睾丸生精细胞完全体外成熟培养的研究

目的在动物实验研究的基础上对人类睾丸生精细胞在体外培养分化、成熟进行初步探索,为临床治疗无精子症奠定基础.方法将14例患者的睾丸组织分离成生精细胞混悬液,采用生精细胞与支持细胞共培养或分选出初级精母细胞和精子细胞培养,观察培养前后各级生精细胞的分化或成熟情况.结果14例患者睾丸生精细胞经体外培养后均有不同程度的分化和成熟.初级精母细胞能分化为精子细胞,分化率平均为4.54%～6.51%;Sa期精子细胞能变形、成熟为Sc期精子细胞,成熟率为3.13%～5.74%.结论人类生精细胞经体外培养能进一步分化、成熟.初级精母细胞能分化为早期精子细胞,Sa期精子细胞可变形为更成熟形式的Sc期精子细胞.甚至可以通过使用被拉长的精细胞或圆形细胞进行显微受精,以达到妊娠的目的.     

哺乳动物睾丸生精细胞的体外培养

哺乳动物精子发生是一个十分复杂的过程,影响因素众多,体外培养生精细胞一般有组织培养和细胞培养两类方法,目前,已有生精细胞成功地在体外从细线期精母细胞经2次减数分裂分化为精子细胞的报道,但 精原细胞的分化和精子细胞的成熟仍是两个难点,建立生精细胞体外培养模型有助于研究精子发生的调控机制,可用于辅助生育技术,治疗精子发生阻滞的患者,对精子发生机制的进一步阐明,也会促进生精细胞体外培养研究的发展。     

小鼠生精细胞体外长期培养及超微结构分析

目的初步探讨新生小鼠睾丸组织中生精细胞在体外培养条件下的增殖分化条件,建立有效的生精细胞体外成熟模型。方法用酶法和Percoll不连续密度梯度法分离纯化新生小鼠睾丸生精细胞,获取富精原细胞层,采用自制小鼠睾丸组织培养液对分离纯化后的细胞进行体外培养。用电子显微镜观察培养的细胞超微结构。结果新生小鼠生精细胞在用成年小鼠睾丸组织提取液配制的培养基中存活达194d。电子显微镜观察可见,培养后的细胞中含有精子细胞顶体样结构。结论采用小鼠睾丸组织制备的培养液培养的小鼠生精细胞可体外长期培养并显示出一定的分化趋势。     

BrdU标记在大鼠生精细胞体外培养中的应用

目的探讨应用5-溴-2-脱氧尿苷（5-bromo-2-deoxy-uridine，Brdu）标记检测大鼠生精细胞体外的分化、发育情况。方法采用BtdU体内标记生精细胞的DNA，免疫细胞化学法跟踪观察大鼠生精细胞在体外培养中的分化、发育情况。结果培养前在体内标记BrdU的细胞为初级精母细胞。经培养后在BrdU标记的细胞中出现早期精子细胞。结论大鼠生精细胞体外培养过程中，应用BrdU标记能检测生精细胞的分化、发育情况。     

生精细胞体外培养鉴定方法的研究进展

哺乳动物和人类的生精细胞体外培养经过近100年的发展,已建立了较好的体外培养系统,人们已能将生精细胞从精原细胞阶段培养到精子细胞阶段,甚至已培养到成熟精子。而生精细胞培养后的鉴定方法还缺乏客观手段,本文主要介绍了生精细胞培养的各种鉴定方法的研究进展现状。     

