缺血后处理对缺血再灌注后海马CA1区神经元蛋白酶体活性的影响

目的 探讨缺血后处理对短暂脑缺血后海马CA1区神经元内蛋白酶体活性及氧化性蛋白质损伤的影响.方法 采用大鼠全脑缺血模型.Wistar大鼠分为缺血组及缺血后处理组,每组按照再灌注时同进一步分为12 h恢复组,24 h恢复组,48 h恢复组及72h恢复组.缺血后处理为在脑缺血结束后给予三个循环的30 s缺血和30 s再灌注处理.采用HE染色光镜观察脑缺血后神经元死亡;用Succinyl-LLVY-AMC作为底物检测蛋白酶体的活性变化;差速离心结合蛋白印迹分析蛋白酶体相关蛋白的表达.结果 HE染色显示缺血后处理显著降低了脑缺血再灌注后海马CA1区神经元死亡;酶活性检测,缺血后处理使得蛋白酶体的活性显著提高;蛋白印迹分析显示,缺血后处理显著提高了蛋白酶表达.结论 缺血后处理能够显著改善脑缺血后海马CA1区神经元内蛋白酶体的活性,降低了缺血再灌注后海马CA1区神经元死亡.     

EphA4-ephrinA3系统在海马脑区缺血/再灌注中的表达变化

目的观察海马EphA4-ephrinA3的分布特点及在缺血/再灌注过程中的动态变化规律,了解EphA4-ephrinA3对在海马CA1区神经元迟发性死亡中影响。方法采用经典的四血管夹闭短暂前脑缺血/再灌注模型,通过TUNEL染色观察缺血/再灌注后6h、24h、48h各组海马神经元凋亡情况,同时检测Caspase 3的活性,并以western blot检测EphA4及ephrin A3蛋白表达的变化。结果短暂前脑缺血/再灌注可以引起海马CA1区神经元迟发性死亡。Caspase 3活性在缺血/再灌注后明显升高,再灌注6h、24h、48h(OD值分别为2.30±0.19,2.20±0.28,1.90±0.015)与sham组(OD值为1.100±0.017)比较有统计学意义(P<0.05)。大鼠海马组织EphrinA3蛋白表达显著增加,再灌注6h、24h(IOD值为2.05±0.12vs 0.78±0.02,P<0.05),与对照相比有统计学意义,再灌注48h逐渐回复至对照组水平。EphA4也有缺血诱导的增高,再灌后6h和24h与对照组相比均有明显增高(2.21±0.12vs 0.72±0.03,P<0.05)。结论短暂脑缺血/再灌注可诱导海马CA1区ephrinA3与EphA4的表达明显增高,其时间过程与Caspase增高的时间过程一致,提示ephrinA3与EphA4的表达增高可能在CA1区神经元损伤过程中发挥重要作用。     

阿魏酸钠对反复前脑缺血再灌注大鼠海马及额叶胶质纤维酸性蛋白表达的影响

目的 探讨内皮素(ET)受体拮抗剂阿魏酸钠对大鼠前脑缺血再灌注后海马和额叶胶质纤维酸性蛋白(GFAP)表达的影响.方法 双侧颈总动脉夹闭法制备大鼠前脑缺血再灌注模型,HE染色观察阿魏酸钠治疗前后海马CA1区神经元形态学改变,免疫组化法检测缺血再灌注后2、4、6 w海马和额叶胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达.结果 阿魏酸钠治疗组海马神经元缺失、变性、坏死较对照组轻,缺血再灌注后海马和额叶GFAP的表达随时间延长逐渐增多,阿魏酸钠治疗组GFAP的表达较假手术组多,较缺血再灌注组减少,差异显著(P<0.05).结论 大鼠前脑缺血再灌注后GFAP表达增多,阿魏酸钠能够降低其表达,对脑缺血性损伤具有保护作用.     

肢体缺血预处理诱导大鼠缺血再灌注海马HSP70表达

目的探讨肢体缺血预处理(limb ischemic preconditioning,LIP)对大鼠缺血再灌注海马HSP70表达的影响。方法将66只凝闭椎动脉大鼠随机分为假手术组、脑缺血组和LIP+脑缺血组,后两组根据脑缺血后再灌流时间不同进一步分为1、62、4、72和120 h组。采用免疫组织化学方法检测海马HSP 70的变化。结果假手术组海马各区未见明显的HSP70表达。脑缺血组海马CA1区未见明显着色,但在CA3区及齿状回颗粒细胞中可见HSP70着色,以再灌注后24 h最明显。在LIP+脑缺血组,海马CA1区于再灌注1 h未见明显的HSP70表达;再灌注6 h HSP70表达明显增强,与假手术组和脑缺血6 h组比较,阳性细胞数明显增加(P<0.01);再灌注24 h HSP70表达达高峰;再灌注72 h HSP70表达有所下降;至再灌注120 h HSP70表达明显下降。结论损伤性脑缺血前给予LIP,可明显增加CA1区HSP70的阳性表达,诱导CA1区锥体细胞耐受缺血损伤。     

