绿色荧光蛋白转基因胚胎大鼠神经干细胞生物学特性研究

目的:体外分离、培养、鉴定绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)转基因胚胎大鼠神经干细胞,研究其体外活性与生物学性状,为在体分化示踪研究奠定基础。方法:采用机械分离,无血清传代培养法从GFP胚胎大鼠海马获得神经干细胞,免疫荧光和免疫细胞化学法染色进行体外神经干细胞性质和分化活性鉴定,并利用流式细胞计数法行纯度检测。结果:成功从GFP胎鼠海马获得神经干细胞,体外生长情况与活性良好,能分化成神经元和胶质细胞;体外连续传代3次后绝大部分细胞Nestin表达阳性,且分化后细胞的GFP表达不受影响。结论:GFP胚胎大鼠来源神经干细胞具有普通胎鼠神经干细胞相同的自我更新和多向分化潜能,且能稳定表达GFP,因此它可以成为示踪神经干细胞研究的有效工具细胞。     

GFP转基因胚胎大鼠神经干细胞生物学特性研究

目的 体外分离、培养、鉴定绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）转基因胚胎大鼠神经干细胞，研究其体外活性与生物学性状，为在体分化示踪研究奠定基础。方法 采用机械分离，无血清传代培养法从GFP胚胎大鼠海马获得神经干细胞，免疫荧光和免疫细胞化学法染色进行体外神经干细胞性质和分化活性鉴定，并利用流式细胞计数法行纯度检测。结果 成功从GFP胎鼠海马获得神经干细胞，体外生长情况与活性良好，能分化成神经元和胶质细胞；体外连续传代3次后绝大部分细胞Nestin表达阳性，且分化后细胞的GFP表达不受影响。结论 GFP胚胎大鼠来源神经干细胞具有普通胎鼠NSCs相同的自我更新和多向分化潜能，且能稳定表达GFP，因此它可以成为示踪神经干细胞研究的有效工具细胞。     

小鼠胚胎神经干细胞的体外生长特性和相关基因的表达

目的:观察小鼠胚胎神经干细胞的体外生长特性并检测其相关基因的表达。方法:实验于2005-02/06在暨南大学医学院中心实验室进行。①取妊娠13.5d昆明小鼠分离胚胎大脑中的神经干细胞,用添加碱性成纤维细胞生长因子的无血清培养基进行体外培养,取培养3d的神经球接种于多聚赖氨酸包被的培养瓶,用含血清的培养基诱导分化。②免疫细胞化学检测细胞表面抗原。③四甲基偶氮唑盐法绘制生长曲线。④流式细胞术检测细胞周期。⑤反转录-聚合酶链反应和免疫细胞化学技术对神经干细胞进行鉴定。结果:①胚胎神经干细胞及其分化细胞的抗原表达:血清诱导8h,分化细胞中(8.9±5.6)%细胞呈Tubulin阳性,(87.5±7.4)%细胞胞浆呈胶质纤维酸性蛋白阳性表达。未诱导细胞近100%呈巢蛋白阳性,仅有极少数细胞Tubulin阳性或胶质纤维酸性蛋白阳性。②胚胎神经干细胞的细胞周期:从小鼠胚胎大脑获取的神经干细胞3d左右进入指数生长期;原代培养细胞83.8%处于静止期/DNA合成前期。③原代与传代细胞均表达巢蛋白mRNA,聚集形成的神经球巢蛋白阳性。血清诱导4h胚胎神经干细胞开始转录神经元相关基因Tau和胶质细胞相关基因胶质纤维酸性蛋白。结论:从小鼠胚胎大脑可成功分离获得大量胚胎神经干细胞,并在含碱性成纤维细胞生长因子的条件培养基中迅速增殖,血清诱导下分化生成神经元和星型胶质细胞。     