大鼠生精细胞体外培养条件的研究

目的:寻找一个最适合生精细胞体外培养的培养体系,为进一步培养人类生精细胞提供技术基础.方法:用单一酶-研磨-Percoll法制备15 d龄雄性大鼠生精细胞混悬液用于体外培养.①设计两种不同的培养条件:DMEM/F12和改良人类输卵管液(HTF)作为基础培养液,分为两组.每组根据添加不同浓度的激素分为6小组.添加的睾酮(T)和FSH浓度分别为:对照组H0(T 1 μmol/L,FSH 0 IU/L)、H1组(T 1 μmol/L,FSH 10 IU/L)、 H2组(T 1 μmol/L,FSH 25 IU/L)、H3组(T 1 μmol/L,FSH 50 IU/L)、H4组(T 1 μmol/L,FSH 100 IU/L)、H5组(T 0 μmol/L,FSH 50 IU/L). ②通过BRDU标记和流式细胞仪检测所有实验的生精细胞倍体的变化来判断其发育,进一步确认本研究使用培养条件的可靠性.结果:在生精细胞与支持细胞共培养过程中以改良人类输卵管液作为基础培养液,添加T 1 μmol/L ,FSH 50 IU/L或100 IU/L都适宜生精细胞体外培养;另通过BRDU标记及流式细胞仪检测均表明,在本研究条件下体外培养生精细胞能从初级精母细胞阶段分化到精子细胞阶段.结论:改良人类输卵管液作为基础培养液,添加浓度为50 IU/L或100 IU/L的FSH及T 1 μmol/L,最适合生精细胞的体外成熟培养.     

小鼠生精细胞的体外双室无血清培养

目的 探讨无血清条件下应用插入式细胞培养皿( Transwell 小室)对小鼠睾丸间质细胞 - 支持细 胞 - 生精细胞的双室培养技术。方法 取 60 日龄 C57BL / 6 雄性小鼠睾丸间质细胞和 15 日龄雄性小鼠睾丸支持细 胞与生精细胞混合细胞团双室共培养,不添加血清。每日在倒置显微镜下观察生精细胞的形态和生长情况,苏木 精染色观察生精细胞形态,染色体倍性分析检测细胞分化情况。结果 在培养 1 周后,可见圆形精子细胞出现, 2 周 后可见长形精子细胞, 3 周后可见较短鞭毛,生精细胞可存活 8 周;培养 1 周时,流式细胞术可检测出单倍体细胞, 单倍体细胞百分比随培养时间延长而增加。结论 应用双室无血清培养体系体外培养小鼠生精细胞可获得精子且 生精细胞存活时间较长。     

新疆210例无精子症患者睾丸针吸细胞学检查及病因分析

目的：了解当地无精症的种类、病因,预后和防治措施。方法：通过210例无精症患者的针吸细胞学检查,明确病因诊断,并进行归类。结果：210例睾丸针吸细胞学检查中：具有支持细胞及少量间质细胞而无生精细胞者50例,占23．81％;具有支持细胞及较多间质细胞而无生精细胞者12例,占5．71％;具有少量精原细胞,较多各级生精细胞及成熟精于者111例,占52．86％;具有各级生精细胞而无成熟精于者37例,占17．62％。结论：睾丸针吸细胞学检查在男子无精子症中有较高的实用价值,该组患者检查结果提示当地无精症患者中梗阻型可能为主要类型。     

补肾活血方对精索静脉曲张大鼠生精细胞凋亡的影响

目的探讨补肾活血方对精索静脉曲张模型大鼠生精细胞凋亡及各级生精细胞数的影响。方法将50只3月龄雄性SD大鼠先随机抽出10只为假手术组，其余40只大鼠采用肾静脉缩窄法建立精索静脉曲张病理模型，造模完成后再随机均分为模型组，补肾活血方低剂量组、中剂量组、高剂量组。造模后48d开始给药，连续给药60d，用流式细胞仪检测各纽大鼠睾丸生精细胞凋亡数、凋亡率及各级生精细胞数。结果假手术组未出现明显的凋亡峰，模型组与各治疗组均出现明显的凋亡峰，且模型组大鼠睾丸生精细胞凋亡率显著高于各治疗组（P〈0．01）。各级生精细胞数比较，1C细胞（精子细胞与精予）数模型组与各治疗组比较有显著性差异（P〈0．05）；2C细胞（次级精母细胞）数各组间比较无显著性差异；4C细胞数（初级精母细胞）模型组与治疗组比较有非常显著性差异（P〈0．01）。结论生精细胞大量凋亡是精索静脉曲张导致不育的重要病理机制，补肾活血方能降低生精细胞凋亡率，提高模型动物各级生精细胞数量。     