c-fos在肢体缺血预处理抗脑缺血再灌注损伤中的作用

目的探讨c-fos在肢体缺血预处理(LIP)抗脑缺血再灌注损伤中的作用。方法将54只凝闭椎动脉大鼠随机分为假手术组、脑缺血组和LIP+脑缺血组。依据脑缺血后再灌注时间不同,将脑缺血组和LIP+脑缺血组进一步分为16、、247、2 h组,每组大鼠6只。采用免疫组织化学方法检测海马c-fos蛋白的变化。结果假手术组海马各区神经元中未见明显的c-fos蛋白表达阳性产物。脑缺血组海马CA1区再灌注后各个时间点均未见明显的c-fos阳性表达,而海马CA3区再灌注6 h时锥体细胞和齿状回颗粒细胞核中出现大量c-fos蛋白阳性表达产物,再灌注24h时,c-fos的表达开始减弱,72 h时消失。在LIP+脑缺血组,再灌注1 h海马CA1区出现少量c-fos的弱阳性表达;再灌注6 h时,CA1区c-fos表达明显增强,阳性细胞数、阳性细胞总面积和平均吸光度均较假手术组显著升高(P<0.01);再灌注24 h时,CA1区c-fos表达趋于减少;至再灌注72 h时,CA1区c-fos表达恢复至假手术组水平(P>0.05)。结论LIP诱导CA1区c-fos的表达上调可能参与LIP抗脑缺血再灌注损伤作用。     

大鼠全脑缺血再灌注后海马CA1区神经元凋亡机制的研究

目的 研究大鼠全脑短暂缺血再灌注后海马CA1区椎体神经元的死亡机制.方法 采用经典的四血管夹闭法制作大鼠全脑缺血再灌注模型,取缺血再灌注后不同时间(6 h、24 h、48 h)的海马CA1区脑组织,用ELISA检测Caspase-3的活性变化.同时运用免疫印记方法检测PKC、NMDA受体NR2A及NR2B亚基磷酸化水平的变化.结果 与对照组相比,Caspase-3检测显示缺血再灌注6 h、24 h、48 h海马CA1区椎体神经元呈现逐渐凋亡增多的迟发性死亡.磷酸化蛋白激酶C在缺血6 h即有明显增高,并且于24 h、48 h达到表达高峰(P<0.05);NMDA受体亚基NR2A和R2B的磷酸化水平缺血再灌注后均呈现明显升高趋势.讨论 PKC、NR2B、CaMⅡ级联反应的发生可能是大鼠全脑缺血再灌注后海马CA1区锥体神经元发生迟发性死亡的重要机制.     

缺血后处理对全脑缺血再灌注大鼠海马区神经元自噬的影响

目的探讨缺血后处理对脑缺血再灌注大鼠海马区神经元自噬表达的影响。方法采用改良的Pulsinelli四血管闭塞(4-VO)法制作脑缺血再灌注模型,雄性SD大鼠72只随机平均分为3组:假手术组(Sham组)、脑缺血再灌注模型组(CIR组)、脑缺血后处理组(CIP组),每组又分为6 h、24 h、48 h、72 h 4个时间点,通过苏木素-伊红(HE)染色检测海马区各时间点神经元形态及存活数量变化;应用免疫组织化学染色法测定自噬相关基因Beclin-1、LC3-Ⅱ的表达情况;Western印迹检测海马区自噬相关基因Beclin-1、LC3-Ⅱ的蛋白含量。结果与Sham组比较,其他两组大鼠海马神经元结构破坏,各时间点存活神经元数量显著下降(P<0.05),LC3-Ⅱ、Beclin-1表达显著增加(P<0.05);与CIR组比较,CIP组神经元结构损伤减轻,各时间点存活神经元数量明显增多(P<0.05),LC3-Ⅱ、Beclin-1的表达明显增加,其中24 h表达最高,差异有统计学意义(P<0.05)。结论脑缺血后处理通过促进自噬相关基因表达上升,减轻脑缺血再灌注损伤。     