胚胎大鼠神经干细胞的分离培养及自然分化的初步观察

目的神经干细胞体外培养的成功是进一步研究其分化机制的基础,从胚胎大鼠脑室下区分离、培养、鉴定神经干细胞(neuralstemcells,NSCs),并观察其向神经元的分化情况。方法分离胚胎SD大鼠脑室下区的组织,采用无血清原代及传代培养方法,获得具有克隆能力的细胞群;应用免疫细胞化学方法鉴定神经干细胞并检测分化后特异性成熟神经细胞抗原的表达;应用流式细胞检测技术观测神经干细胞随时间向神经元的分化情况。结果从胚胎大鼠脑室下区分离培养的细胞群具有克隆增殖能力,表达神经上皮干细胞蛋白(nestin),分化后的细胞表达神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的特异性抗原;随着贴壁后分化时间的延长,表达nestin的细胞数量从80.5%下降到10.9%,而神经元特异性烯醇化酶(neuronspecificenolase,NSE)阳性细胞数量则从1.1%上升到31.6%。结论用本方法分离的细胞具有自我更新和增殖能力,并具有多分化潜能,是中枢神经系统的干细胞;随着分化时间的延长,神经干细胞数量下降,而神经元比例有明显上升。     

前软骨干细胞的分离培养及其鉴定

目的：探讨体外分离、培养及鉴定前软骨干细胞(PCSC)，为相关的实验研究奠定基础。方法：采用酶消化法从新生大鼠干骺端中收集细胞，用免疫磁珠法分选出前软骨干细胞，用DMEM-F12培养基进行体外培养，用免疫组化方法鉴定，对分离出的前软骨干细胞进行相关分子生物学研究。结果：从新生大鼠干骺端中成功培养出前软骨干细胞，培养条件下贴壁生长，成团块状，细胞表面有FGFR-3的标记物；细胞生长迅速。结论：在体外培养条件下可以从新生大鼠干骺端中培养出前软骨干细胞作为骨和软骨缺损移植治疗的潜在细胞来源。     

SD大鼠骨髓间充质干细胞分离提纯及鉴定

目的探讨SD大鼠骨髓间充质干细胞的体外分离、传代培养方法,并对培养细胞进行鉴定。方法贴壁培养法分离SD大鼠骨髓细胞,传代扩增,倒置相差显微镜进行形态学观察,流式细胞术鉴定细胞。结果原代细胞较多细胞集落,细胞规则,呈梭形、椭圆形,传代细胞多成纤维形状,第3代培养细胞表面分子CD44,CD90,CD105呈阳性表达,但不表达CD34。结论贴壁培养法培养的大鼠骨髓原代细胞可稳定表达干细胞表面的标记分子。     

大鼠骨髓间充质干细胞体外培养与慢病毒转染方法的建立

本研究建立大鼠骨髓间充质干细胞(BMMSC)体外分离培养、表型鉴定和标记的方法,为临床进行细胞移植治疗提供合格的细胞.无菌条件下取大鼠股骨、胫骨,用冲洗法冲出骨髓,贴壁培养法分离纯化BMMSC,体外扩增;流式细胞术进行免疫表型鉴定,并进行成骨,成脂分化鉴定;利用携带绿色荧光蛋白(GFP)基因的慢病毒液转染大鼠BMMSC...     

胚胎大鼠神经干细胞的分离培养及自然分化的初步观察

目的 神经干细胞体外培养的成功是进一步研究其分化机制的基础，从胚胎大鼠脑室下区分离、培养、鉴定神经干细胞(neural stem cells,NSCs)，并观察其向神经元的分化情况。方法 分离胚胎SD大鼠脑室下区的组织，采用无血清原代及传代培养方法，获得具有克隆能力的细胞群；应用免疫细胞化学方法鉴定神经干细胞并检测分化后特异性成熟神经细胞抗原的表达；应用流式细胞检测技术观测神经干细胞随时间向神经元的分化情况。结果 从胚胎大鼠脑室下区分离培养的细胞群具有克隆增殖能力，表达神经上皮干细胞蛋白(nea6n)，分化后的细胞表达神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的特异性抗原；随着贴壁后分化时间的延长，表达nestin的细胞数量从80．5％下降到10．9％，向神经力特异性烯醇化酶(newonspecific enolase，NSE)阳性细胞数量则从1．1％上升到31．6％。结论 用本方法分离的细胞具有自我更新和增殖能力，并具有多分化潜能，是中枢神经系统的干细胞；随着分化时间的延长，神经干细胞数量下降，而神经元比例有明显上升。     