谷氨酸单钠对大鼠睾丸的影响

给新生期Ｗｉｓｔａｒ大鼠皮下注射１０％谷氨酸单钠（ＭＳＧ），观察其青春期（５２日龄）及成年期（１００日龄）的睾丸。结果：各期给药组睾丸质量均显著低于对照组（Ｐ＜０．０１），血清睾酮（Ｔ）浓度给药组各期均显著低于对照组（Ｐ＜０．０１）。各期给药组睾丸发育停滞，生精细胞停留于精原细胞、精母细胞阶段、曲细精管内未见精子细胞，无精子形成。结果表明：新生期注射ＭＳＧ的大鼠睾丸的生精过程受到阻滞。     

Differentiation of rat oligodendrocyte precursor cells in chemical conditional medium in vitro

Objective： To investigate in vitro differentiation of oligodendrocyte precursor cells （OPCs） into mature oligodendrocytes in chemical conditional medium. Methods： The mixed glial cells from cerebral cortices of 48-hour-old Sprague-Dawley （SD） rats were cultured in vitro. The OPCs were separated by shaking procedure around 9-10 d in the primary culture. Then the isolated OPCs were further transferred into the chemical conditional medium for cell differentiation. The pattern of OPCs maturation in vitro was continuously observed with contrast phase microscopy and mature oligodendrocytes were further identified by immunocytochemical assays. Results： OPCs grew well when co-cultured with glial cells and distinct cellular stratification formed about 9-10 d in the primary culture, which indicated the appropriate opportunity for the separation of OPCs. Following cultured in the chemical conditional medium, the OPCs progressively differentiated into the mature oligodendrocytes. These mature oligodendrocytes were also immunostained with the oligodendrocyte lineage-specific antibody, Oligo2. Conclusion： The OPCs isolated from the cerebral cortices of neonatal SD rats can progressively differentiate into mature oligodendrocytes in the chemical conditional medium in vitro.     

人外周血树突状细胞体外诱导培养及表型鉴定

目的从健康人外周血中分离单个核细胞（peripheral blood mononuclearcell,PBMC）,经体外诱导培养获取成熟树突状细胞（dendritic cell,DC）.方法取健康人新鲜外周血,经密度梯度离心法分离,获得单个核细胞,在含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中培养.置37℃、5%CO2培养箱内静置培养2 h后除去悬浮细胞.培养液中加入rhGM-CSF和rhIL-4继续培养贴壁细胞5 d,然后加入TNF-α促进其分化成熟.倒置显微镜下观察DC形态,流式细胞仪（flowcytometer,FCM）对其进行表型鉴定.结果显微镜下观察DC细胞形态不规则,表面有大量的毛刺状突起;成熟DC细胞表面CD83、CD80分子表达明显增高.结论用rhGM-CSF、rhIL-4和TNF-α联合培养可以从健康人外周血诱导培养出成熟的树突状细胞.     

