贵妃品种中表达量较高,而绿色的桂七品种中表达量较低。研究表明4CL基因表达芒果果实着色具有密切的相关性。     

芒果八氢番茄红素脱氢酶(PDS)基因的克隆与表达分析

八氢番茄红素脱氢酶(phytoene desaturase, PDS)影响类胡萝卜素的合成,是合成途径中关键基因。为了研究芒果果实中PDS基因的功能,本试验采用RACE方法从‘贵妃’芒果果实中克隆得到了一个八氢番茄红素脱氢酶(PDS),该基因全长c DNA序列为1 820 bp,开放阅读框为1 650 bp,编码549个氨基酸,分子重量为61.34 kD,等电点为6.78。聚类分析发现芒果PDS蛋白与柚子、香瓜和番木瓜等植物的亲缘关系较近。其氨基酸组成主要是丙氨酸(ALa),白氨酸(Leu),缬氨酸(Val)等。利用定量PCR技术对不同品种中的PDS基因表达量分析,发现红色‘贵妃’品种表达量最高,而绿色‘桂七’品种表达量最低,对其蛋白的结构域、三级结构及互作蛋白进行了预测,发现其含有Phytoene-desat、PLNO2487 superfamily等结构域。利用STRING数据库对其互作蛋白进行分析发现其与PSY、ZDS、CRTISO等蛋白可能有相互作用。本研究为进一步研究芒果果实类胡萝卜素生物合成的分子调控机理提供理论依据。     

芒果GGPPS小亚基基因的克隆、进化和表达分析

香叶基焦磷酸(GPP)是香味成分单萜的前体物质,而香味是芒果重要的品质性状。本研究克隆了芒果中GPP合成关键酶基因,即香叶基香叶基焦磷酸合成酶小亚基基因(MinGGPPSssu),并开展了系统进化分析和表达分析。从芒果栽培品种贵妃芒的新鲜叶片中提取DNA和RNA,根据转录组测序拼接结果设计引物扩增得到Min GGPPSssu全长约1 kb的c DNA序列。通过测序、多重比对和聚类分析,证实该片段属于GGPPSssu的全长基因,且为最大的ORF。与近缘物种苦楝GGPPS1(KM108317)氨基酸序列同源性为83%。蛋白质序列分析表明该序列含有1个DDx_(2-4)D保守基元和一个Cxxx C基元。我们选取了拟南芥中12个GGPPS基因、2个FPPS基因、2个SPPS基因、一个GPS基因及其他物种的相关基因,通过聚类分析,将Min GGPPSssu聚类到香叶基香叶基焦磷酸合成酶小亚基所属的枝。表达分析表明,该基因在叶片中表达量最高,茎部表达量较低。果皮和果肉在芒果成熟前后表达量相似,但是在果皮中的表达量约为果肉表达量的3倍,推测其与果皮及叶片香味调控相关。     

番茄SlSPS1基因的克隆及表达分析

蔗糖是植物光合作用的主要产物,参与植物的多种生理生化反应。蔗糖磷酸合成酶是蔗糖进入各种代谢途径所必需的关键限速酶之一,其活性直接反映了植物体内蔗糖合成的能力。为研究番茄中蔗糖合成的作用机理,本研究从番茄果肉中克隆到一个蔗糖磷酸合成酶基因,并命名为SlSPS1,通过生物信息学分析发现其cDNA全长3 488 bp,编码1 054个氨基酸,有3个功能域。番茄中有4个SPS基因,且它们之间同源性比较高。在茄科作物中,Sl SPS1蛋白与土豆、辣椒和茄子的亲缘关系比较接近。组织特异性分析结果发现,SlSPS1在番茄各组织中均有表达,其中在幼苗期和果实的不同发育期表达相对较高。为更深入研究SlSPS1在番茄生长发育和蔗糖积累中的作用机制,构建了SlSPS1的过表达和敲除载体,转化Micro-Tom后获得转基因阳性株系。对获得的转基因株系进行SlSPS1表达量分析发现,过表达株系的苗期、果实绿熟期和完熟期的表达量同野生型相比明显上调,且酶活性和蔗糖含量升高。敲除株系的苗期、绿熟期和完熟期SlSPS1表达量同野生型相比明显下调,且酶活性和蔗糖含量降低。至于SlSPS1在番茄生长发育和果实蔗糖积累中的作用机制,还需在今后进行功能验证。     

