用流式细胞术结合单克隆抗体CD71,Ki-67和PCNA研究儿童急性淋巴细胞白血病的细胞增殖(英文)

为研究儿童急性淋巴细胞白血病的细胞增殖动力学,我们用流式细胞术结合单克隆抗体CD71,Ki-67和增殖性细胞核抗原(PCNA)检测了21例初诊急性淋巴细胞白血病(ALL)儿童骨髓细胞的增殖性抗原表达情况。结果表明:白血病细胞的CD71标记指数(LI)与正常细胞相比无显著差异,且个体间异质性较大;白血病细胞的Ki-67和PCNA的LI明显高于正常细胞,每例标本的PCNA LI均高于Ki-67LI,两者间有明显相关关系。本实验结果提示白血病细胞的增殖活力明显高于正常细胞,单克隆抗体Ki-67和PCNA是检测白血病细胞增殖活力的有效生物学指标,且PCNA的敏感性高于Ki-67。     

儿童和成人急性淋巴细胞白血病中Ki-67和Bcl-2表达的临床意义

为了观察Ki-67和Bcl-2在儿童和成人ALL中的表达，探讨其与ALL免疫学分型和临床疗效的关系，用链霉菌抗生物素蛋白-碱性磷酸酶（SAP）免疫组织化学染色的方法，对18例儿童急性淋巴细胞白血病（ALL）和43例成人声ALL患者的骨髓或外周血进行Ki-67抗原和Bcl-2蛋白的检测。结果表明：Ki-67抗原在儿童ALL中的表达略低于成人ALL，但差异无显著性（P〉0．05）；而Bcl-2蛋白在儿童ALL中的表达显著低于成人ALL（P〈0．05）；在儿童和成人ALL上各免疫表型中，T细胞、伴有髓系抗原标记的急性淋巴细胞白血病（My^＋ALL）的Ki-67阳性表达率显著高于成人（P〈0．05）；儿童和成人ALL的完全缓解率（CR）在Ki-67和Bcl-2两项同时低表达组中最高，仅一项低表达组中次之，两项均高表达组中最低。结论：对儿童和成人ALL患者进行增殖相关抗原Ki-67和抗凋亡蛋白Bcl-2的检测，能反映患者肿瘤细胞的增殖活性和凋亡抑制情况，硒-67和Bcl-2的表达与白血病ALL类型和临床疗效密切相关。     

CD34在成人急性髓系白血病中的表达及其意义

近年来．随着急性白血病免疫标记的进展，人们发现某些细胞分化抗原在急性髓系白血病（AML）细胞的表达存在较大的差异，其表达频率与临床化疗疗效、预后有一定的相关性。CD34抗原在正常骨髓白细胞中表达约为1％～4％．而在AML细胞上则有较高频率的表达。为探讨CD34抗原在AML细胞表达情况及临床意义，我们对71例成人AML患者骨髓细胞进行了CD34检测，同时分析CD34抗原表达与临床特征及疗效的关系。现将结果报告如下。     

