雷竹SOC1蛋白原核表达及纯化

为了获得有活性的雷竹PvSOC1蛋白(Phyllostachys violascens SUPPERSSOR OF CO OVEREXPRESSION 1),并进一步讨论其结构形态,通过原核表达方法得到PvSOC1的可溶性重组蛋白,以pET-GST作为表达载体,大肠杆菌E.coli Rosetta作为宿主菌株,超表达全长和IKC结构域的雷竹PvSOC1蛋白。发现在37℃条件下,菌液浓度D(600)值达到0.4～0.6时进行诱导,控制IPTG终浓度为0.4 mmol/L,诱导目的蛋白表达5 h,可以获得可溶的IKC结构域GST融合蛋白。采用TEV(tobacco etch virus protease)酶切技术、配合GST亲和层析柱及分子层析色谱柱,去除标签蛋白并纯化目的蛋白。所获得的高纯度IKC结构域PvSOC1蛋白经过对比分析发现其以八聚体形式存在。     

花生AhNCED1重组蛋白原核表达分析

9-顺式环氧类胡萝卜素双加氧酶（NCED）是调控ABA生物合成的关键限速酶.根据花生叶片中克隆得到基因AhNCED1,构建融合蛋白重组表达载体,将重组质粒转化到大肠杆菌DH5a中诱导表达,SDS-PAGE分析显示在0.2mmol/L IPTG、4h、28℃的条件,目的蛋白以可溶形式高效表达,相对分子质量在66kD左右. AhNCED1重组蛋白可与制备抗体特异性结合,呈现典型的不规则卷曲结构.     

金黄色葡萄球菌isdB基因克隆、表达及其抗原性鉴定

为了构建含牛源金黄色葡萄球菌isdB基因的原核表达载体,并确定其在大肠杆菌表达系统中的表达效果,应用PCR方法扩增出osdB基因片段与原核表达载体pQE-30,构建了重组原核表达载体pQE-30-isdB,将该重组载体转化至E.coli XL1-Blue中诱导表达蛋白.经SDS-PAGE和Westem blot鉴定,P...     

人Delta-like4ext-26-217蛋白原核表达载体的构建及表达

构建人Delta-like4ext-26-217原核表达载体并表达。采用PCR方法扩增hDll4ext-26-217多核苷酸序列,克隆入pMD18T载体。测序正确后,将其亚克隆入pET32a( )原核表达载体,获得pET32a( )-hDll4ext-26-217载体。以该载体转化E.coli菌株BL21,IPTG诱导其表达。采用SDS-PAGE、Western Blot方法鉴定目的蛋白的表达。结果表明,采用SDS-PAGE,Western Blot等方法均可检测到目的蛋白TRX/hDll4ext -26-217,分子量约42.2 KD,主要以包涵体形式大量存在。以上结果为Detla-like4功能的进一步研究奠定了基础。     

BcMid1蛋白原核表达及其与绿原酸的作用

Mid1蛋白是真菌钙通道蛋白,在维持细胞钙稳态方面发挥着重要作用。文章为探讨绿原酸对灰霉(Botrytis cinerea)生长的抑制与钙之间的关系,利用平板实验观察绿原酸存在条件下外源钙离子对灰霉生长的影响,并构建BcMid1原核表达载体,在大肠杆菌Rosetta菌株中诱导BcMid1蛋白表达,利用绿原酸的荧光特性探究BcMid1蛋白与绿原酸的体外结合情况。结果显示,钙离子可以降低绿原酸对灰霉的生长抑制。成功构建的pET-28a∶∶BcMid1重组载体可以在Rosetta菌株中表达BcMid1蛋白,SDS-PAGE和荧光定量检测发现绿原酸和BcMid1蛋白可以结合,结合常数为3.93×10⁴ mol/L。结果表明,绿原酸对灰霉的抑制与钙摄入相关,并且BcMid1蛋白是绿原酸的潜在作用靶点。该文为进一步研究绿原酸对灰霉的抑制机理奠定了基础。     

花生AhNCED1重组蛋白原核表达与二级结构初步分析

9-顺式环氧类胡萝卜素双加氧酶(NCED)是调控ABA生物合成的关键限速酶.根据花生叶片中克隆得到基因AhNCED1,构建融合蛋白重组表达载体,将重组质粒转化到大肠杆菌DH5a中诱导表达,SDS-PAGE分析显示在0.2 mmol/L IPTG、4 h、28 ℃的条件,目的蛋白以可溶形式高效表达,分子质量在66.0 ku左右.AhNCED1重组蛋白可与制备抗体特异性结合,呈现典型的不规则卷曲结构.     

