弓形虫病基因诊断的动物实验研究

目的：建立敏感、特异、稳定的PCR法，用于弓形虫病诊断。方法：选择与合成引物并确立最佳扩增条件，用PCR法检测实验感染鼠血液中弓形虫DNA，并与ELISA法检测循环抗原(CAg)作比较。结果：该PCR检测弓形虫DNA法特异性强，对其他7种寄生虫DNA均不扩增；敏感性高，可检测到0．2pg DNA；检测急性感染弓形虫小鼠血液最早于感染后第2天出现用性，与ELISA法查CAg比较。PCK检测弓形虫DNA法阳性出现时间早、检出率高。结论：该PCR法可应用于弓形虫感染的早期诊断。     

实验动物弓形虫SPA—ELISA检测方法的初步建立

建立用于实验动物弓形虫感染检测的敏感、稳定、特异的 PCR检测体系 ,用 B1基因设计引物 ,建立普通PCR,用 P30基因设计引物 ,建立巢式 PCR;用两种方法检测实验感染弓型虫小鼠血液和腹腔中的 DNA动态变化 ;用巢式 PCR检测自然状态下的豚鼠感染率。结果 ,巢式 PCR可检测到 0 .0 1pg DNA含量 ,比普通PCR敏感 10 0倍 ,且特异性强 ,对其他微生物 DNA无交叉现象 ,稳定性好 ,对同一样品重复检测三次 ,阴、阳性结果一致。小鼠感染弓形虫 2 d后 ,巢式 PCR腹水阳性率为 10 0 % ,血液阳性率为 33.3% ;感染阳性率为 6 6 .7% ;感染 4 d后 ,…     

PCR技术检测RH株弓形虫组织内感染的实验研究

目的：建立敏感，特异的聚合酶链反应（PCR），以检测组织内弓形虫感染。方法：优化PCR反应关键步骤的条件。以相同的B1引物扩增相近的病原体判断其特异性，扩增倍比稀释的DNA检测其灵敏度，并以PCR法检测实验鼠肝，血中DNA的动态变化。结果与免疫组化法进行比较。评价其检测生物学样本的可行性。结果：实验建立的PCR技术的灵敏度能达到检测出一个虫体的DNA，且特异性强，不扩增鼠DNA，人DNA，隐孢子虫，卡氏肺孢子虫，鼠疟原虫的DNA，检测实验感染小鼠血，肝脏样本，在感染后2天，3只鼠血样本PCR结果阳性，3只小鼠肝标本2只阳性；感染后3天至濒死前后有小鼠检测结果均阳性；血样本阳性检出率100%（11/11），肝脏组织样本阳性检出率81.8%(9/11)。结论：PCR方法是一种敏感，特异快速的诊断方法，可用于诊断血和肝脏组织内的弓形虫。     

肝、肾移植术后受者人巨细胞病毒巢式PCR检测

目的 探讨巢式PCR（Nest PCR)检测器官移植术后受体人巨细胞病毒（HCMV）DNA，并与传统ELISA法作方法学对照。方法 巢式PCR针对HCMV AD169株IEA基因设计内外两对引物，对59例肝、肾移植术后受体（肝移植27例、肾移植32例）血、尿标本进行HCMV DNA检测。分离血清作ELISA检测IgG、IgM。结果 血液Nest PCR阳性率肝移植62.9%，肾移植46.8%；ELISA法阳性率：IgG35.5%,IgM27.1%,IgG IgM18.6%，IgM阳性标本（16例）DNA检测皆为阳性，6例IgG、IgM皆阴性标本DNA检测仍为阳性。结论 巢式PCR是一种敏感特异、简便快速诊断HCVM感染的方法，灵敏度及特异性高于传统ELISA，能弥补ELISA的假阴性，更适用于临床检测器官移植术后HCMV感染。     

P43基因在造血干细胞移植患者弓形虫感染诊断中的应用

目的 建立快速、特异、敏感诊断造血干细胞移植(HSCT)患弓形虫感染情况的DNA检测方法，并讨论其临床意义。方法 利用ELISA和PCR方法对56例造血干细胞移植受及20例正常供同时进行检测。结果 检测造血干细胞移植受56例，PCR和ELISA方法检测弓形虫P43基因片段和其抗原，阳性各为10及7例；其阳性率分别为17．86％和14．3％。作为阴性对照的20名正常同时进行弓形虫的检测，其结果均为阴性。结论 体外扩增弓形虫P43基因的方法具有准确、快速、特异和敏感的优点，可以作为造血干细胞移植患弓形虫感染诊断的有价值的方法之一。     