输卵管妊娠患者外周血清人绒毛膜促性腺激素与局部病变组织Ki-67表达及滋养细胞浸润深度的研究

目的 将细胞增殖抗原Ki-67做为细胞增殖活性指标来探讨滋养细胞活性及输卵管患者血人绒毛膜促性腺激素(β-hCG)与滋养细胞浸润深度的关系.方法 将108例手术治疗的输卵管妊娠患者所取术中切除的输卵管标本,进行光镜检查,根据滋养细胞浸润深度分为3组,Ⅰ组为滋养细胞浸润输卵管黏膜层,Ⅱ组为滋养细胞浸润肌层,Ⅲ组为滋养细胞浸润浆膜层.采用SP法检测各组标本中Ki-67的表达及术前2h内采静脉血检测 β-hCG.并对β-hCG与病变组织中Ki-67的表达及滋养细胞浸润的深度进行分析.结果 Ⅰ组的平均血β-hCG值为(1416.64±859.94)U/L,细胞增殖抗原Ki-67的阳性表达率为21.95％,Ⅱ组平均血β-hCG值为(3380.33±2392.36)U/L,细胞增殖抗原Ki-67阳性表达率为53.66％,Ⅲ组血清β-hCG值最高,平均(6999.33±4949.90)U/L,细胞增殖抗原Ki-67的阳性表达率为86.46％.Ki-67阳性表达Ⅰ组与Ⅱ组、Ⅱ组与Ⅲ组、Ⅰ组与Ⅲ组比较差异均有统计学意义(x2值分别为3.94、4.07、4.35,P均＜0.05);3组患者血β-hCG值比较差异有统计学意义(F=9.914,P＜0.01);Ki-67的阳性表达与患者血清β-hCG水平具有相关性,两者呈正相关(r=0.678,P＜0.05).结论 血清β-hCG水平越高,提示滋养细胞Ki-67阳性表达率越高,滋养细胞浸润输卵管壁亦越深.     

JWA基因在HL-60细胞定向分化中的表达及意义

为了研究JWA基因在HL-60细胞定向分化中的表达规律,探讨其在白血病细胞分化和凋亡中的意义及可能的作用机制,应用FCM检测HL-60细胞经ATRA（10^-6 mol/L）、Ara-C（10 ng/ml）、TPA（10^-8 mol/L）作用后2、4、6、8天CD13、CD14、CD15、CD11b改变及细胞周期变化;应用半定量RT-PCR及蛋白印迹技术检测JWA基因在HL-60细胞定向分化中的表达趋势以及相关凋亡因子Bcl-2、HSP27和HSP70的表达.结果表明：经上述药物分别处理HL-60细胞后,不同时段FCM相关指标检测结果证明其分别向粒、单核、巨噬细胞样分化.JWA基因表达呈时间依赖性升高;Bcl-2则呈时间依赖性下降;HSP70在ATRA及TPA组与JWA表达呈正相关,与Bcl-2呈负相关,而各组HSP27并无表达.ATRA处理HL-60细胞后JWA基因表达趋势与原代细胞相反,且不需要ATRA诱导分化作为前提.分别以Ara-C 10 ng/ml和Ara-C 20 ng/ml处理HL-60细胞后,JWA基因的表达呈反向变化,即前者呈时间依赖性增加,而后者则下降.结论：JWA基因在实现ATRA及TPA诱导白血病细胞分化和凋亡中可能具有双重调节作用;JWA基因表达的高低与Ara-C诱导分化作用及细胞毒作用有关;HL-60细胞与原代白血病细胞在诱导分化机制方面可能不尽相同.     

T细胞急性淋巴细胞白血病免疫表型分析

本研究探讨T细胞急性淋巴细胞白血病（T-ALL）免疫表型特点。应用一组系列相关单克隆抗体和CD45/SSC设门的三色流式细胞术对140例T-ALL进行免疫表型检测。结果显示,白血病细胞表面T系抗原表达依次为CD7〉CD2〉CD3〉CD5,近20%患者CD10表达阳性。140例患者中12例带有B系抗原标记,阳性率达8.57%;136例中31例带有髓系抗原标记,阳性率达22.79%,所有病例均无CD14表达。干/祖细胞标记CD34表达阳性率31.06%,41例CD34＋T-ALL髓系抗原表达15例,阳性率36.59%,91例CD34-T-ALL髓系抗原表达14例,阳性率15.38%,二者具有统计学差异（p〈0.01）。儿童T-ALLCD3表达高于成人（p〈0.05）,而CD33表达明显低于成人（p〈0.01）结论：免疫表型分析是诊断T-ALL的重要手段,T-ALL免疫表型具有异质性。     