人白细胞介素7重组蛋白原核表达载体在大肠杆菌中的表达和鉴定

目的:构建重组人白细胞介素7(rhIL-7)的原核表达载体,在大肠杆菌中表达并鉴定.方法:以RT-PCR方法扩增编码IL-7的cDNA片段,插入至pET-3d载体中,构建rhIL-7的原核表达载体,阳性克隆经测序鉴定,转化至大肠杆菌BL21(DE3),优化rhIL-7表达条件,利用免疫印迹鉴定重组蛋白.结果:重组载体经DNA测序显示包含正确的rhIL-7编码序列,重组载体转入大肠杆菌后,经IPTG诱导后外源蛋白表达,相对分子质量为17 400,与IL-7理论分子质量一致;免疫印迹显示,外源蛋白可以被人IL-7特异性抗体识别,表明在原核表达的外源蛋白是rhIL-7.rhIL-7主要表达于包涵体中,包涵体表达优化条件为:温度为37 ℃、IPTG浓度为0.4 mmol/L、诱导时间为4 h.结论:成功的构建了rhIL-7的原核表达载体.     

狂犬病毒核蛋白在昆虫细胞中的表达及免疫原性的研究

目的在昆虫细胞中表达出狂犬病毒核蛋白(NP),并探讨重组NP的免疫原性.方法采用杆状病毒表达系统在Sf9昆虫细胞中表达狂犬病毒核蛋白,用直接免疫荧光(DFA)、SDS-PAGE和Western blot对表达产物进行检测和分析,以感染重组杆状病毒的昆虫细胞裂解液免疫小鼠,检测表达产物的免疫原性.结果重组杆状病毒在昆虫细胞中获得表达,免疫小鼠可产生抗核蛋白抗体.结论在Sf9昆虫细胞中表达出狂犬病毒核蛋白,重组产物具有生物活性.     

GST-MIG，GST-IP-10融合蛋白原核载体的构建与表达

目的探讨GST-MIG,GST-IP-10融合蛋白原核载体的构建与表达.方法高压水动力尾静脉注射pCMV-tag2B空载质粒的12只小鼠为对照组,注射pCMV-tag2B-HBx质粒的12只小鼠为观察组.采用Elisa法检测IFN-γ表达;采用免疫组化法检测小鼠肝脏中MIG,IP-10表达;扩增MIG,IP-10基因至pET42a,构建载体后行IPTG诱导表达;采用PAGE和Western blot法鉴定蛋白表达;采用GST柱纯化表达蛋白。结果对照组小鼠肝脏中无MIG,IP-10表达,观察组小鼠肝脏中有MIG,IP-10表达;观察组小鼠肝脏中IFN-γ表达升高21.4%,对照组降低了54.1%,与小鼠肝脏中MIG,IP-10表达一致;MIG基因条带为330 bp,IP-10基因条带为246 bp,经重组质粒测序模版检测,并与Blast进行对比,测序结果与目的基因一致;未诱导组无蛋白表达,pET42a空载IPTG诱导仅有GST表达(26 kD),pET42a-mMIG,pET42a-mIP-10重组质粒IPTG诱导有mMIG,mIP-10表达;25℃下,IPTG质量浓度为0.2 mmol/L,转速为150 r/min,GST-MIG,GST-IP-10融合蛋白含量最高;上清经15%SDS-PAGE检测可提高目的蛋白纯度;采用Western blot检测融合蛋白,经GST柱纯化后可见融合蛋白条带.结论 GST-MIG,GST-IP-10融合蛋白原核载体可成功构建,具有高效表达特征,为制备抗体提供了良好条件.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒SCM株ORF5基因抗原表位克隆表达及其免疫性研究

为鉴定猪繁殖与呼吸综合征病毒SCM株(PRRSV-SCM)囊膜糖蛋白GP5的免疫原性,利用RT-PCR方法从PRRSVSCM株ORF5中扩增大小为231bp的目的基因并构建表达载体PET32-GP5,将其转入大肠埃希菌Rosetta,运用IPTG通过条件优化诱导其表达.检测结果表明:最佳诱导条件为IPTG浓度1mmol/L在37℃下作用5h,表达大小约28kU的融合蛋白.通过Western-blot和间接酶联免疫吸附试验检测表达蛋白,结果显示该原核表达的融合蛋白可与PRRSV阳性血清发生反应,证明该蛋白具有免疫反应性.这为将来研制检测试剂盒以及后续研究PRRSV亚单位疫苗提供了重要依据.     