小鼠脾内免疫法制备重组弓形虫SAG1抗原单克隆抗体

 目的 制备小鼠抗重组弓形虫SAG1抗原单克隆抗体,用于早期弓形虫感染的抗原检测。方法 用弓形虫RH株重组抗原SAG1进行常规免疫结合小鼠脾内免疫,杂交瘤技术制备单克隆抗体。ELISA法筛选阳性克隆,经亚克隆建株。诱生腹水法制备抗体,protein-G亲合层析法进行纯化,测定其亚类、效价;Western blot法分析其特异性;夹心-ELISA法检测抗体的敏感性及特异性;检测弓形虫感染小鼠血液循环抗原,同时用PCR法检测弓形虫B1基因并比较结果。结果 获得2株抗重组弓形虫SAG1抗原单克隆抗体3B6、10C4,抗体均为IgG1,轻链均为κ链,Western blot显示2株单抗均能识别弓形虫天然的和重组的SAG1抗原。3B6、10C4敏感度分别为31.3 ng和62.5 ng,与血吸虫病、钩虫病及疟疾患者血清均无交叉反应。弓形虫早期感染检测PCR及ELISA法阳性检出率分别为63.2%、47.4%。结论 成功制备小鼠抗重组弓形虫SAG1抗原单克隆抗体,初步用于早期弓形虫感染诊断。     

检测弓形虫DNA对母儿弓形虫感染的诊断价值

采用PCR技术检测弓形虫DNA结合ELISA监测264例孕妇血清弓形虫循环抗原(CAg)、IgM、IgG抗体。结果显示:外周血弓形虫DNA的阳性率为10.22％,CAg、IgM和IgG的阳性率分别为4.54％、7.57％和9.09％。IgM和/或CAg阳性者,其外周血皆检出弓形虫DNA。同时,我们追踪监测了部分DNA阳性者的羊水、胎盘和脐血。研究认为,PCR技术与ELISA方法相结合,可早期诊断母儿的弓形虫感染。     

儿童淋巴结肿大型弓形虫病21例分析

对 15 3例病因不明的淋巴结肿大采用ELISA法和PCR检测弓形虫 (TOXO)感染。结果 :发现TOXO感染 2 1例 ,其中TOXO -IgG阳性 6例 ,TOXO -IgG、IgM阳性 11例 ,TOXO -IgM阳性 4例。同时测TOXO -DNA阳性 2 1例。认为弓形虫感染是儿童淋巴结肿大的常见病因之一 ,采用ELISA与PCR检测TOXO快速、准确、特异性高。     

实验小鼠弓形虫检测方法的建立和应用

目的 建立小鼠弓形虫抗体检测方法。方法 制备抗原片和可溶性抗原，免疫小鼠制备阳性对照血清，确定了IFA和ELISA检测方法的最适工作条件。根据弓形虫B1基因序列，合成一对寡聚脱氧核糖核苷酸片断，建立PCR检测体系。结果 与IHA法相比较，ELISA、IFA的抗体检出率均显著高于IHA，抗体滴度分析，ELISA抗体滴度高于1FA法。对弓形虫感染鼠不同组织进行PCR检测，可检出特异性扩增条带。结论 建立的IFA和ELISA检测方法具有灵敏度高、重复性好，结果判定明确等优点，是比较有效的监测方法。建立了弓形虫PCR检测体系，经对弓形虫DNA及病鼠各组织的初步检测，证明本PCR体系具有较高的敏感性和特异性。     

109例儿童弓形虫感染者血清学标志模式与Toxo-DNA的对比分析

目的 探讨弓形虫IgG、IgM、CAg及Toxo—DNA对弓形虫感染的诊断意义。方法 采用ELISA法检测弓形虫IgG、IgM和CAg,PCR法检测Toxo—DNA。结果 109例弓形虫感染儿童中,弓形虫IgG、IgM、CAg及Toxo—DNA阳性率分别为63．3％、43．1％、38．5％和41．3％,后三项阳性率相互比较无统计学差异。71例弓形虫IgM( )和／或CAg( )(模式2、3、4、6、7、8)患中,Toxo—DNA阳性38例,IgM和CAg同时阳性18例,IgM单项阳性29例,CAg单项阳性24例。6例弓形虫IgG(-)、IgM(-)和CAg(-)(模式1)患Toxo—DNA均阳性。32例IgG( )、IgM(-)、CAg(-)(模式5)患中有1例Toxo—DNA呈阳性。结论 弓形虫急性感染指标的弓形虫IgM、CAg及Toxo—DNA阳性检出率接近,但仅在部分病例可见2项或3项同时阳性,即三符合率不是很高,提示联合检测弓形虫血清学标志及Toxo—DNA．有助于减少假阴性结果．     