人脑神经干细胞的分离培养及鉴定的研究

目的探讨分离培养人脑神经干细胞的方法及条件。方法用胰蛋白酶消化法从人胚脑中分离单个细胞,用无血清培养基进行体外培养,bFGF和EGF刺激细胞生长,用血清诱导其分化;采用免疫荧光细胞化学染色方法检测培养的细胞神经巢蛋白(Nestin)抗原和分化后成熟神经细胞抗原神经元特异性烯醇化酶(NSE)的表达。结果从胚龄16周的新鲜人胚脑中成功分离出神经干细胞。该细胞可在体外培养条件下传代培养,并表达神经干细胞标志Nestin;分化后的细胞主要表达成熟神经细胞标志NSE。结论在体外培养条件下可从人胚脑中分离培养出神经干细胞。     

人脑神经干细胞的分离培养及鉴定的研究

目的探讨分离培养人脑神经干细胞的方法及条件.方法用胰蛋白酶消化法从人胚脑中分离单个细胞,用无血清培养基进行体外培养,bFGF和EGF刺激细胞生长,用血清诱导其分化;采用免疫荧光细胞化学染色方法检测培养的细胞神经巢蛋白(Nestin)抗原和分化后成熟神经细胞抗原神经元特异性烯醇化酶(NSE)的表达.结果从胚龄16周的新鲜人胚脑中成功分离出神经干细胞.该细胞可在体外培养条件下传代培养,并表达神经干细胞标志Nestin;分化后的细胞主要表达成熟神经细胞标志NSE.结论在体外培养条件下可从人胚脑中分离培养出神经干细胞.     

人骨髓间充质干细胞和汗腺细胞的体外分离与培养

背景：体外研究人骨髓间充质干细胞和汗腺细胞的分离培养与鉴定,可为探讨骨髓间充质干细胞再生汗腺的可行性打下基础。目的：探寻在体外分离培养骨髓间充质干细胞和汗腺细胞的有效方法。方法：采用直接贴壁法从成人骨髓中体外分离培养骨髓间充质干细胞,并进行扩增和鉴定。采用胶原酶消化法从人全层无烧伤皮肤中分离汗腺细胞,并进行扩增和鉴定。结果与结论：倒置显微镜下见分离培养的骨髓间充质干细胞呈梭形,折光性强,免疫细胞化学染色显示细胞表达CD29、CD105,高表达CD44,不表达造血干细胞表面标志CD34和CD45。汗腺细胞呈扁平多角形,表达汗腺细胞表面标志细胞角蛋白7,8,18,19和癌胚抗原。说明直接贴壁法分离培养骨髓间充质干细胞和胶原酶消化法分离培养汗腺细胞是可行的。     

全骨髓法体外培养分离大鼠骨髓间充质干细胞及PKH26标记

背景：要获得动物实验需要的标记大鼠骨髓间充质干细胞,体外培养、扩增和示踪已成为实验的关键环节。目的：采用全骨髓培养分离大鼠骨髓间充质干细胞,以及PKH26对其体外标记,建立一种方便、实用的分离培养并示踪骨髓间充质干细胞的方法。方法：通过全骨髓培养分离法纯化大鼠骨髓间充质干细胞。经传代扩增,细胞进一步纯化。取第3代大鼠骨髓间充质干细胞按PKH26标记程序进行标记后培养,荧光显微镜下观察标记后细胞生长状态、萤光强度变化和传代培养效果。利用四唑盐比色法测定标记后骨髓间充质干细胞的生长曲线。结果与结论：全骨髓培养分离法能成功获得纯度高的骨髓间充质干细胞,用PKH26标记后的骨髓间充质干细胞呈红色荧光,体外连续传代培养3代后,细胞荧光强度逐渐减弱。PKH26标记骨髓间充质干细胞的生长形态、生长活力不发生改变。结果证实全骨髓培养分离法简便易行,能获取较高纯度的生长增殖状态良好的骨髓间充质干细胞,PKH26荧光标记大鼠骨髓间充质干细胞是一种有效、实用的方法。     

