pEGFP-hApelin-R重组真核表达载体的构建及在HEK293细胞中的表达

目的构建与增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein,EGEP）融合的人apelin受体（Apelin receptor,apelin-R）真核表达载体。方法以质粒pcDNA3.1-hApelin-R为模板,PCR方法扩增人apelin受体。扩增的人apelin受体用EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切,同时用这两种酶双酶切质粒peGFP-C1。然后将两种酶切产物按常规方法连接、转化大肠杆菌Top10。挑取菌落培养,提取质粒,然后进行酶切鉴定,最后进行测序。将测序正确的重组载体用脂质体法转染人胚胎肾（human embryonic kidney293,HEK293）细胞,共聚焦显微镜观察。提取转染细胞的总蛋白,进行Westernblot检测。结果扩增出一条约1200bp的片段,与预期的apelin受体大小相符。酶切结果显示,重组质粒pEGFP-hApelin-R被切成两条片段,其中一条为peGFP-C1载体大小,另一条为目的片段大小。经测序鉴定,序列与GenBank（NM_005161）中的序列高度同源。共聚焦显微镜观察显示,人apelin受体主要在细胞膜上表达。Westernblot结果显示在相对分子质量69000处有一蛋白条带,与预期大小相符。结论构建成功pEGFP-hApelin-R重组表达载体,此表达载体可用于检测apelin受体和κ型阿片受体（kappa opioid receptor,KOR）或与其他受体间的相互作用。     

人DC-SIGN基因表达质粒的构建及其表达

目的 构建含有人DC-SIGN基因的真核表达载体,并在293T细胞中表达目的 蛋白.方法 人血培养获得树突状细胞(DC),以DC的mRNA逆转录cDNA为模板,应用PCR体外扩增获得目的 DNA,用限制性内切酶Sal Ⅰ和BamH Ⅰ分别酶切VRC4409载体和PCR产物,通过连接、转化及克隆的筛选将目的 基因克隆入载体VRC4409,构建载体VRC4409-DC-SIGN,经PCR鉴定及测序分析证实,脂质体介导转染293T细胞,蛋白质印迹分析其表达DC-SIGN蛋白.结果 重组质粒经双酶切和测序鉴定证实VRC4409-DC-SIGN构建成功,DC-SIGN蛋白在293T细胞中成功表达.结论 成功构建质粒VRC4409-DC-SIGN并在293T细胞中表达目的 蛋白,为进一步研究DC-SIGN的生物学功能奠定了基础.     

人DC-SIGN基因表达质粒的构建及其表达

目的构建含有人DC-SIGN基因的真核表达载体,并在293T细胞中表达目的蛋白。方法人血培养获得树突状细胞（DC）,以DC的mRNA逆转录cDNA为模板,应用PCR体外扩增获得目的 DNA,用限制性内切酶SalⅠ和BamHⅠ分别酶切VRC4409载体和PCR产物,通过连接、转化及克隆的筛选将目的基因克隆入载体VRC4409,构建载体VRC4409-DC-SIGN,经PCR鉴定及测序分析证实,脂质体介导转染293T细胞,蛋白质印迹分析其表达DC-SIGN蛋白。结果重组质粒经双酶切和测序鉴定证实VRC4409-DC-SIGN构建成功,DC-SIGN蛋白在293T细胞中成功表达。结论成功构建质粒VRC4409-DC-SIGN并在293T细胞中表达目的蛋白,为进一步研究DC-SIGN的生物学功能奠定了基础。     

携带融合基因穿梭质粒的构建及在人肝癌细胞中的表达

构建携带胸苷激酶(tk)与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)融合基因穿梭质粒,并观察其在肝癌细胞系HepG2细胞中的表达。应用基因重组技术,构建EGFP与tk的融合表达穿梭质粒载体,经限制酶切鉴定和测序分析,脂质体转染将其导入HepG2中,48h后用荧光显微镜观察荧光的表达,RT-PCR法检测融合蛋白tk和EGFP的mRNA表达,四甲基偶氮唑蓝(MTT)实验检测转染融合蛋白载体后不同浓度的更昔洛韦(GCV)对HepG2细胞的细胞毒作用。酶切鉴定和测序分析证实重组质粒中插入融合目的基因片断及载体DNA大小、方向和插入位点正确,在转染此穿梭质粒的HepG2细胞中检测到绿色荧光蛋白的表达,RT-PCR检测到融合蛋白tk和EGFP的mRNA表达;GCV对转染了携带tk与EGFP融合基因穿梭质粒载体有明显的细胞毒作用。成功构建携带tk与EGFP融合基因穿梭质粒载体,转染人肝癌细胞株HepG2中tk和EGFP的独立表达没有受到影响,该载体可利用绿色荧光蛋白作为报告基因监测tk的表达并可用于肝癌的自杀基因治疗。     