大鼠脑缺血再灌注后海马CA1区超微结构及Apaf-1表达的变化

目的 观察大鼠脑缺血再灌注后海马CA1区超微结构及凋亡相关基因凋亡蛋白激活因子(Apaf)-1表达的变化.方法 健康雄性SD大鼠随机分为假手术组和模型组,其中模型组缺血30 min后再灌注,根据再灌注时间不同又分为2、24、72 h3个亚组.采用Pulsinelli四血管阻断法建立大鼠全脑缺血再灌注模型,透射电镜下观察海马CA1区神经元超微结构变化,免疫组织化学法和Western印迹法检测大鼠海马组织凋亡相关基因Apaf-1蛋白表达的变化.结果 透射电镜结果显示:假手术组海马CA1区神经元胞核较大,呈圆形或椭圆形,核膜清晰完整,常染色质呈细颗粒状均匀分布,胞浆内可见丰富的细胞器.模型2h组海马CA1区神经元核膜凹陷,核染色质密度增高,线粒体轻微肿胀;模型24 h组海马CA1区神经元核膜邹缩严重,核仁物质增多、偏移,线粒体结构松散、空泡状,线粒体嵴断裂,粗面内质网脱颗粒;模型72 h组海马CA1区神经元核固缩,核染色质呈团块状边集于核膜下,线粒体不同程度脱空.免疫组化和Western印迹结果显示:假手术组Apaf-1蛋白仅有少量表达,模型组各时间点Apaf-1蛋白表达均增高(P＜0.05).结论 大鼠脑缺血再灌注可导致海马CA1区神经元的凋亡,这可能与凋亡相关基因Apaf-1的激活有关.     

吡格列酮对脑缺血大鼠海马CA1区胶质纤维酸性蛋白和周期蛋白D1表达的影响

目的 探讨过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator-activated receptor-γ,PPARγ)激动剂吡格列酮对脑缺血大鼠海马CA1区胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)和周期蛋白D1表达的影响.方法 54只Sprague-Dawley大鼠随机分为假手术组、缺血再灌注组和吡格列酮干预组,每组18只.采用改良线栓法制作大鼠大脑中动脉闭塞再灌注模型.吡格列酮干预组在模型制作前连续5d吡格列酮灌胃(0.65 mg/kg,1次/d).在模型制作后1d、3d和7d时(每个时间点6只)处死大鼠取脑.HE染色观察海马CA1区神经元病理学变化.免疫组化染色法检测海马CA1区GFAP和周期蛋白D1表达.结果 缺血再灌注组海马CA1区神经元存活数量在缺血再灌注3d和7d时均较假手术组显著减少(P均＜0.01),GFAP和周期蛋白D1在各个时间点表达均较假手术组显著上调(P均＜0.01).吡格列酮干预组海马CA1区神经元存活数量在缺血再灌注3d和7d时均较缺血再灌注组显著增多(P均＜0.01),GFAP和周期蛋白D1在各个时间点表达均较缺血再灌注组显著下调(P均＜0.01).结论 PPARγ激动剂吡格列酮对脑缺血再灌注大鼠海马CA1区神经元具有明显的保护作用,其机制可能与抑制GFAP和周期蛋白D1表达有关.     

氟桂利嗪对缺血再灌注后沙土鼠CA1区迟发性神经元死亡的保护作用

目的　探讨迟发性神经元死亡(DND)发生的机制及氟桂利嗪对海马CA1区神经元的保护作用。方法　将实验动物随机分为脑缺血再灌注组、给药组及假手术组。采用免疫组织化学染色及电镜下观察脑组织病理变化的方法观察缺血再灌注后海马各亚区谷氨酸及神经生长因子的表达变化及氟桂利嗪的神经保护作用。结果　脑缺血再灌注第1天和第2天海马各亚区谷氨酸表达增高,与药物组及对照组比较差异显著(P <0 .0 1) ,其第2天表达增高最为显著,与第1天比较P <0 .0 1;脑缺血再灌注第1天和第2天海马CA1区神经生长因子表达增高,与药物组及对照组比较P <0 .0 1,其第2天表达增高最为显著,与第1天比较P <0 .0 5 ;脑缺血再灌注第7天见海马CA1区神经元广泛性脱失,胶质细胞大量增生,缺血再灌注组和给药组海马CA1区存活的神经元均少于对照组(P <0 .0 1) ,但给药组存活的神经元数目又明显多于缺血再灌注组(P <0 .0 1)。结论　氟桂利嗪可以阻止谷氨酸的持续性高表达及神经生长因子的表达下降,从而对DND的发生起到保护作用。