TPA诱导K562细胞分化过程中线粒体铁蛋白表达情况研究

为了研究K562白血病细胞在十四烷酰佛波醇-乙酯（TPA）诱导分化过程中线粒体铁蛋白（MtF）、运铁蛋白受体Ⅰ（TfR1）和铁蛋白（Fn）mRNA表达水平的变化情况,并探讨MtF在白血病细胞增殖和细胞铁代谢方面的作用,采用TPA（终浓度16nmol/L）诱导K562白血病细胞向单核细胞定向分化,并于诱导分化后第1、3和5天收集细胞,用瑞氏染色法观察各时点细胞形态,流式细胞术检测细胞表面分化抗原CD64的表达水平,使用半定量RT-PCR方法检测各时点细胞MtF、TfR1和Fn mRNA表达水平,管家基因β-actin用作对照。结果表明,TPA（16nmol/L）可诱导K562细胞向单核细胞分化,细胞呈现单核细胞典型的形态学特征,在诱导培养第5天诱导分化率可达95%,细胞表面CD64表达水平显著增加。诱导分化前K562细胞具有一定水平MtF表达,但随着TPA诱导细胞分化的增强,MtF和TfR1 mRNA表达水平进行性下调,诱导分化第5天的表达水平分别为诱导分化前的50.3%和68.2%,而Fn mRNA表达水平则逐渐上调,诱导分化第5天表达水平为诱导分化前的1.97倍。结论：TPA诱导K562细胞向单核细胞分化过程中MtF和TfR1 mRNA表达下调,而Fn mRNA表达上调;这种协调变化有助于降低细胞通过TfR1介导的铁摄取,从而抑制或影响细胞增殖能力。     

Survivin、Ki-67核抗原在涎腺基底细胞腺瘤、癌中的意义

目的探讨涎腺基底细胞腺瘤、癌中survivin表达与Ki-67核抗原表达的相关性,了解其在肿瘤恶性增殖及良恶性肿瘤鉴别诊断中的意义。方法应用免疫组织化学方法检测15例正常涎腺组织、28例涎腺基底细胞腺瘤、23例基底细胞腺癌组织中survivin及Ki-67核抗原的表达;RT-PCR分析2例涎腺基底细胞腺瘤及2例涎腺基底细胞腺癌survivin、Ki-67的mRNA表达水平。结果 Survivin及Ki-67核抗原在正常涎腺组织、基底细胞腺瘤、基底细胞腺癌中的表达依次递增,差异有统计学意义(P0.01);Ki-67核抗原的表达随survivin表达增加而上升(P0.05)。涎腺基底细胞腺癌survivin mRNA表达水平高于基底细胞腺瘤。结论 Survivin、Ki-67核抗原的过度表达可能参与涎腺基底细胞腺瘤的恶性增殖过程,并且可作为基底细胞腺瘤、癌的鉴别诊断分子指标之一。     

急性白血病Ki-67的表达研究

目的检测急性白血病Ki-67的表达,探讨细胞增殖在白血病发生中的作用.方法运用免疫组织化学技术检测Ki-67在25例急性白血病患者骨髓组织切片上的Ki-67表达,以良性血液病患者作为正常对照组.结果 25例急性白血病Ki-67表达水平[(34.18±17.20)%]明显高于对照组[(12.17±6.23)%,P<0.01];急性淋巴细胞性白血病的Ki-67表达[(31.19±14.25)%]与急性非淋巴性白血病[(36.28±11.87)%,P>0.05]无差异;缓解的白血病患者Ki-67水平接近对照组.结论增殖作用增强可能在白血病发生发展中起重要作用,Ki-67可作为细胞增殖的良好标志.     