人pEGFP-PKARⅡβ重组质粒的构建及其在BGC-823胃癌细胞中的表达

目的:研究人的蛋白激酶A调节亚基RⅡβ(PKARⅡβ)基因的绿色荧光蛋白(GFP)真核表达载体融合蛋白在胃癌细胞BGC-823内的表达和定位,初步探讨其在肿瘤细胞中的分子作用机制.方法:以pRSETB-PKARⅡβ质粒为模板,PCR扩增出全长PKARⅡβ编码序列,用Xho Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切后,亚克隆至含有GFP标...     

带有HA标签的HBc蛋白真核表达质粒的构建及其在HEK293细胞中的表达

目的构建带有流感病毒血凝素9钛表位标签（HA标签）的乙型肝炎病毒（HBV）核心蛋白（HBc）的表达质粒,为进一步研究HBe蛋白基因的功能奠定实验基础。方法设计并合成扩增HBc蛋白全长的PCR引物,以野生型的HBV质粒pDolTHBV-1为模板,PCR扩增全长的HBc蛋白,大小为563bp;PCR产物经过Eco砒和XholI酶切后,与线性化的pcDNA3／HA载体连接后转化大肠杆菌,扩增、纯化获得所需质粒,以琼脂糖凝胶电泳、酶切鉴定以及基因测序鉴定其分子质量和插入片段的序列;构建的质粒转染HEK293细胞48h后,RIPA裂解细胞,Western blot检测HBc蛋白表达。结果纯化质粒的相对分子质量为5．9kb,酶切鉴定结果符合目的条带（563bp）大小,插入的寡核苷酸序列与野生型HBV基因序列完全相符,表达的融合蛋白大小为28kDa。结论成功构建了带有HA标签的HBc蛋白的真核表达质粒pcDNA3／HA—HBc蛋白,为进一步研究HBe蛋白的功能奠定了良好的实验基础。     

家蚕素Ⅱ基因在293FT细胞中的表达

目的探讨家蚕素Ⅱ(BombyxinⅡ)基因在293FT细胞中的表达。方法应用脂质体将携带具有6个组氨酸标签的家蚕素Ⅱ基因的真核表达载体与携带β半乳糖苷酶基因的真核表达载体共同导入293FT细胞。采用β半乳糖苷酶细胞原位染色检测β半乳糖苷酶基因在细胞内的表达,从而判断基因的细胞转染效率;应用逆转录PCR方法检测家蚕素Ⅱ基因在细胞内mRNA水平的表达;应用免疫组织化学方法检测6个组氨酸标签蛋白在细胞内的表达,从而间接判断家蚕素Ⅱ基因在蛋白水平表达情况。结果β半乳糖苷酶原位染色显示基因转染组可见到染成蓝色的细胞,正常未转染组未见到蓝色细胞;逆转录PCR结果显示只有转染携带家蚕素Ⅱ基因的真核表达载体的293FT细胞中可检测到家蚕素Ⅱ基因表达;免疫组化结果显示只有转染携带家蚕素Ⅱ基因的真核表达载体的293FT细胞中可见到染成棕黄色的细胞颗粒。结论通过基因转染技术,成功使家蚕素Ⅱ基因在293FT细胞得以表达,为进一步研究其降血糖生物活性奠定实验基础。     

人FUT3基因真核表达载体的构建与表达

目的:构建增强型绿色荧光蛋白为报告基因的pEGFP-C1-FUT3真核表达载体,分析其在细胞系MDA-MB-231中的表达.方法:采用RT-PCR扩增FUT3全长基因片段,克隆至pMD18-T载体进行测序分析,将FUT3亚克隆至pEGFP-C1表达载体并酶切鉴定.利用脂质体将重组真核表达栽体pEGFP-C1-FUT3转染入人乳腺癌细胞MDA-MB-231中,经G418筛选获得稳定转染的细胞系,荧光显微镜观察及RT-PCR检测FUT3的表选.结果:成功获得人全长FUT3基因并构建了真核表达栽体pEGFP-C1-FUT3,体外转染MDA-MB-231细胞后荧光显微镜下可见绿色荧光蛋白的表达,半定量RT-PCR检出高水平表达的FUT3.结论:成功构建了增强型绿色荧光蛋白为报告基因的FUT3真核表达载体,并在MDA-MB-231中稳定表达,为进一步研究FUT3的生物学功能提供基础.     