SHV-12型超广谱β-内酰胺酶的原核表达及免疫原性分析

利用PCR技术扩增了SHV-12 ESBLs目的基因,并将目的基因亚克隆到表达载体pET-28a(+)中,获得重组质粒pET-28a-SHV-12转化于表达菌株BL21(DE3)中诱导表达,表达蛋白纯化后经SDS-PAGE电泳分析.结果表明,目的蛋白SHV-12 ESBLs相对分子质量为30 KDa,经蛋白质印迹检测证...     

土元溶栓蛋白的原核表达和活性检测

本文利用兼并引物成功克隆到土元类胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因,通过构建该基因的原核重组表达载体及IPTG体外诱导,包涵体蛋白复性,Ni 2+柱亲和层析纯化,最终获得了重组表达目的蛋白.经体外检测,该蛋白具有较好的溶栓活性,这为揭示土元溶栓作用的分子基础及其进一步的开发利用奠定了基础.     

西瓜花叶病毒外壳蛋白基因的克隆与原核表达

利用RT-PCR方法获得了西瓜花叶病毒(WMV)陕西分离物外壳蛋白(CP)基因,大小为843 bp.将CP基因克隆到pMD18-T Simple Vector,测序分析发现与各个国家CP核苷酸和氨基酸同源性分别为93.0%~95.0%和96.5%~98.6%.将CP基因定向插入EcoR I/SalI切开的pET30a中,构建了原核表达载体pET30-WCP,转化大肠杆菌BL21.经IPTG诱导2~8 h后,成功表达了分子量约为37 kD的CP蛋白.通过不同时间诱导发现,加入IPTG 4 h后蛋白开始表达,8 h后表达量比较大.以诱导的蛋白为抗原免疫家兔,制备了WMV CP抗血清,ELISA法测其效价为1/6 400,Western blot分析能与CP发生血清学反应.     

人脑蛋白酪氨酸磷酸酶SHP-1基因克隆与原核表达

从人脑组织中提取mRNA,通过RT-PCR扩增出目标cDNA,构建蛋白酪氨酸磷酸酶SHP-1-pEASY-E1重组质粒.将重组质粒转化进E.coli TOP10感受态细胞中,筛选阳性克隆进行验证,将测序正确的质粒转化到E.coli Transetta感受态细胞中表达SHP-1.进一步对SHP-1表达的诱导温度和IPTG浓度等条件进行优化.结果显示,所克隆的SHP-1基因片断经PCR鉴定和测序分析,与目标基因完全相符.通过蛋白表达条件的优化,发现20℃,0.4mmol/L IPTG对表达菌株进行诱导时,SHP-1可溶性蛋白表达量最大.     

金黄色葡萄球菌功能蛋白的酵母表面展示

利用酿酒酵母表面展示系统,成功地将金黄色葡萄球菌功能蛋白ZZ锚定在酵母表面,并进一步用展示有蛋白ZZ的酵母细胞纯化出兔IgG.以pEZZ18为模板,通过PCR技术克隆了ZZ基因,将ZZ基因通过双酶切连接到穿梭载体pICAS,构建了酵母表面展示载体pICZZ,并将其转化至酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)MT8-1中.核酸电泳结果表明ZZ基因成功整合到了酵母基因组中.重组菌经培养,利用免疫荧光染色方法进行染色,显微镜观察表明ZZ蛋白已经展示在酵母细胞表面,流式细胞仪分析结果证实80.4%的酵母细胞表达了ZZ蛋白.利用展示有蛋白ZZ的酵母细胞吸附兔血清中的IgG,洗脱后进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺电脉,并进行W estern blot免疫印迹,结果表明,此重组酵母细胞纯化的兔IgG比标样兔IgG纯度更高.     