芒果二氢黄酮醇4-还原酶(DFR)基因的克隆及其表达分析

二氢黄酮醇4-还原酶(dihydroflavonol 4-reductase,DFR)是花青素代谢后期重要的酶,是决定花青素从无色到有色的关键调控点。本研究以‘贵妃’芒果的果实为材料,采用同源克隆的方法克隆得到了一个二氢黄酮醇4-还原酶DFR基因。该基因c DNA全长为1 260 bp,开放阅读框为987 bp,编码328个氨基酸。进一步扩增得到其基因组DNA,全长为3 022 bp,分析发现其含有五个内含子,在已报道植物中表现保守。系统发育分析发现芒果DFR蛋白与火鹤花、小麦和大麦等植物具有较近的亲缘关系。对不同着色的果皮中的DFR基因表达进行分析发现,绿色果皮中表达量较高,而黄色果皮中表达量较低,暗示DFR调控花色苷合成的功能待深入研究。     

芒果(Mangifera indica)黄烷酮3-羟化酶基因的克隆及其表达分析

色素苷的合成是红色芒果果实着色的主要代谢途径,黄烷酮3-羟化酶(F3H)基因是花色素代谢途径上的关键酶,属于依赖型2-酮戊二酸的双加氧酶(2-ODD)家族,反应需要2-酮戊二酸、分子氧、铁和抗坏血酸,作用是催化柚皮素C3位羟基化,生成二氢山奈素(dhiydorkaempeforl,DHK)。本研究根据已经报道的F3H基因的序列设计兼并引物,采用RACE方法从芒果的果实中,克隆得到了一个F3H基因,其全长cDNA序列为1 182 bp,开放阅读框为1 092 bp,编码363个氨基酸,分子重量为40.82 k D,等电点为4.88。通过在线软件对其二级结构和三级结构进行了预测。对不同着色芒果品种中的F3H基因的表达进行分析发现:红色的贵妃品种中表达量较高,而绿色的桂七品种中表达量较低。通过系统进化树分析发现芒果中黄烷酮3-羟化酶(F3H)基因编码的蛋白与荔枝、可可、柚子等植物的亲缘关系比较近。     

芒果HMGR家族基因的鉴定、系统进化和表达分析

羟甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGR)是甲羟戊酸(MVA)途径的第一个限速酶。为了探索HMGR家族基因在芒果中的作用,本研究鉴定了芒果HMGR家族基因,并对HMGR家族基因的理化性质、系统发育及在芒果中的表达量进行了分析。结果显示,芒果HMGR家族蛋白序列均包含完整的HMG-CoA_red结构域,且HMGR家族蛋白均为疏水性蛋白。系统发育树显示,HMGR家族基因是从苔藓植物开始形成的,且芒果HMGR家族基因均聚在双子叶植物的分支,与物种进化历程一致。HMGR家族基因在芒果品种‘贵妃’和‘台农’成熟果果肉中的表达量结果显示,Mi15g11840.1和Mi19g11720.1基因在‘贵妃’中的表达量显著高于‘台农’,Mi18g12500.1基因在‘贵妃’中的表达量显著低于‘台农’,而Mi04g11220.1基因在两个品种中的表达量差异不显著。本研究为进一步研究芒果HMGR家族基因在MVA途径中的作用提供了科学依据。     

沙棘3-磷酸甘油脱氢酶基因生物信息学及表达分析

沙棘果肉和种子组织中均富含生物活性油。3-磷酸甘油脱氢酶(GPD1)是促进油脂合成前体甘油-3-磷酸(G3P)合成的限速酶。本研究对沙棘HrGPD1基因进行生物信息学分析(氨基酸序列,保守域,亚细胞定位等),及其在沙棘不同组织(果肉和种子)中的表达情况。研究发现:HrGPD1开放阅读框为1 143 bp,编码380个氨基酸,无信号肽和跨膜结构域,存在多个磷酸化位点,定位于质体中,蛋白高级结构以α-螺旋为主,该蛋白序列与桑、梅、烟草和拟南芥的GPD表现出较高的序列相似性。qRT-PCR分析发现,HrGPD1基因在沙棘品系‘新俄3号’成熟种子和果肉中的相对表达量分别为0.52和1.35,与二者的含油率高低规律相一致。这为进一步研究HrGPD1基因在沙棘生物活性油合成过程中的作用机理提供科学依据。     

