猪源马链球菌兽疫亚种类M蛋白原核表达及其小鼠免疫保护力分析

为了原核表达猪源马链球菌兽疫亚种去除信号肽的类M蛋白质,并分析该蛋白质对小鼠的免疫保护力,克隆了马链球菌兽疫亚种CY菌株去除信号肽的类M蛋白质基因Szp,并将Szp基因插入p ET28a表达载体,IPTG诱导,获得重组类M蛋白质,弗氏佐剂乳化重组类M蛋白质后,3次免疫小鼠,用同源菌株CY攻击。诱导获得分子量约5.8×104的重组蛋白质,免疫印迹结果表明该重组类M蛋白质能够被马链球菌兽疫亚种猪多抗识别。类M蛋白质免疫小鼠的存活率为60%,弗氏佐剂乳化灭活CY免疫小鼠的存活率为70%,PBS对照组小鼠攻毒后6 d内全部死亡。表达的类M蛋白质可以给予ICR小鼠部分的免疫保护力,保护效果略低于CY全菌灭活苗,提示可以对马链球菌兽疫亚种多种免疫保护性抗原进行联合,从而进一步提高对动物的免疫保护力。     

猪源马链球菌兽疫亚种中国分离株类M基因特性分析

 【目的】阐明国内不同区域猪源马链球菌兽疫亚种分离株类M基因的特性，为疫苗研制提供指导。【方法】利用PCR技术，扩增国内9省市从1974～2003年分离的9株马链球菌兽疫亚种类M基因，并进行克隆、测序及序列分析。【结果】发现7株类M基因长度为1 137 bp，含一个阅读框，CG-74-63和CP-0104株的长度分别为1 143 bp及1 125 bp。除1株关节炎分离株CP-0104外，引致败血症的8株菌类M基因的核苷酸同源性高达95.4%～99.9%，推导的相应氨基酸序列同源性高达92.1%～100%。9株猪源菌与马源菌株及人源菌株类M基因的核苷酸同源性分别为81.6%～87.0%、81.7%～91.8%。9株猪源分离株类M蛋白信号肽、C末端细胞锚定区的序列均高度同源；除CP-0104外，其余8株高变区高度同源。【结论】国内不同区域猪源马链球菌兽疫亚种分离株类M基因同源性高。     

猪源马链球菌兽疫亚种灭活疫苗对小鼠的免疫效力评价

 【目的】评价中国不同地区猪源马链球菌兽疫亚种分离株抗原性的差异,为猪链球菌病疫苗的研制提供指导。【方法】取从国内10省市分离的10株猪源马链球菌兽疫亚种分离株,分别制备灭活疫苗,免疫12周龄ICR小鼠,用同源菌株和ATCC35246株攻击。【结果】以同源菌株攻击免疫小鼠,除CG-74-63株外,其余菌株的保护率均在90％以上;而以异源菌株ATCC35246进行攻击,免疫小鼠的免疫保护率为80%～100%。【结论】中国不同地区的猪源马链球菌兽疫亚种分离株的抗原性差异不大,单一菌株制备的疫苗具有保护性。     

类M蛋白对HEp-2细胞的黏附作用

采用通用的模式细胞HEp 2作黏附及黏附抑制试验 ,研究马链球菌兽疫亚种ATCC35 2 4 6株类M蛋白的黏附作用。结果表明 ,ATCC35 2 4 6株可以黏附HEp 2细胞。用重组表达的类M蛋白鼠抗血清处理ATCC35 2 4 6 ,可抑制其对HEp 2细胞的黏附 ,最大抑制率达 81 4 % ;而ATCC35 2 4 6的全菌鼠抗血清在 1∶80 0时能完全抑制它对HEp 2细胞的黏附。此外 ,热酸提取的ATCC35 2 4 6株的类M蛋白和重组表达的类M蛋白可不同程度地抑制该菌株的黏附 ,前者在 16 0μg·mL-1有最大的黏附抑制率 ( 4 0 % ) ,而后者在 6 0 μg·mL-1的黏附抑制率可达最高值 ( 2 3% )。结果显示 ,类M蛋白是ATCC35 2 4 6株的黏附素之一 ,在对细胞的黏附过程中发挥作用     

猪链球菌2型胞外因子的融合表达及多克隆抗血清的制备

根据GenBank SS2(Streptococcus suis serotype 2,SS2)epf基因序列设计引物,克隆epf基因片段并进行序列分析,同时亚克隆到GST融合蛋白表达载体pGEX4T-2上,将构建的原核表达质粒pGEx4T-2-epf导入大肠杆菌(Eacterium coli)TG1中,诱导融合蛋白EF-GST的表达.经亲和层析、凝血酶切割后,获得纯化的EF为抗原蛋白,用其免疫家兔制备抗血清,成功制备了EF蛋白及其特异的多克隆抗体,为进一步研究EF的功能提供了有用的工具.     