水稻OsAAA1蛋白的原核表达载体构建及其可溶性表达研究

为使用外源表达载体表达并纯化有活性的水稻ATP酶蛋白Os AAA1,构建了p ET-32a-Os AAA1原核表达载体并进行体外IPTG诱导表达和Ni+柱亲和层析纯化.利用SDS-PAGE和Western Blot检测了目的蛋白.结果表明:将成功构建的p ET-32a-Os AAA1原核表达载体,转化到大肠杆菌Origami菌株后,在70~100 KD之间检测到可溶性目的蛋白带,并优化了诱导表达的较适温度、IPTG诱导浓度和诱导表达时间.故成功构建了p ET-32a-Os AAA1原核表达载体并获得了可溶性Os AAA1目的蛋白,为其后续研究奠定了基础.     

VPAHPND毒力蛋白PirAB的原核表达与纯化

急性肝胰腺坏死病(Acute Hepatopancreatic Necrosis Disease,AHPND)是一种新型对虾病害,其病原为一类携带编码二元毒素蛋白PirAB的弧菌(VP_AHPND),可感染对虾且致死率高。本研究利用GenBank公布的pirAB全基因序列设计特异性引物,通过PCR获得目的基因pirA、pirB、pirAB并克隆至表达载体pET 21b(+)中,构建BL21-pET21b-pirA、BL21-pET21b-pirB、BL21-pET21b-pirAB原核表达体系;通过对诱导剂浓度、诱导温度和诱导时间进行优化,分析重组蛋白的最佳表达条件;采用Ni磁珠对重组蛋白进行纯化,并以Western-blot方法分析其抗原性。结果表明,PirA、PirB、PirAB的重组蛋白分子质量分别约为17 kDa、50 kDa和(50+17) kDa,与预期大小一致。重组蛋白的最佳诱导条件：IPTG浓度0.01 mmol/L,PirA和PirAB 30℃诱导24 h、PirB 30℃诱导4 h,蛋白均呈现可溶性表达;纯化后的重组蛋白具有较好的反应原性,可为下一步的抗体制备和AHPND致病机理研究提供充足的实验材料。     

羊布鲁菌外膜蛋白Omp22的原核表达及鉴定

布鲁菌外膜蛋白Omp22与布鲁菌致病性相关,又可诱导机体免疫反应。为进一步研究Omp22的特性,对其进行原核表达,并初步鉴定。根据Genbank序列,设计并合成羊布鲁菌外膜蛋白Omp22引物。以羊布鲁菌M5株基因组DAN为模板,PCR扩增并克隆入原核表达载体pGEX-4T-1中。酶切鉴定正确后,测定序列;将重组质粒pGEX-4T-1-Omp22电转化大肠杆菌DH5α中,诱导表达,并采用羊布鲁菌兔免疫血清,Western-blot初步检测融合蛋白GST-Omp22表达情况和免疫学特性。结果PCR扩增出约660bp目的条带,与预期相符;酶切鉴定和测序结果表明,成功构建了pGEX-4T-1-Omp22原核表达载体;优化诱导温度,结果表明,在25℃诱导表达时,该融合蛋白大部分出现在上清中;Western-blot结果证实,GST-Omp22可与羊布鲁菌兔免疫血清特异性结合。说明成功构建了Omp22蛋白原核表达载体并进行了可溶性表达;该融合蛋白可与羊布鲁菌兔免疫血清特异性结合。Omp22蛋白的表达,为进一步研究布鲁菌的致病机制以及疫苗研制奠定基础。     

pEGX-4T-2/NAP1融合蛋白的原核表达及鉴定

以鼻咽组织cDNA为模板,PCR扩增NAP1基因编码区,PCR产物克隆入pUCm-T载体,筛选阳性克隆. 构建NAP1基因编码区的原核表达载体pEGX-4T-2/ NAP1,转化大肠杆菌BL21. 经IPTG诱导表达后,在不同时段收集菌体,提取细菌的全部蛋白. 经12%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测,发现细菌全蛋白中在35 KD～36 KD处多出一条明显条带. 用兔抗人NAP1多克隆抗体,利用Western Blotting对该融合蛋白的表达进行了鉴定,NAP1基因的融合蛋白表达成功,为制备NAP1单克隆抗体和获得有生物活性的NAP1蛋白,进一步研究NAP1蛋白的功能奠定了基础.