弓形虫MIC3基因真核表达质粒的构建及其在BHK细胞中的表达

目的 构建弓形虫微线体蛋白( MIC3)的真核表达质粒,为进一步研究MIC3蛋白的功能奠定基础.方法 PCR法扩增弓形虫MIC3目的基因,将纯化的目的基因插入到真核表达质粒PCDNA3.0,并转入DH5α 宿主菌中,在含有青霉素的SOB平板上筛选阳性重组子,采用酶切和PCR扩增法对重组质粒进行鉴定;应用HifectinⅡ真核细胞转染试剂将弓形虫PCDNA-MIC3真核表达质粒转染幼地鼠肾细胞(BHK),表达产物用SDS-PAGE进一步确认,ELISA法检测表达蛋白的免疫原性.结果 重组质粒PCDNA-MIC3经单双酶切及PCR扩增都得到以原插入片段MIC3基因1120 bp大小相同的片段,PCDNA-MIC3能在BHK细胞中高效表达,表达产物能被弓形虫特异性血清所识别.结论 成功构建了弓形虫MIC3基因真核表达质粒PCDNA-MIC3.     

人α-防御素基因的克隆及其在293T细胞中表达的临床意义

目的克隆人α-防御素（α-HNP）基因,构建重组真核表达质粒pCG-HNP并检测其在293T细胞中的表达。方法提取人PBMC细胞的RNA,以其为模板用RT-PCR技术克隆人α-HNP的cDNA,并将其插入质粒pCG中构建真核表达载体。测序证实后,将重组质粒用脂质体法转染293T细胞,用蛋白质免疫印迹法（Western）检测目的蛋白分子的表达。结果测序证实克隆的人α-HNP阅读框正确完整,PCR鉴定和酶切鉴定证实插入方向正确,免疫印迹结果显示重组质粒能够在293T细胞中表达HNP-GFP-Flag融合蛋白。结论α-HNP基因成功克隆;其在293T细胞中的表达可为进一步研究其抗HIV活性奠定基础。     

HIV-1B亚型核心蛋白gag基因真核表达载体的构建及其在HepG2细胞中的表达

目的克隆人类免疫缺陷病毒Ⅰ型B亚型核心蛋白gag基因,构建真核表达载体,并在真核细胞中表达,为进一步制备自行设计的以λ噬菌体作为载体的HIV核酸疫苗奠定基础。方法以克隆好的HIV1B亚型U26942全基因质粒DNA作为模板,根据Genbank中gag基因的核苷酸序列设计引物,并在引物的5’端分别引入BamHⅠ及XhoⅠ酶切位点,特异性的扩增gag基因。TA克隆后经双酶切、测序等鉴定重组质粒,再经双酶切、连接构建含gag编码基因的真核表达载体,并进行酶切鉴定分析pcDNA3.1(+)/gag。在脂质体介导下转染HepG2细胞,经G418压力筛选建立稳定转染gag基因的细胞系,用RT PCR及Western印迹检测其在HepG2细胞中的表达。结果重组质粒经BamHⅠ、XhoⅠ双酶切成5.4kb与1.5kb的片断,表明表达载体pcDNA3.1(+)中插入了gag基因片断,测序结果表明编码框正确。RT PCR及Western印迹证实稳定转染gag基因的HepG2细胞系中有该基因的表达。结论成功构建了HIV1B亚型核心蛋白gag基因的真核表达载体pcDNA3.1(+)/gag,并在HepG2细胞中获得稳定表达。     

甲型流感病毒NP基因真核载体的构建及初步表达

目的构建甲型流感病毒A/PR/8/34(H1N1)NP基因的真核表达载体,转染HEK293细胞,检测其表达情况。方法采用RT-PCR技术克隆甲型流感病毒株NP基因,将克隆的片段插入真核表达载体pcDNA3.1(+)。经酶切、PCR和测序鉴定后,构建好的pcDNA3.1(+)/NP用脂质体转染法转染HEK293细胞,通过免疫荧光技术检测其目的蛋白的瞬时表达。结果RT-PCR扩增到NP基因,插入真核表达载体pcDNA3.1(+),转染HEK293后经免疫荧光技术检测到目的蛋白的表达。结论本实验构建的甲型流感病毒NP部分基因序列的真核表达载体,为深入研究流感病毒核衣壳蛋白和有效的核酸疫苗奠定了基础。     