猪链球菌2型MRP与EPF基因串联表达蛋白及其免疫保护作用

 根据猪链球菌2型（Streptococcus suis type 2,SS2）溶菌酶释放蛋白(muramidase-released protein,MRP)和胞外蛋白因子（extracellular protein factor，EPF）的基因序列，各设计合成一对引物，以猪链球菌2型江苏分离株SS2-1的基因组为模板，扩增mrp基因1 801~2 513位序列和epf 基因1 783~2 563位序列，分别构建原核表达载体pET32a-mrp 、pET32a-epf，确定诱导表达的两种蛋白都具有免疫原性后，提取阳性克隆质粒各自进行双酶切并纯化，通过PCR串联两片段,将目的片段定向克隆到表达载体pET-32a中，重组质粒转化入大肠杆菌BL21，经IPTG诱导表达分子量约为74kD的融合蛋白。用制备的两种抗血清与纯化融合蛋白进行免疫转印,结果显示融合蛋白分别具有MRP与EPF的中和表位。用融合蛋白MRP-EPF免疫新西兰兔,以最小致死量猪链球菌强毒株SS2-1攻击,兔的存活率达50%(2/4),存活率明显高于单个表达产物。证实串联表达的融合蛋白为重要的保护性抗原。     

猪链球菌2型epf基因的原核表达及其蛋白纯化

为了克隆、表达SS2菌株轲基因片段,分析蛋白活性,根据GenBank SS2 epf基因序列设计引物,克隆epf基因片段并进行序列分析,构建原核表达质粒pGEX4T-2-epf,在大肠杆菌中诱导带有GST标签的融合蛋白rEF-GST的表达;亲和层析法纯化融合蛋白rEF-GST,用凝血酶切除重组蛋白中的GST,获得纯化的EF抗原。经Westernblot鉴定,EF可与SS2多克隆抗血清发生特异性反应。     

猪链球菌2型溶血素融合蛋白的制备及免疫活性测定

[目的]研究四川资阳脑膜炎病例猪链球菌2型分离株ZYH33溶血素（suliysin,sly）基因的克隆表达及融合蛋白生物活性分析。[方法]从sly中获取第230~593氨基酸残基区域的基因片段,克隆至pMD18-T载体并鉴定,以重组pMD18-T/sly为模板PCR扩增基因片段,与表达载体pQE-30连接,转化至大肠杆菌TG1,重组子经PCR、酶切、测序鉴定。IPTG诱导重组蛋白表达,Western blot法鉴定融合蛋白的抗原性。[结果]基因片段在大肠杆菌中得到了表达,表达的融合蛋白可被猪链球菌2型菌体ZY05719抗血清识别,具有抗原性。[结论]所克隆、表达的溶血素区域可作为猪链球菌的诊断抗原,为基因工程疫苗的研制奠定了基础。     

马立克氏病病毒gB与IL-2融合基因载体的构建及表达

根据已发表的马立克氏病病毒(MDV)血清I型与鸡白介素2(IL-2)DNA序列,设计两对引物,用PCR扩增出MDV gB基因和IL-2基因,并克隆入pEGFP-C1载体,构建了载体pC1-gB-IL.通过酶切分离外源基因表达盒,并将外源基因表达盒插入pTK2B质粒,成功构建了转移载体pT-C-gB-IL.将转移载体pT-C-gB-IL转染CEF细胞,培养36～48 h后,经荧光显微镜观察,有荧光出现,证明该载体得到表达,并通过Western-blotting鉴定证明MDV gB和IL-2的融合基因得到了有效的表达.     

马立克氏病病毒gB与IL-2融合基因载体的构建及表达

根据已发表的马立克氏病病毒(MDV)血清Ⅰ型与鸡白介素2(IL-2)DNA序列,设计两对引物,用PCR扩增出MDV gB基因和IL-2基因,并克隆入pEGFP-C1载体,构建了载体pC1-gB—IL。通过酶切分离外源基因表达盒,并将外源基因表达盒插入pTK2B质粒,成功构建了转移载体pT-C—gB-IL。将转移载体pT-C-gB-IL转染CEF细胞,培养36—48h后,经荧光显微镜观察,有荧光出现,证明该载体得到表达,并通过Western—blotting鉴定证明MDV gB和IL-2的融合基因得到了有效的表达。     

马链球菌马亚种新疆株ZX表面蛋白的提取及免疫原性分析

为研究马链球菌马亚种新疆分离株 ZX 表面蛋白的免疫原性,用化学法提取该菌的表面蛋白,用 SDSG PAGE检测提取的表面蛋白,并将提取的表面蛋白与该菌免疫实验兔后产生的抗体及康复马血清反应,利用 WestG ernGblotting和 ELISA试验分析其免疫原性.结果表明,SDSGPAGE电泳可检测到分子量为45,34,33,30,27,20,16 kDa 7条主蛋白带.提取的7条蛋白带多数可与全菌免疫兔的抗体及康复马体内的抗体发生特异性的结合.用提取蛋白和全菌包被 ELISA对马血清的检测表明,二者的阳性吻合率在86．0％.表明提取的表面蛋白具有理想的免疫原性.     