脐血CD34^＋细胞向肝细胞分化的体内外实验

目的:以脐血CD34 细胞为起始细胞,分别在人体外和肝受损的重度联合免疫缺陷小鼠体内诱导CD34 细胞向肝细胞转化。方法:实验于2004-09/2005-06在反应器工程国家重点实验室进行。取健康足月产妇的新鲜脐血,产妇知情同意。采用密度梯度离心法分离脐血单个核细胞。将单个核细胞悬浮于免疫磁珠法缓冲液中,获取CD34 细胞。将CD34 细胞在干细胞因子 白细胞介素3 白细胞介素6细胞因子组合中培养1周,然后在肿瘤抑制素 成纤维细胞因子1 成纤维细胞因子2 白血病抑制因子 肝细胞生长因子 表皮生长因子组合中诱导其向肝细胞分化。将2-乙酰氟氨以0.4mg/只的剂量通过腹腔注射输入到重度联合免疫缺陷小鼠体内。7d后再腹腔注射入0.4mL/kg的CCl4,同时向实验组小鼠尾部静脉注射CD34 细胞,对照组小鼠则仅输注2-乙酰氨芴和CCl4。分别于4,6周后采用流式细胞术检测小鼠肝脏中的人源细胞,并用RT-PCR和免疫组化方法检测人源血清白蛋白基因和抗原的表达。结果:①CD34 细胞体外培养过程中,细胞总数扩增了近30倍,并且在培养21d收获的细胞中可检测到人血清白蛋白基因和抗原的表达,CD34 在体外被诱导成肝样细胞。②采用流式细胞术检测重度联合免疫缺陷小鼠肝脏中的人源细胞,并用RT-PCR和免疫组化的方法检测人源血清白蛋白基因和抗原的表达,4周时发现小鼠肝脏中含有7.66%的人源细胞,但人源细胞不表达血清白蛋白基因和抗原。6周时重度联合免疫缺陷小鼠肝脏中的人源细胞的比例增加至31.10%,并且人源细胞开始表达血清白蛋白基因和抗原。结论:CD34 细胞无论在体外培养还是在肝脏受损的重度联合免疫缺陷小鼠体内均能成功转化为肝实质细胞。     

儿童急性淋巴细胞白血病骨髓细胞增殖活力与预后观察研究

目的 检测儿童急性淋巴细胞白血病细胞增殖性抗原表达情况,观察其与预后的关系。方法 用流式细胞仪结合仪细胞增殖性抗原ＣＤ７１,Ｋｉ－６７和增殖细胞核抗原（ＰＣＮＡ）检测１２名正常儿童和３５例急性淋巴细胞白血病（ＡＬＬ）患儿骨髓细胞的表达率、观察８治疗前后增殖指数（ＬＩ）的变化及其与预后的关系。     

Prediction of interferon therapy efficacy in chronic myeloid leukemia according to data of histomorphological study

AIM: To investigate factors determining prognosis and efficacy of induction therapy including interferon-alpha-2b (intron-A, Schering Plough) in patients at an early chronic stage of Ph-positive chronic myeloid leukemia (CML) as shown by histomorphological examination. MATERIAL AND METHODS: The analysis covered 52 CML patients treated at an early chronic phase with intron-A in a standard daily dose 5 IU/m2 in combination with low-dose cytosinearabinoside (10 mg/m2, s.c. , daily for 10 days of each month). The treatment efficacy was assessed by the international criteria of complete and partial hematological remission and cytogenetic response. The cytogenetic study employed the direct method, even and G-differential staining, fluorescent hybridization in situ (FISH). The sections were stained with hematoxilin-eosine by Gomori, van Gieson. Histological samples were examined with histomorphometry. Immunohistochemical examination was made on paraffin sections using a panel of monoclonal antibodies CD3, CD4, CD8, CD20, NK, PCNA, Ki-67 (Dako, Denmark). RESULTS: Repeated assessment of histomorphological parameters such as erythroid lineage, degree of myelofibrosis and reduction of leukemic population indicate the treatment efficacy. Estimation of the level of leukemic population proliferation in trephine biopsies from CML patients with monoclonal antibodies PCNA and Ki-67 before the treatment is prognostically significant as it further correlates with the cytogenetic response (r = 0.821, p = 0.000000). CONCLUSION: It is valid to study histomorphological picture of CML to prognosticate and assess treatment efficacy with standard doses of interferon-alpha with high probability.     

