小肠黏膜下层修复骨关节损伤的研究进展

作为天然细胞外基质生物衍生材料,小肠黏膜下层(small intestinal submucosa,SIS)可用作组织工程的理想支架,在修复组织缺损和实现组织重塑方面具有广阔的应用前景。近年来,SIS在修复骨关节损伤方面的应用逐渐增多,研究发现SIS对骨、半月板、韧带或肌腱均表现出良好的修复效果,但是在关节软骨、腱骨愈合等方面的具体作用还有待进一步探索。新型SIS修复材料的开发,也将是亟待解决的焦点问题和进一步研究的热点。     

小肠黏膜下层组织与雪旺细胞生物相容性的体外研究

运用组织工程技术研究可替代自体神经移植的人工神经是近年研究的热点。小肠黏膜下层（small intestinal submocosa,SIS）作为支架材料在修复组织缺损的实验研究中已取得令人满意的效果，具有非常良好的应用前景。本实验将体外分离培养的雪旺细胞（Schwann cells,SCs）与SIS复合培养并研究其与SIS的生物相容性，从而为应用SIS作为支架材料构建人工神经提供依据。     

胶原涂层聚羟基丁酸羟基戊酸酯体外构建组织工程半月板

目的观察Ⅰ型胶原涂层的聚羟基丁酸羟基戊酸酯（PHBV）对半月板纤维软骨细胞的吸附作用及对细胞生物学性状的影响，评价其作为半月板组织工程支架的可行性及价值。方法构建Ⅰ型胶原涂层的PHBV半月板假体，将体外培养的兔半月板纤维软骨细胞吸附于该支架上三维立体培养。通过相差倒置显微镜、组织学、扫描电镜及免疫组织化学检测支架对半月板纤维软骨细胞的表型、增殖及功能的影响。结果PHBV能制成具有一定力学强度的半月板假体。通过Ⅰ型胶原涂层后增强了其细胞吸附能力，半月板纤维软骨细胞在支架孔壁贴附良好。维持表型稳定，分泌胞外基质。结论Ⅰ型胶原涂层的PHBV支架细胞相容性良好，能按半月板的大小、形状制成有一定力学强度的半月板假体，是比较理想的半月板组织工程支架材料。     

组织工程半月板支架材料的研究进展

目的总结组织工程半月板支架材料的研究进展。方法查阅近年来国内外组织工程半月板研究相关文献,对支架材料分类和仿生设计进行总结。结果目前组织工程半月板支架材料可大致分为人工合成聚合物、水凝胶、细胞外基质组分和组织衍生材料4类。上述材料具有不同特性,使用单一材料制备的支架具有一定缺陷,因此采用多种材料制备复合支架,以期发挥各种材料优势,是目前研究热点。除了材料选择外,材料加工方式也是研究重点。综合材料选择与加工方式,根据半月板形态结构与力学特点进行仿生设计的组织工程半月板支架具有较大潜力。结论目前组织工程半月板支架材料选择较多,但尚无一种材料能完全模拟天然半月板,有待进一步研究。     

Ⅰ型胶原半月板支架负载纤维软骨细胞体外培养

[目的]观察Ⅰ型胶原半月板支架对纤维软骨细胞的吸附作用及对细胞生物学性状的影响，评价其作为半月板组织工程支架的可行性及价值。[方法]构建Ⅰ型胶原半月板支架，将体外培养的兔半月板纤维软骨细胞吸附于该支架上三维立体培养，通过相差倒置显微镜、组织学、扫描电镜及免疫组织化学检测支架对半月板纤维软骨细胞的表型、增殖及功能的影响。[结果]Ⅰ型胶原能制成理想大小、形状的三维立体多孔半月板支架，纤维软骨细胞在支架孔壁贴附良好，维持表型稳定，分泌胞外基质。[结论]Ⅰ型胶原半月板支架细胞相容性良好，但力学性能相对较差，通过与其它生物材料复合以提高其机械力学强度，可望制得理想的半月板组织工程支架。     

小肠粘膜下层组织工程支架材料的生物相容性研究

目的 观察小肠粘膜下层(SIS)的生物相容性和作为组织工程支架材料的可行性.方法 参照国际标准ISO10993-1制定的医疗器械生物学评价的相关方法和标准,通过细胞毒性试验、热原试验、溶血试验、致敏试验、肌肉刺激试验等体内外生物学实验相结合的方法评价SIS的生物相容性及免疫原性.结果 实验证明小肠粘膜下层细胞相容性良好,不溶血,无致热、致敏反应,肌肉刺激试验的组织学检查见SIS周围无明显炎症及排斥反应,材料部分降解并见大量结缔组织生长.结论 SIS具有良好的生物相容性和免疫原性,可作为组织工程的支架材料.     