猪链球菌2型溶血素基因的检测

根据GenBank发表的猪链球菌2型(SS2)溶血素基因(sly)全序列,利用O ligo(7.0)软件设计并合成了可扩增长度为495 bp的引物,从SS2参考菌株ATCC43765和SS2江苏分离株HA9801中扩增出495 bp的条带,利用HindⅢ限制性内切酶对具有相应单一酶切位点的PCR扩增产物进行酶切,获得预期的314 bp和181 bp的2个DNA片段,检测灵敏度达到2.5×102CFU.mL-1;但不能从马链球菌兽疫亚种ATCC35246、大肠埃希氏菌ATCC25922、单增李斯特杆菌ATCC19115/413、金黄色葡萄球菌ATCC25923、粪肠球菌ATCC29212中扩增出相应的条带。PCR扩增产物的测序结果与GenBank的猪链球菌sly基因(Z36907)核苷酸序列完全一致。该方法可快速、敏感、特异地检测SS2的溶血素基因。     

猪链球菌2型溶菌酶释放蛋白部分片段的原核表达及其抗体间接ELISA检测方法的建立

为了建立猪链球菌2型溶菌酶释放蛋白(MRP)抗体间接ELISA检测方法,该研究首先克隆了MRP编码基因的部分片段,构建了重组表达质粒pET28a-mrp,并将该质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)进行表达,获得了58 000的重组蛋白,经Ni柱纯化后,免疫印迹显示MRP重组蛋白能够被猪链球菌2型抗体特异性识别。以纯化的MRP重组蛋白作为包被抗原,建立了猪链球菌2型MRP抗体检测间接ELISA方法。该ELISA方法的包被抗原浓度为10μg/ml,待检血清1∶50稀释,检测临床48份未免疫猪链球菌2型疫苗健康猪的血清。当效价(S/P)≥0.22时,判定待检血清样品为阳性;当S/P<0.22时,判定待检血清样品为阴性。运用建立的方法能特异性识别猪链球菌2型抗体,人工感染猪的MRP抗体于攻毒后14～28 d出现峰值,同时提示临床健康猪群的免疫功能存在个体差异。     

猪链球菌2型福建株的分离鉴定

从临床表现为败血症的濒死病猪肝脏、肺脏、淋巴结中分离到一株链球菌,进行形态学、生化特性、小白鼠感染试验及PCR鉴定和CPS2 J序列测定.结果表明:该分离菌的形态、培养和生化特性基本符合链球菌的特点;人工感染试验显示,小白鼠腹腔接种0.2 mL分离菌培养物不发病,但接种1 mL能在48 h内致小白鼠死亡,并能从脏器中分离到接种菌;分离菌的PCR扩增产物与猪链球菌2型阳性参考菌株JA070109大小一致、长度为675 bp的特异性条带,其PCR产物的核苷酸序列与GeneBank上公布的猪链球菌2型不同菌株的同源性高达98%-100%.可见,该分离菌为猪链球菌2型,并首次证实福建存在猪链球菌2型.     

猪链球菌2型溶菌酶释放蛋白诱导血管内皮细胞融合

 猪链球菌2型（SS2）主要引起人和猪的脑膜炎，但其毒力因子溶菌酶释放蛋白(MRP)对构成血脑屏障的微血管内皮细胞有何致病作用迄今不明。为此分离仔兔脾微血管内皮细胞（SMEC），纯化后用SV40-T抗原转化后用作试验的细胞模型。将单层SMEC和电泳纯MRP溶液共孵育，染色后，光镜观察，发现MRP可诱导SMEC发生两种典型形态学变化：致密细胞单层中出现巨大空洞而呈网状；空洞内有细胞融合，形成多核巨细胞，随后巨细胞核极度浓缩释出，巨细胞消失。研究结果表明， MRP单独足以破坏大脑的血管内皮细胞屏障。     

猪链球菌2型广西分离株毒力基因表型分析

【目的】了解广西致病性猪链球菌2型（SS2）菌株的毒力基因表型,为广西SS2的防制提供分子生物学依据。【方法】应用PCR技术对分离自发病猪的SS2菌株进行荚膜多糖糖基转移酶基因（CPS2J）、溶菌酶释放蛋白基因（MRP）、细胞外蛋白因子基因（EF）、溶血素基因（SLY）和谷氨酸脱氢酶基因（GDH）5种毒力基因检测。【结果】60%菌株的基因表型为CPS2J＋/MRP＋/EF＋/SLY＋/GDH＋,30%为CPS2J＋/MRP＋/EF＋/SLY-/GDH-,10%为CPS2J＋/MRP＋/EF＋/SLY-/GDH＋。【结论】CPS2J＋/MRP＋/EF＋/SLY＋是广西致病性SS2菌株的主要基因表型,与从江苏、四川SS2疫区分离获得的菌株基因表型一致,今后应加强对SS2毒力基因的监测,严防SS2疫情暴发。