芒果赤霉素氧化酶基因GA3ox的克隆、表达及亚细胞定位分析

赤霉素3-氧化酶(gibberellin 3-oxidases, GA3ox)是赤霉素(gibberellic acid, GA)生物合成途径中的关键限速酶之一。芒果中GA3ox基因的功能及其表达模式未见报道。本研究利用RACE技术克隆了一个芒果GA3-氧化酶基因(GA3ox),该基因全长cDNA序列为1 680 bp,编码氨基酸381个,开放阅读框(open reading frame, ORF)为1 146 bp,蛋白分子量为42.6 kD,等电点为5.13,不含信号肽,不含跨膜结构域。系统发育树分析发现,该基因编码的蛋白主要与开心果亲缘关系较近,其次为克莱门柚、甜橙、麻疯树等植物。通过拟南芥原生质体亚细胞定位分析发现,该基因主要定位在细胞质中。通过对乔化、矮化芒果品种不同发育时期的叶片的实时荧光定量PCR分析发现,该基因主要在矮化品种中表达量较高,在乔化品种各个时期表达量较低,且差异不大。矮化品种中主要在开花期表达量最高,坐果期7～8周含量最低,但都高于乔化品种的任何取样时期。该基因的克隆和表达分析为下一步功能的研究及其在芒果株形调控分子机制提供理论依据。     

芒果GGPPS基因的克隆与表达分析

在植物中,异戊烯焦磷酸(GGPP)是赤霉素、胡萝卜素、叶绿素等异戊二烯类化合物的公共前体物质。从芒果栽培品种贵妃芒的新鲜叶片中提取DNA和RNA,根据转录组测序拼接结果设计引物扩增得到香叶基香叶基焦磷酸合成酶基因(Min GGPPS1)。通过测序、多重比对和聚类分析,证实该片段属于GGPPS的全长基因并且为最大的ORF,全长为1 100 bp。与芒果Min GPS2(AFJ52722.1)氨基酸序列同源性为92%。蛋白质序列分析表明该序列含有两个DDx_(2-4)D保守基元(FARM和SARM)基元和一个Cxxx C基元。我们选取了拟南芥中12个GGPPS基因、2个FPPS基因、2个SPPS基因、一个GPS基因及其他物种的相关基因,通过聚类分析表明,Min GGPPS1属于香叶基香叶基焦磷酸合成酶大亚基。表达分析表明:Min GGPPS1在叶片中表达量最高,茎部表达量最低,青果果皮和成熟果果皮中表达量相似,在成熟果肉中的表达量大约是青果果肉表达量的5倍,暗示Min GGPPS1具有调控果肉后熟的功能。     

芒果多胺氧化酶2(MiPAO2)基因克隆表达分析与沉默和过量表达载体的构建

本研究以芒果果皮为材料探究多胺(PAs)和多胺氧化酶2(PAO2)对芒果果实抗逆性的作用机理。多胺(PAs)如腐胺(Put)、亚精胺(Spd)、精胺(Spm)是无处不在的聚阳离子,在不同的细胞代谢过程具有广泛的功能。多胺氧化酶2(polyamine oxidase 2,PAO2)是真核生物多胺分解代谢途径中的关键酶。本研究根据转录组测序得到芒果PAO2部分片段信息设计兼并引物,采取3'和5'cDNA末端快速克隆(RACE)的技术方法,分别在三个不同着色芒果品种(红色‘贵妃’品种,黄色‘金煌’品种,绿色‘桂七’品种)中进行PAO2基因全长cDNA序列的扩增,克隆得到了芒果果皮PAO2基因的全长cDNA序列命名为MiPAO2。结果发现三个着色品种cDNA序列只有几个碱基的差异,以红色‘贵妃’品种为例分析可得全长cDNA序列为1 542 bp,开放阅读框为1 209 bp,编码402个氨基酸,分子重量为43.93 kD,等电点为5.60,定位于过氧化物酶体。通过生物软件预测得到了三种三级蛋白结构图。对NCBI上刊载的30种不同植物构建系统发育树发现该基因编码的蛋白与枳的亲缘关系比其他植物物种的亲缘关系近。为深入探究MiPAO2基因在多胺分解代谢过程中的作用,本研究成功构建出MiPAO2-pTRV2基因沉默载体和MiPAO2-pGreen II 62-SK基因过量表达载体,为后续研究MiPAO2基因在芒果果实的抗盐、抗寒以及抗虫过程中的作用机理提供理论依据。     

芒果CHS基因的克隆及其表达分析

为了研究芒果CHS基因的功能及其在果实着色中的分子机理,以芒果果实的c DNA和DNA为模板,采用同源克隆的方法克隆得到了一个CHS基因,该基因的开放阅读框1 194 bp,编码397个氨基酸,等电点为6.03,分子重量为43.29 k Da。基因组扩增得到了1 315 bp的片段,通过序列比对发现该基因含有1个内含子,对其在幼嫩叶片和成熟叶片中的表达进行分析,发现该基因在不同时期的叶片中都有表达,在红色幼嫩的叶片中表达量较高,成熟叶片中表达较低,初步推断该基因可能的叶片中黄酮类物质合成有密切的关系。通过聚类分析发现该基因编码的蛋白与兜兰、白芨等的CHS蛋白序列亲缘关系较近,可以与白芨、问荆草、甘蓝等聚为一类。     