流感病毒血凝素基因HA1区的克隆及其真核表达载体的构建

目的　克隆甲型流感病毒血凝素基因HA1区及构建其真核表达载体。方法　从接种人流感病毒株A/PR/ 8/ 34(H1N1)的鸡胚尿囊液中提取病毒RNA ,用特异引物进行RT PCR ,扩增血凝素基因HA1区。将所扩增片断克隆入真核表达质粒载体pcDNA3.1(+) ,转化感受态大肠杆菌JM 10 9并筛选阳性克隆。结果　经双酶切、PCR及测序鉴定证实血凝素基因HA1区的真核表达载体构建成功。结论　甲型流感病毒血凝素的HA1区是与宿主细胞膜表面受体结合的部位并起着诱导机体产生保护性抗体的作用 ,HA1区的克隆和其真核表达质粒的构建将为防治病毒侵入宿主细胞及核酸疫苗的研究打下基础。     

人脂联素基因真核表达载体的构建及在HEK293细胞中的表达

目的构建人脂联素（APM1）基因真核表达载体，并检测其在HEK293细胞中的表达水平。方法用PCR法从测序正确的pGEM-T-APM1质粒上，扩增出两端带有Sfi Ⅰ酶切位点的人脂联素基因，再将扩增出的片段亚克隆到T载体上，用sfi Ⅰ酶切T载体和pCDEF空载体，将酶切后的片段进行连接、转化、筛选、鉴定、测序。将成功构建的pCDEF—APM1质粒转染HEK293细胞，ELISA检测培养上清中脂联素的水平。结果构建的pCDEF-APM1质粒能有效转染HEK293细胞，并在培养上清中检测到较高水平的脂联素蛋白。结论成功地构建了人脂联素基因的真核表达载体，并在HEK293细胞中获得高效表达。     

Construction of targeted plasmid vector pcDNA3.1-Egr.1p-p16 and its expression in pancreatic cancer JF305 cells induced by radiation in vitro

To construct pcDNA3.1-Egr.1p-p16 recombinant plasmid and investigate the expression of p16 in pancreatic cancer JF305 cells induced by radiation and the feasibility of gene radiotherapy for pancreatic carcinoma.     

Construction of recombinant eukaryotic expression plasmid containing murine CD40 ligand gene and its expression in H22 cells

AIM: To construct a recombinant murine CD40 ligand (mCD40L) eukaryotic expression vector for gene therapy and target therapy of hepatocellular carcinoma (HCC). METHODS: mCD40L cDNA was synthesized by RT-PCR with the specific primers and directly cloned into T vector to generate middle recombinant. After digestion with restriction endonuclease, the target fragment was subcloned into the multi-clone sites of the eukaryotic vector. The constructed vector was verified by enzyme digestion and sequencing, and the product expressed was detected by RT-PCR and immunofluorescence methods. RESULTS: The full-length mCD40L-cDNA was successfully cloned into the eukaryotic vector through electrophoresis, and mCD40L gene was integrated into the genome of infected H22 cells by RT-PCR. Murine CD40L antigen molecule was observed in the plasma of mCD40L-H22 by indirect immuno-fluorescence staining. CONCLUSION: The recombined mCD40L eukaryotic expression vector can be expressed in H22 cell line. It provides experimental data for gene therapy and target therapy of hepatocellular carcinoma.     

血管内皮细胞生长因子真核表达质粒的构建及其在心肌细胞中的表达

目的 :构建血管内皮细胞生长因子 （ VEGF1 65）真核表达质粒 pc DNA3 .1（ -） /h VEGF1 65,并通过转染心肌细胞来验证其生物活性。方法 :应用 DNA重组方法 ,将编码 h VEGF1 65全长 c DNA克隆于真核表达载体 pc DNA3 .1（ -）中 ,构建 pc DNA3 .1（ -） /h VEGF1 65真核表达质粒 ;应用阳性脂质体介导的基因转染技术 ,将真核表达质粒 pc D-NA3 .1（ -） /h VEGF1 65瞬时转染培养的大鼠心肌细胞中 ;采用 RT-PCR,ELISA,Western blot及免疫组化染色等方法检测 VEGF1 65基因在心肌细胞中的表达情况 ;应用 MTT法检测转染后细胞上清液中 VEGF1 65的生物活性。结果 :将构建好的真核表达质粒 pc DNA3 .1（ -） /h VEGF1 65转染心肌细胞后 ,VEGF m RNA及蛋白表达水平明显增高 ,转染后的心肌细胞培养上清液具有促使内皮细胞增殖的生物活性。结论 :成功构建了真核表达质粒 pc DNA3 .1（ -） /h VEGF1 65,其转染心肌细胞后可获得较高水平 VEGF蛋白的表达 ,所表达出 VEGF蛋白具有生物学活性     