白血病细胞的Ki-67表达与细胞周期的关系

用ABC方法检测白血病细胞Ki-67阳性率,并与同时用流式细胞仪检测的DNA倍体、S+G_2M细胞比例作比较,发现Ki-67阳性率与S+G_2M细胞比例关系十分密切;二者与DNA倍体之间都有非常显著关系。在白血病各亚型中,Ki-67阳性率与S+G_2M细胞比例表现一致。白血病组高于对照组;急性白血病组高于慢性白血病组;急性淋巴细胞白血病组高于急性非淋巴细胞白血病组。急性白血病中,治疗前Ki-67阳性率和S+G_2M细胞比例在缓解组低于未缓解组。因此,可以认为用ABC方法检测Ki-67阳性率与用流式细胞仪测定DNA单参数一样,作为白血病诊断、分析及预后判断的指标,而且更方便、价廉。     

三染色-流式细胞术检测急性B淋巴细胞白血病微量残留病的研究

目的 建立三染色－流式细胞术检测微量残留白血病细胞。方法 利用三染色－流式细胞仪检测急性B淋巴细胞白血病患独骨髓中的CD10^ CD22^ CD45^-或dim表现型白血病细胞。结果 在23例急性B淋巴细胞白血病患儿骨髓中均可检测到CD10^ CD22^ CD45^-或dim表现型细胞,检测敏感度约为10^－4。正常人骨髓、化疗后再和髓和长期完全缓解的白血病患儿的未检测到CD10^ CD22^ CD45^-或dim表现型细胞。该法可在化疗后50d内监测到白血病细胞的变化,并且在骨髓细胞形态学确认复发之前即可检测到白血病细胞逐渐增加。结论 利用三染色－流式细胞仪检测骨髓中的CD10^ CD22^_CD45^-或dim表现型白血病细胞可以敏感地监测到急性B淋巴细胞白血病患儿微量残留病的变化。     

Acute lymphoblastic leukaemia cells express CCR7 but not higher amounts of IL-10 after CD40 ligation

OBJECTIVE: Production of cytokines that support T-cell activation and proliferation and migration to lymph nodes is one of the most important terms of cancer vaccine development. In previous studies we and others used CD40 ligation to obtain higher expression of co-stimulatory and adhesion molecules on leukaemic cells from children with acute lymphoblastic leukaemia (ALL). This time we assess the cytokine and chemokine gene expression profile in CD40-stimulated ALL cells. MATERIAL AND METHODS: Malignant cells from 25 children with BCP-ALL were stimulated (or not) with huCD40LT and rIL-4 for 96 h. Eleven different molecule, cytokine and chemokine mRNAs levels (CCR7, IL-23, TGF-beta-IP, IFN-gamma, IL-10, CD1a, CD40, CD54, CD80, CD83, CD86) were determined using the real-time PCR technique with TaqMan chemistry using ready-to-use low-density arrays for gene expression by Applied Biosystems. RESULTS: 1) Increases in mRNA levels for CD40, CD54 and CD80 after CD40L and IL-4 stimulation were observed, 2) CCR7 mRNA expression was higher after CD40 ligation than before the culture (p = 0.002), 3) IL-10 mRNA expression was higher after the culture with medium than before the culture (p = 0.01). CONCLUSIONS: The results show that leukaemia-derived dendritic cells obtained with CD40 ligation express CCR7 - chemokine is involved in migration to lymph nodes and does not produce higher amounts of IL-10, a potent immunosuppressive cytokine. Our preclinical findings could be used in the design of immunotherapy trials for the treatment of children with ALL.     

急性髓细胞白血病细胞来源的树突状细胞的诱导及功能研究

为了研究急性髓细胞白血病(AML)细胞诱导成树突状细胞(DC)的方法及其DC的功能，分离25例AML患者骨髓或外周血单个核细胞，在含有细胞因子rhGM—CSF，rhIL-4，rhTNF—α的IMDM完全培养基中培养8—12天，进行细胞形态学、表型、遗传学及功能测定。结果表明：20／25例自诱导培养的第3天起，在倒置显微镜下可观察到部分细胞体积增大，形态由圆形变得不规则，可见驼峰样或细刺状胞浆突起；在第8—9天，该类细胞所占的比例达到峰值。至第12天，细胞总数及上述形态的细胞数量明显减少。诱导培养结束时收集细胞，应用流式细胞术检测11／20例诱导前后细胞表面标志的表达，结果表明诱导前细胞不表达CD1a、CD80及CD83，低表达CD86、CD54和HLA—DR；诱导后细胞CD1a、CD80、CD83、CD86、CD54及HLA—DR的表达明显上调。在同种异体混合淋巴细胞反应(Allo-MLR)中，该类细胞刺激同种异体淋巴细胞增殖一对^3H-TdR的摄取能力明显高于AML细胞。FISH证实诱导生成的具有DC特征细胞的AML起源。结论：体外联合应用细胞因子可将AML细胞诱导成具有DC形态、表型及功能特征的细胞(AML—DC)。     