Expression of cell surface antigens during the differentiation of osteoblast by human bone marrow-derived mesenchymal stem cells

OBJECTIVE: To explore the phenotypic changes of some cell surface antigens in the process that the bone marrow-derived mesenchymal stem cells (MSCs) differentiate into osteoblast lineage under certain conditions. METHODS: The mononuclear cells were isolated from human bone marrow and cultured in the medium in the presence (experimental group) or absence (control group 1) of dexamethasone, ascorbic acid and beta-glycerophosphate, or in the alpha-MEM only (control group 2). The expressions of CD45, CD34, CD117, CD90, and HLA-DR were examined by flow cytometry on culture day 7, 12, and 17. RESULTS: Human bone marrow MSCs can differentiate into mature cells with the characteristics of osteoblasts in vitro. The expression of CD45 was low in the experimental group and in the control groups on culture day 7, and became negative from day 12 in all groups. The expressions of CD34 and CD117 were negative at all time points. The expression of CD90 increased on day 12 in all groups, and was more obvious in the control groups. The expression of HLA-DR was gradually elevated along with the differentiation and maturation of osteoblasts in the experimental group, but dropped in the control groups in the later time points. CONCLUSIONS: MSCs can differentiate into mature osteoblasts after induction. The expression of cell surface antigens during differentiation has characteristic changes, which may be key markers in the early stage of osteoblasts differentiation.     

胶质瘤干细胞的培养和分化研究

目的探讨人类胶质瘤干细胞的体外培养、传代和分化。方法采用机械方法从胶质瘤组织中分离细胞,应用N2培养基进行培养,碱性成纤维细胞生长因子和表皮生长因子刺激细胞扩增;应用免疫组织化学染色对培养的细胞及其分化的细胞进行鉴定。结果从胶质瘤组织当中成功培养出人类的胶质瘤干细胞,培养条件下呈悬浮状态生长,形成神经球,绝大多数的细胞表达波形蛋白和巢蛋白两种神经干细胞的标志物;这种细胞可分化为神经元和星型胶质细胞。结论体外的培养条件下,可从胶质瘤组织中培养出干细胞,能够分化为神经元和星型胶质细胞,为胶质瘤的深入研究莫定基础。     

人胎脑神经干细胞的体外分离、培养与鉴定

目的探索人胎脑神经干细胞的体外分离培养条件,从而在体外大量增殖神经干细胞,并观察神经干细胞增殖和分化的特点。方法采用含碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）和表皮细胞生长因子（EGF）的无血清培养技术,从14周自愿水囊引产人胎脑海马皮质中分离出神经干细胞,并进行培养、传代、分化观察,应用免疫荧光细胞化学技术对培养的细胞及其分化的细胞进行鉴定。结果从14周人胎脑皮质中成功分离出具有自我更新和多分化潜能的神经干细胞,在无血清培养时细胞呈悬浮状态生长,形成神经球,该细胞具有连续增殖能力,可传代培养,表达神经巢蛋白抗原（Nestin）;在含血清培养时诱导神经干细胞分化,分化后的细胞表达神经元细胞和胶质细胞的特异性抗原。结论在含有EGF和bFGF的无血清培养液中,从人胎脑能分离培养出具有自我复制和分化潜能的神经干细胞,并能在体外扩增,可进一步用于基础及临床研究。     

类胚体中残留未分化胚胎干细胞的初步研究

目的 探讨类胚体中残留未分化胚胎干细胞（ESC）的特性。方法 小鼠R1和Oct-4-GFP转基因ESC细胞株,体外类胚体分化20 d后消化打散,重新给予ESC常规培养液培养。观察类胚体中残留未分化细胞形态;流式细胞仪和免疫荧光染色检测和观察残留细胞表面标志物及体外再次分化能力。将残留细胞扩增后注射入裸鼠背部皮下和大腿肌肉内,6周后注射部位取材进行大体和组织学检查。结果 分化20 d的类胚体中存在残留未分化ESC,生长形态呈克隆样,表达SSEA1、CD31、CD9和Oct-4等未分化ESC标志;细胞能反复传代,并可在体外再次分化和残留。残留细胞注射部位形成畸胎瘤,瘤体组织中存在成熟的内胚层、中胚层和外胚层组织。结论 胚胎干细胞分化为类胚体后仍存在残留未分化全能ESC,残留细胞在体内、外可再次分化,并能在体外分化中再次残留。