弓形虫感染的临床及实验诊断方法分析

目的：分析弓形虫感染的临床特点，探索简便有效的实验室诊断方法。方法：回顾性分析7例弓形感染临床表现，比较分析不同实验项目的诊断价值。结果：临床表现及一般实验室检查显示多系统损害征象。体液涂片找到弓形虫殡殖子或孢囊。在免疫吸附试验检测血清弓形虫IgM型抗体阳性；PCR检测体液弓形虫特异性DNA片段阳性是弓形虫感染的特有表现。结论：弓形虫感染临床表现及一般实验室检查缺乏特异性，弓形虫形态学，血清学及PCR检测对诊断具有决定性意义。     

延安市义务献血员弓形虫感染调查研究

目的:了解延安市无偿献血人群弓形虫感染和分布情况,为临床安全用血提供科学依据。方法:采用酶联法(ELISA)检测标本血清中抗弓形虫IgG、IgM抗体。结果:共检测368份血清,其中抗弓形虫IgG抗体阳性30例,阳性率为8.15%(30/368);抗弓形虫IgM抗体阳性3例,阳性率为0.82%(3/368);抗弓形虫IgG和IgM抗体阳性33例,阳性率为8.97%(33/368)。献血员的弓形虫感染率年龄、性别和血型之间无显著差异,而不同职业之间虽有显著性差异,但因检测例数偏少,尚不足以说明弓形虫感染与不同职业之间有关。结论:为预防输血后弓形虫病,各地中心血站务须将弓形虫感染指标作为献血员的必检项目。     

检测血清弓形虫IgG抗体的滴金免疫测定法的建立及应用

目的：建立检测血清中弓形虫IgG抗体的简便、快速的滴金免疫测定法。方法：将弓形虫抗原包被于硝酸纤维素膜上,通过胶体金-SPA直接显色,阳性者在膜上出现红色斑点。结果：用该法与间接ELISA法平等对比检测经间接血凝法确定的11份阳性血清和30份阴性健康人血清,结果有良好的一致性。符合率为90.9%。结论：滴金免疫测定法检测血清中弓形虫抗体简便、快速、敏感,无需特殊仪器设备,适于基层应用。     

A comparative study on the performance of two commercial anti-dengue IgM assay kits

The performance of a commercial rapid immunochromatographic dengue IgG/IgM assay device was evaluated against an in-place dengue IgM-capture ELISA in the National Public Health laboratory. Of the 239 serum samples from patients with clinical diagnosis of acute dengue illness, 140 and 99 samples were tested positive and negative respectively for anti-dengue IgM by the in-placed ELISA. Comparatively, 72 and 76 samples were tested positive and negative respectively, and 91 samples gave equivocal results by the rapid dengue test device. The rapid immunochromatographic assay device gave a relative sensitivity of 49.3% and a relative specificity of 62.6%. Though the rapid immunochromatographic assay device has the advantages of rapid testing which simultaneously detects both IgG and IgM and can also be performed with whole blood, serum or plasma, the user has to exercise extreme caution with the interpretation of the test result.     

实验动物弓形虫几种检测方法的应用评价研究

目的:评价检测实验动物弓形虫的2种方法。方法:应用间接免疫荧光法(IFA)、间接酶联染色法(IEA)、间接酶联免疫吸附法(ELISA)对实验动物的血清样品进行检测,以间接免疫荧光(IFA)法作为检测弓形虫的标准方法,比较后2种方法的检出率、敏感性、特异性等。结果血清经IFA、IEA、ELISA检测,分别有32.73%(18/55)、41.86(36/86)和6.34%(4/63)阳性;IFA、IEA两种方法检测血清的阳性率之间无显著性差异(P>0.05),IFA与ELISA两种方法检测血清的阳性率之间有显著性差异(P<0.05)。IEA、ELISA敏感性和特异性分别为100%与86.48%,13.33%与100%;经独立性检验,IFA与IEA两种方法存在关联性(P<0.05),IFA与ELISA两种检测方法相互独立(P>0.05)。结论:与IFA相比,IEA检测弓形虫抗体具有相似的敏感性及特异性,检出率较高,可适用于基层单位实验动物弓形虫抗体的检测;ELISA检测弓形虫抗体敏感性不高,检出率低,仍需进一步探讨和完善。     