黄灯笼辣椒CcCAD1基因的克隆与植物表达载体的构建

肉桂醇脱氢酶(cinnamyl alcohol dehydrogenase, CAD)在木质素生物合成中有着重要作用,为了探讨辣椒中CAD基因在木质素合成中的作用,本研究利用RT-PCR方法从黄灯笼辣椒幼嫩叶片中克隆得到CAD1基因全长cDNA,命名为CcCAD1。序列分析表明,CcCAD1 cDNA序列全长1 074 bp,编码357个氨基酸。同源比对显示其与番茄CAD1蛋白的一致性高达96.09%。荧光定量PCR检测结果显示,CcCAD1基因在辣椒根、茎、叶、胎座和果肉中的表达量差异显著,其相对表达量为叶果肉茎根胎座。利用Bam HⅠ和SacⅠ双酶切连接成功构建pBI121-CcCAD1植物表达载体,为CcCAD1基因转化以及后续的功能分析提供依据。     

华北紫丁香黄烷酮3-羟化酶基因克隆及表达分析

黄烷酮3-羟化酶(flavanone 3-hydroxylase,F3H)作为黄酮类化合物合成早期的一个关键酶,在花色素合成途径中起重要作用。本研究依托华北紫丁香花序转录组高通量测序数据,结合RACE技术克隆出SoF3H基因,并对SoF3H基因进行生物信息学分析,同时采用实时荧光定量PCR技术分析了该基因的组织表达模式。结果表明,SoF3H基因的c DNA序列全长为1 101 bp,编码366个氨基酸残基;该基因的g DNA序列无内含子;SoF3H基因的组织特异性表达分析表明该基因在花中表达量最大,且在花蕾期表达量最高。本研究将为深入研究华北紫丁香黄烷酮3-羟化酶(SoF3H)在花色素代谢途径中的表达特性提供参考依据。     

夏枯草苯丙氨酸解氨酶基因的克隆与表达分析

苯丙氨酸解氨酶(PAL)是迷迭香酸合成途径中的关键酶之一,根据其他植物PAL基因的保守区域设计特异引物,利用3’-RACE-PCR技术,本研究首次从夏枯草中克隆得到了PAL基因的cDNA片段序列,命名为PvPAL,Gen-Bank登录号为JN65446。PvPAL基因cDNA片段长1 306 bp,其中编码区域为1 047 bp,编码349个氨基酸。蛋白质序列多重比较结果显示,PvPAL蛋白质序列与丹参、地黄、黄芩、藿香等植物的PAL蛋白质高度同源。PAL系统进化树分析结果表明,PvPAL与唇形科植物的PAL基因亲缘关系最近。组织表达分析结果显示,PvPAL基因在根、茎、叶中均表达,其中根中表达量最高。PvPAL基因的克隆为进一步研究夏枯草迷迭香酸合成的分子机制奠定了基础。     

甜菜蔗糖磷酸合酶基因(BvSPS1)的克隆、表达及酶活性分析

蔗糖磷酸合酶是植物中控制蔗糖合成过程中催化6-磷酸果糖转化为蔗糖的关键酶。为了研究该基因的表达特性,本实验采用RT-PCR方法从甜菜中克隆甜菜蔗糖磷酸合酶基因(BvSPS1)。BvSPS1开放阅读框为3138bp,编码1045个氨基酸。推测BvSPS1氨基酸序列跨膜区域位于第561～593位,与酿酒葡萄(Vitis vinifera)和烟草(Nicotiana tabacum)的序列同源性分别为75.45%和74.59%。利用半定量RT-PCR对BvSPS1进行组织特异性表达检测,结果表明该基因主要在主根及侧根表达,在叶和叶柄中表达较弱,酶活性分析结果与之相同。离体叶片在10%葡萄糖溶液中培养6～12h后,BvSPS1基因表达水平提高,在10%蔗糖中培养相同时间则无变化。     