四色流式细胞术检测B细胞急性淋巴细胞白血病微量残留病的临床意义

目的探讨利用四色流式细胞术（FCM）检测B细胞急性淋巴细胞白血病（B-ALL）微量残留病（MRD）的临床意义.方法采用以抗CD34/CD10/CD45/CD19为主的两种四色荧光标记抗体组合,对98例B-ALL患者的671份骨髓标本和1份脑脊液标本进行FCM多参数MRD检测,98例随访患者中26例无发病初期的免疫分型资料.结果FCM检测显示白血病细胞＜0.0001（MRD阴性）的标本为579份;白血病细胞＞0.0001的样本数为93份,其中64份骨髓标本白血病细胞比例＜0.05,29份标本白血病细胞比例＞0.05,我们将其归为复发病例（包括治疗后未达CR的病例）.共20例患者复发,其中19例血液学复发,1例中枢神经系统复发.15例血液学复发者在复发前7～17周发现MRD阳性,包括发病时免疫分型资料不明者6例,MRD水平均＞0.0001;2例分别在复发前3个月和9个月检测MRD为阴性,此后中断检测.在诱导治疗结束和治疗3个月时,如果MRD水平＞0.0001,复发率为50%（12例中有6例复发）,而MRD阴性组复发率为7.5%（40例中有3例复发）（P=0.000）.结论利用FCM进行MRD跟踪监测可预测复发,治疗初期患者MRD＞0.0001,复发的危险性较高.而在掌握了正常B祖细胞抗原表达规律的基础上,可不完全依赖于发病时的免疫表型资料.     

Bone marrow CD34 positive cells may be suitable for collection after death

Hematopoietic stem cells (HSCs) which are characterized with CD34+ phenotype, have a pivotal role in blood cell regeneration. They are located in lowest hypoxic areas in the bone marrow niches. This microenvironment protects them from DNA damage and excessive proliferation, whereas the oxygenated area driving cells out of quiescent state into proliferation. Given the resistance of HSCs to hypoxia, it is reasonable to imagine that they can survive for some time in the absence of oxygen. Here, we evaluated CD34, Bax, Bcl-2, Bcl-xl, and p53 genes expression after death. Moreover, we established the ex-vivo development of HSCs using SCF, FLT3, IL-2, and IL-15 cytokines in culture system. Our finding indicated that although the most of the dead person's mononuclear cells were alive and adequately expressed the CD34 on their surfaces at the first day of isolation, the viability and CD34+/Ki-67 expression declined significantly after culture process. Taken together, our finding indicated that the viability and CD34+ expression was acceptable on day 0 and could be used as a novel method for therapeutic purposes.     

Immunophenotyping analysis of acute undifferentiated leukemia]

The diagnosis of acute undifferentiated leukemia (AUL) is made when the leukemic cells do not have cytologic or cytochemical features of myeloid cells, and do not express myeloid antigens (CD13, CD14, CD33, CD41 etc.) or lymphoid antigens (CD2, CD3, CD19, CD20, Sm Ig etc.). Most of these cells are reported to be positive for CD7, CD34, TdT and HLA-DR, either alone or in combination. Cell lineage can be suspected in most AUL cells by genotypic analysis, phenotypic analysis after culturing with TPA, or peroxidase activity by ultrastructural or immunohistochemical analysis, which indicates the heterogeneity of AUL. The patients with AUL appear to have a poor prognosis with conventional chemotherapy.