巢式PCR扩增诊断播散性毛孢子菌病的动物实验研究

目的探讨应用PCR技术诊断播散性毛孢子菌病的可行性.方法建立动物模型后,于接种3、7、14 d分别采集小鼠眶静脉血和肝脏组织标本,进行真菌培养和巢式PCR扩增.结果小鼠静脉接种3、7、14 d后血清培养的阳性率分别为0、20%、0,而巢式PCR的阳性率分别为80%、90%、88.9%;在上述时相点,肝脏组织真菌培养阳性率分别为50%、40%、22.2%,而巢式PCR的阳性率分别为90%、90%、88.9%.血清和肝脏组织真菌培养阳性率与巢式PCR阳性率差异均具有统计学意义(P＜0.05,P＜0.01).结论巢式PCR扩增T. asahii特异性DNA片段,可作为播散性毛孢子菌病的一种特异、灵敏、快捷的早期诊断手段.     

LAMP技术检测弓形虫感染方法的建立

目的建立一种快速、简便的检测弓形虫感染的环介导等温扩增方法(LAMP)。方法根据弓形虫RH株SAG1基因序列合成2对特异性LAMP引物,优化扩增体系与参数。通过与常规PCR方法的比较,评估优化后的LAMP反应的特异性和灵敏性。利用建立的LAMP初步检测人工感染弓形虫4 d后白兔与大鼠的肌肉组织。结果 LAMP法检测弓形虫基因组DNA的灵敏度是传统PCR方法的100倍。LAMP法检测与其他常见寄生原虫、寄生虫无非特异性阳性结果。LAMP法检测人工接种动物的肌肉组织,阳性率达到100%,对照组为0,差异有统计学意义(P0.01)。结论 LAMP法检测弓形虫感染快速简便、敏感性高、设备要求低,具有较好的应用前景。     

重组GRA5蛋白免疫诊断弓形虫病价值的研究

目的 原核表达的刚地弓形虫致密颗粒蛋白5(rGRA5)免疫诊断价值的探讨.方法 GRA5基因在RT-PCR被扩增,构建pET28a-GRA5原核表达载体,双核酸内酶切及序列测定进行鉴定,pET28a-GRA5IPTG诱导表达后,SDS-PAGE和Western blot法检测该重组蛋白的表达.建立以纯化的重组蛋白的间接ELISA法,检测收集样本血清中弓形虫特异性抗体.结果 PCR反应扩增出为363 bp大小的GRA5基因,所构建的pET28a-GRA5原核表达载体经双酶切显示插入片段大小与上相符,DNA测序结果表明与GenBank中录入的GRA5基因经Blast比对序列同源性100%,原核细胞表达的该重组蛋白在SDS-PAGE和Western blot中均有显示(约14 ku).本实验建立的ELISA法检测的100例弓形虫感染者(血清学阳性)血清中有73例呈阳性,阳性率为73.0%(73/100),其中40例IgG阳性标本的阳性率为72.5%(29/40),30例IgM阳性标本的阳性率为53.3%(16/30),30例IgG、IgM均阳性标本的阳性率为93.3%(28/30),30例阴性血清标本的阳性率仅为6.7%(2/30).结论 本实验获得的原核表达的rGRA5具有一定的弓形虫病免疫诊断的潜在价值.     

献血员血清抗－HCV－IgM检测及其意义

目的探讨献血员血清抗－ＨＣＶ－ＩｇＭ与ＨＣＶ感染的关联性。方法献血员血清８３６份。以ＨＣＶ混合抗原包被聚苯乙烯反应板微孔，以辣根过氧化物酶标记的羊抗人ＩｇＭ单克隆抗体为酶标抗体，建立ＥＬＩＳＡ检测血清抗－ＨＣＶ－ＩｇＭ。以第二代ＥＬＩＳＡ法检测抗－ＨＣＶ－ＩｇＧ，以ＰＣＲ检测血清抗－ＨＣＶ－ＩｇＧ或抗－ＨＣＶ－ＩｇＭ阳性样品中的ＨＣＶ－ＲＮＡ。结果２－巯基乙醇破坏试验及ＨＣＶ抗原抑制试验结果显示，以所建立的ＥＬＩＡＳ检测到的为ＨＣＶ特异ＩｇＭ，批内变异系数为３．４７％，批间变异系数为７．０６％。８３６份献血员血清中，有２份抗－ＨＣＶ－ＩｇＧ阴性而抗－ＨＣＶ－ＩｇＭ和ＨＣＶ－ＲＮＡ均阳性。结论本研究中建立的ＥＬＩＳＡ可较好地用于检测血清抗－ＨＣＶ－ＩｇＭ、献血员筛选及防止丙型肝炎传播。