桃果实β-胡萝卜素羟化酶基因的克隆及表达模式分析

胡萝卜素羟化酶是类胡萝卜素合成代谢途径中的关键酶,可以将合成代谢途径中产生的含β-环的类胡萝卜素转化成β-隐黄素和玉米黄素。利用同源克隆技术获得桃果实β-胡萝卜素羟化酶(HYb)基因的全长核苷酸序列,命名为PpHYb。PpHYb基因全长1 405 bp,编码区长933 bp,共编码翻译成310个氨基酸。进化树分析发现PpHYb与草莓FaHYb亲缘性较高。序列分析发现PpHYb与其他物种中的HYb一样,同样含有模体为“HXXXXH”+“HXXHH”的保守基序。实时荧光定量PCR结果显示PpHYb基因在黄肉品种‘金丽’桃果实软核期、硬核期、膨大期、硬熟期和完熟期中均有表达。当果实处于硬熟期之前时,PpHYb基因在果皮和果肉中的表达逐渐升高并达到最大值;当果实处于完熟期时,PpHYb基因在果皮和果肉中的表达略有下降,且在果皮中的表达显著高于果肉。本研究通过对桃果中PpHYb基因的克隆和表达分析,为进一步研究类胡萝卜素生物合成途径提供了基础。     

芒SWN1基因的同源克隆及生物信息学分析

植物次生壁生物合成的转录调控网络是由一系列次生壁NAC开关转录因子介导的。在该网络中,顶层主开关SWNs (secondary wall NACs)转录因子与二级主开关MYBs转录因子共同激活下游转录因子和次生壁生物合成基因的表达,并且在进化上具有保守性。为探究芒次生壁合成调控网络,本研究利用水稻次生壁合成调控基因OsSWN1 (SECONDARYWALL NAC DOMAINPROTEIN 1 from Oryza sativa)通过同源克隆法扩增得到了芒MsSWN1基因的cDNA序列。序列分析显示MsSWN1基因编码区长1 215 bp,编码404个氨基酸。所编码的蛋白质相对分子量为43 181.39 kD,预测其等电点(pI)为6.57,属于亲水蛋白,具有保守的NAC结构域。通过二级结构和三级结构预测分析表明,α-螺旋及不规则卷曲是其蛋白质结构中的主要结构组成元件。序列分析和系统进化树分析显示,芒MsSWN1基因编码的蛋白与甘蔗和高粱亲缘关系最为接近,并且该基因在其他禾本科植物中也具有很高的保守性,推测芒MsSWN1基因可能也具有调控次生壁生物合成的功能。本研究旨在为进一步挖掘和验证芒MsSWN1基因功能提供依据,为未来构建芒次生壁合成调控网络和更高效生产生物燃料提供有益信息。     

紫粒小麦高原115中R2R3-MYB转录因子TaMYB3-4A的克隆及功能分析

花青素在小麦生长发育中参与多种生理生化过程,关于花青素合成机理已被深入研究。本研究利用同源克隆从紫粒小麦高原115中克隆到Ta MYB3-4A基因。Ta MYB3-4A基因组为序列为853 bp,其完整开放阅读框序列为729 bp,含有一个124 bp的内含子;编码蛋白为242个氨基酸,具有典型的MYB结构域,属于R2R3-MYB蛋白。利用不同的MYB蛋白构建系统发育树,Ta MYB3-4A编码蛋白与调控花青素合成的MYB蛋白聚为一类。Ta MYB3-4A与b HLH基因共同瞬时表达能够诱导白色胚芽鞘中花青素的合成。不同组织特异性表达分析,Ta MYB3-4A基因在高原115胚芽鞘和种皮中表达量高,茎中次之,叶片和颖壳中表达量弱,但在根中并未检测到。研究表明Ta MYB3-4A基因编码蛋白为R2R3-MYB转录因子,调控小麦高原115不同组织中花青素生物合成。     

冬凌草HMGS基因的克隆与表达分析

羟甲基戊二酰辅酶A合酶（3-Hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A synthase,HMGS）是甲羟戊酸途径（MVA）中的第一个催化酶。根据冬凌草转录组数据库中HMGS基因序列设计特异引物,采用RT-PCR技术克隆冬凌草IrHMGS基因cDNA全长,并对其序列进行生物信息学分析,通过荧光定量PCR的方法分析其组织表达特性。IrHMGS基因cDNA全长1 382bp,编码460个氨基酸,序列分析结果表明该基因编码的氨基酸序列含有羟甲基戊二酰辅酶A合成酶N末端、C末端等保守结构域。荧光定量PCR表明,IrHMGS在冬凌草组培苗叶和根中的表达量显著高于在组培苗花、茎和愈伤组织中的表达量。本研究为后续深入研究IrHMGS在冬凌草二萜类物质合成途径中的功能奠定了基础。