骨髓间充质干细胞在纳米晶胶原基骨内生长以及成骨潜能

背景：纳米晶胶原基骨修复材料是根据仿生原理制备的纳米骨框架材料,其微结构和成分两方面都与天然骨有相似性,具有良好的生物相容性。目的：研究兔骨髓间充质干细胞与纳米晶胶原基骨修复材料体外复合培养的结合程度,以及构建组织工程骨的可行性。方法：分离兔骨髓间充质干细胞,体外培养、纯化,取第3代骨髓间充质干细胞与纳米晶胶原基骨修复材料体外复合培养,第3,7,20天后激光共聚焦和扫描电镜观察二者复合程度。结果与结论：骨髓间充质干细胞和纳米晶胶原基骨修复材料复合良好,共聚焦显微镜和环境扫描电镜观察均可见细胞生长;纳米晶胶原基骨修复材料能够作为良好的支架,它能使骨髓间充质干细胞在其内稳定生长。提示骨髓间充质干细胞在纳米晶胶原基骨修复材料内能很好的生长,并且具有成骨潜能。     

胃癌表达EpCAM和CK19临床意义的研究

目的探讨胃癌中CK19和EpCAM的表达的临床意义。方法利用组织芯片-免疫组化技术,对术后病理诊断明确的胃癌31例,良性病变7例和正常胃粘膜16例的组织标本制成一张组织芯片,用免疫组化SP法检测组织芯片中CK19和EpCAM的表达,从循证诊断角度分析两者在胃癌中的诊断价值。结果 (1)CK19、EpCAM在良性病变和胃癌组织中的表达率显著高于正常组织中,差异性显著(P0.05);(2)CK19、EpCAM在胃癌的循征医学诊断中有一定的价值,其中以EpCAM、及其与CK19并联实验的价值最高。结论 CK19和EpCAM可以帮助胃癌的早期诊断。     

体外诱导胎盘间充质干细胞向表皮细胞的分化

背景:以往研究证明胎盘间充质干细胞经诱导可以向骨、软骨、肌肉、脂肪等间充质细胞分化。目的:探讨体外诱导胎盘间充质干细胞分化为表皮细胞的可行性。方法:分离培养胎盘间充质干细胞,流式细胞仪鉴定其表面抗原,用含体积分数为2%胎牛血清以及20μg/L表皮生长因条件培养基诱导,诱导后细胞通过表皮细胞标志物CK19以及CK10染色鉴定。结果与结论:胎盘间充质干细胞表面抗原CD29、CD44、CD105阳性,CD34、CD45、CD106以及HLA-DR阴性。诱后细胞形态明显改变,表皮细胞标志物CK19以及CK10免疫荧光染色阳性,提示胎盘间充质干细胞在体外具有分化为皮细胞的能力,可以作为皮肤组织工程和干细胞研究的一种有效来源。     

大鼠骨髓间充质干细胞的PKH26标记和示踪

背景：骨髓间充质干细胞标记是体内迁移分化研究的重要环节。目的：对大鼠骨髓间充质干细胞进行PKH26标记,探讨PKH26标记对骨髓间充质干细胞的生长特征、分化的影响及体内示踪情况。方法：培养扩增大鼠骨髓间充质干细胞,第2代细胞按PKH26标记程序进行细胞标记,观察标记组和未标记组细胞的增殖、周期和凋亡情况,对标记组细胞行成骨成脂体外诱导分化。尾静脉移植PKH26标记细胞,6周后荧光显微镜观察骨髓间充质干细胞在子宫内膜的分布情况。结果与结论：PKH26标记对细胞增殖、凋亡和周期无明显影响,不影响成骨成脂诱导分化。子宫内膜组织中PKH26标记阳性的细胞分布于腺上皮和间质细胞。PKH26标记技术可用于示踪骨髓间充质迁移转归和干细胞移植方面的实验研究。     

How druggable is protein kinase CK2?