人ACE2基因真核表达载体的构建及其转染人内皮细胞的研究

目的:克隆人血管紧张素转换酶2(ACE2)基因,构建其真核表达载体并将之转染入体外培养的人血管内皮细胞中。方法:采用PCR方法从人胎儿心脏cDNA文库扩增出人ACE2cDNA全长基因,克隆到pcDNA3.1-D/V5-His表达载体上,构建重组真核表达质粒phACE2,经酶切和测序鉴定。采用脂质体法将phACE2转染至人血管内皮细胞中,分别利用实时定量PCR和Western印迹检测重组ACE2的mRNA和蛋白的表达情况。结果:经PCR、酶切和基因序列测定证实重组入载体的片段(2419bp)为目的基因序列,在转染的内皮细胞中发现ACE2的mRNA和蛋白的表达明显增加(P<0.01)。结论:本研究成功构建并表达了pcDNA3.1-hACE2重组真核表达载体,为该基因在高血压病防治中的功效研究奠定了基础。     

hSp17真核表达载体构建及其在卵巢癌细胞中的表达

目的构建人精子蛋白17（hSp17）基因的真核表达载体pcDNA3.1（＋）/hSp17,为其临床应用奠定基础。方法用PCR方法获取hSp17基因片段,NheⅠ、KpnⅠ双酶切、粘端连接的方法构建含有hSp17基因的pcD-NA3.1（＋）/hSp17真核表达载体。将该载体行脂质体介导转染卵巢癌细胞HO8910,免疫细胞化学方法检测转染细胞hSp17蛋白表达,G418筛选稳定表达hSp17蛋白的细胞株。结果酶切和测序结果均证实pcDNA3.1（＋）/hSp17重组质粒的构建完全正确。免疫细胞化学方法证实外源性hSp17基因能够在卵巢癌HO8910细胞瞬时表达。经G418连续筛选,得到阳性克隆细胞株,并证实了外源性hSp17基因在卵巢癌HO8910细胞中稳定表达。结论成功构建了稳定表达外源性hSp17蛋白的卵巢癌细胞株;其可为卵巢癌的免疫治疗奠定基础。     

弓形虫GRA4基因真核表达重组质粒的构建与表达

目的构建弓形虫致密颗粒蛋白GRA4的真核表达质粒，并研究其在体外与体内细胞中的表达情况。方法采用PCR方法及克隆技术，构建pVAC-GRA4重组质粒；利用脂质体介导转染法，将该重组质粒导入HEK-293细胞，用RT—PCR法及Westem-blot法检测其表达情况；利用基因枪导入法将该重组质粒导入BALB／c小鼠体内细胞，测定免疫鼠T淋巴细胞亚群及IFN-γ、IL-4含量，并观察攻毒试验后小鼠存活情况，以评价其免疫保护力。结果从弓形虫RH株基因组DNA中扩增出GRA4基因片段，成功构建重组表达质粒pVAC-GRA4；转染GRA4的HEK-293细胞，RT—PCR检测可见一条约987bp的目的条带，表达产物经Western—blot鉴定，其分子量约为41kD，能被特异性免疫血清所识别；经pVAC-GRA4免疫后的小鼠，其CD4^＋T细胞百分率无明显变化（P〉0．05），CD8^＋T细胞百分率明显增加（与pVAC对照组比较P〈0．05，与空白对照组比较P〈0．01）。CD4^＋／CD8^＋比值也较空白对照组明显降低（P〈0．01）；pVAC-GRA4免疫鼠IFN-γ的A值比对照组略高，但差异无显著性（P〉0．05）。IL-4A值各组间无明显变化（P〉0．05）；pVAC-GRA4免疫鼠存活率显著高于两对照组，死亡小鼠的平均存活时间延长（与空白对照组比较P〈0．05）。结论构建的真核表达质粒pVAC-GRA4能在HEK-293细胞中和小鼠体内细胞中轰基．为弓形出癌苗的进一步研究打下基础．