CK2 is a pleiotropic, ubiquitous, and constitutively active protein kinase (PK), with both cytosolic and nuclear localization in most mammalian cells. The holoenzyme is generally composed of two catalytic (α and/or α′) and two regulatory (β) subunits, but the free α/α′ subunits are catalytically active by themselves and can be present in cells under some circumstances. CK2 catalyzes the phosphorylation of more than 300 substrates characterized by multiple acidic residues surrounding the phosphor‐acceptor amino acid, and, consequently, it plays a key role in several physiological and pathological processes. But how can one kinase orchestrate all these tasks faithfully? How is it possible that one kinase can, despite all pleiotropic characteristics of PKs in general, be involved in so many different biochemical events? Is CK2 a druggable target? Several questions are still to be clearly answered, and this review is an occasion for a fruitful discussion. © 2009 Wiley Periodicals, Inc. Med Res Rev, 30, No. 3, 419–462, 2010     

腹腔镜CO_2气腹对大肠癌血液转移的影响

目的探讨腹腔镜结直肠癌手术时建立CO_2气腹对肿瘤细胞血液转移的影响。方法选取60例经病理学确诊为结直肠癌患者,将患者按照随机数字表法分为腹腔镜组和开腹组。抽取2组患者术前、术中、术后的外周血样,采用巢式RT-PCR法检测血样中细胞角蛋白20(CK20)的表达,分析不同手术方式对患者外周血肿瘤细胞转移的影响。结果 2组患者外周血CK20mRNA术前、术中、术后不同时间组内、组间阳性表达率比较,差异均无统计学意义(P0.05)。2组患者的3年生存率比较无显著差异(P0.05)。结论腹腔镜CO_2气腹行腹腔镜结直肠癌切除手术不增加患者外周血CK20mRNA的阳性表达率。     

大鼠骨髓间充质干细胞向神经元样细胞定向诱导分化及免疫组化鉴定

目的建立体外分离、培养大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)的方法,体外诱导其向神经元样细胞方向分化。方法应用细胞培养技术从大鼠股骨、胫骨中分离、纯化骨髓间充质干细胞并在体外进行培养,以形态学方法鉴定间充质干细胞,在倒置显微镜下观察细胞的形态特征,利用含10 ng/ml bFGF的LG-DMEM及含200μmol/L BHA、2%DMSO的无血清DMEM诱导其向神经元样细胞分化,并通过免疫组化方法鉴定。结果经原代及传代培养的骨髓间充质干细胞呈梭形,类似于成纤维细胞;成神经元诱导24 h后,多数MSCs变为典型的神经元样细胞,胞体向胞核收缩并有较多的长突起,免疫组化显示神经元特异性标志NSE、神经巢蛋白Nestin染色阳性。结论体外成功的进行了MSCs原代及传代培养,细胞生长稳定、增殖迅速并可多次传代,经诱导后具有向神经元样细胞分化潜能。     

婴幼儿轮状病毒性肠炎患儿54例血清心肌酶分析

目的通过检测并分析婴幼儿轮状病毒性肠炎与非轮状病毒感染性肠炎患儿心肌酶的水平,探讨轮状病毒感染与心肌损伤的相关性。方法 54例婴幼儿轮状病毒性肠炎的患儿作为观察组,78例轮状病毒阴性的腹泻病患儿作为对照组。两组患儿入院后抽取取空腹血清检查心肌酶[磷酸肌酸激酶(CK)及其同工酶(CK-MB)、门冬氨酸氨基转移酶(AST)]进行比较分析。两组患儿经治疗,腹泻症状消失后,将心肌酶三项均增高患儿的血清心肌酶进行治疗前后的分析比较。结果观察组中血清心肌酶三项(AST、CK-MB、CK)的水平较对照组高,差异有显著性(P0.05)。且入院时,观察组心肌酶三项均异常者有30例,占55.6%;对照组心肌酶三项均异常者有13例,占16.7%。观察组心肌酶异常者比率显著高于对照组,差异有显著性(P0.05)。治疗前,观察组心肌酶三项均异常者心肌酶水平较对照组增高,差异有显著性(P0.05);治疗后,两组心肌酶三项均异常者心肌酶水平差异无统计学意义(P0.05)。结论婴幼儿轮状病毒性肠炎较非轮状病毒性腹泻更容易导致患儿心肌的损伤,经治疗后,心肌酶可以在短时间内恢复正常。因此,在治疗婴幼儿轮状病毒性肠炎时应进行心肌酶的检测,并注意排除病毒性心肌炎。