许旺细胞与小肠黏膜下层体外复合培养的形态学研究

目的观察体外培养的许旺细胞在小肠黏膜下层（SIS）表面的黏附生长状况，探讨SIS与许旺细胞（SCs）的生物相容性。方法体外分离培养SD乳鼠的许旺细胞，接种于制备好的SIS进行复合培养，不同时间段通过相差显微镜、组织学、扫描电镜和透射电镜观察SCs在SIS上的黏附、生长和增殖情况。结果相差显微镜下见3—5d后SIS边缘SCs生长良好；组织学观察见5d时许旺细胞与SIS表面黏附紧密；扫描电镜观察见SIS表面SCs增殖黏附良好，胞体突起显著，呈端对端的相互连接或排列成束，细胞表面可见有蛋白颗粒分泌。透射电镜观察见SIS表面许旺细胞生长状态良好，细胞紧密贴附生长于SIS表面；许旺细胞与SIS交界部见细胞底部形成一些突起与SIS接触。结论SCs能够在SIS表面良好地黏附生长，SIS作为支架材料，与SCs具有良好的生物相容性。     

3D打印制备聚己内酯/Ⅰ型胶原组织工程半月板支架及其理化特性的研究

目的采用低温沉积技术3D打印制备聚己内酯(polycaprolactone,PCL)/Ⅰ型胶原组织工程半月板支架(以下简称PCL/Ⅰ型胶原半月板支架),探讨其理化特性。方法制备15%PCL/4%Ⅰ型胶原溶液及15%PCL溶液,利用低温沉积技术3D打印制备PCL/Ⅰ型胶原半月板支架及PCL半月板支架。大体及扫描电镜观察支架形态及微观结构,生物力学试验测量支架压缩模量及拉伸模量,红外光谱分析支架成分,测量支架表面接触角;将两种支架及其浸提液分别与兔半月板细胞复合培养,细胞计数试剂盒8(cell counting kit 8,CCK-8)检测细胞增殖,并以正常培养细胞作对照;扫描电镜观察支架-细胞复合物中细胞黏附及生长情况。结果大体及扫描电镜观察显示,两种支架均具有取向的三维微观结构及孔隙,但PCL/Ⅰ型胶原半月板支架表面更粗糙。生物力学测试,两种支架压缩模量及拉伸模量比较,差异均无统计学意义(P0.05)。红外光谱分析提示,PCL/Ⅰ型胶原半月板支架中PCL和Ⅰ型胶原成功混合。PCL/Ⅰ型胶原半月板支架表面接触角为(83.19±7.49)°,较PCL半月板支架(111.13±5.70)°显著减小(t=6.638,P=0.000)。CCK-8检测显示,随培养时间延长,两种支架浸提液培养的细胞数量呈递增趋势,与对照组比较差异均无统计学意义(P0.05)。支架-细胞复合物扫描电镜观察示,PCL/Ⅰ型胶原半月板支架表面黏附细胞多于PCL半月板支架。结论低温沉积技术3D打印制备的PCL/Ⅰ型胶原半月板支架具有优良的理化学性能,无细胞毒性,有望作为半月板组织工程支架材料。     

纳米结构PCL—b—PLLA材料特性及其与犬软骨细胞的生物相容性研究

目的探讨具有纳米结构的聚己内酯／左旋聚乳酸共聚物（PCL—b—PLIJA）作为半月板组织工程支架的可行性，及其与犬软骨细胞的体外生物相容性。方法开环聚合制备PCL-b-PLLA，液-液相分离技术制备纳米结构PCL—b—PLLA支架，固-液相分离技术制备PCL—b—PLLA支架，扫描电镜（SEM）观察材料结构；测定纳米结构支架体外降解率及力学强度。分离培养犬软骨细胞，取第3代软骨细胞接种于纳米结构PCL—b—PLIA（实验组）、PCL—b—PLLA（对照组）支架材料上进行三维培养6d，SEM观察软骨细胞的形态、粘附、生长状况；细胞支架复合培养3、6、12d后，Hoechst33258荧光法检测复合物中细胞DNA含量、BCA法测定蛋白质含量。结果实验组支架材料相对分子量150kD，压缩强度为72．6KPa，孔隙率为93％。SEM示实验组支架表面为多孔状，孔壁为纤维网状连接。其降解率起初始较慢，8周后降解速率明显加快。软骨细胞在实验组支架上粘附、增殖优于对照组。随时间延长细胞在支架材料上DNA和蛋白质含量逐渐增加，实验组DNA和蛋白质含量均明显高于对照组（P〈0．01，P〈0．05）。结论具有纳米结构的PCL-b—PILA支架具有良好的生物力学性能及可降解性，可显著促进细胞粘附、增殖及合成代谢，有望成为一种较为理想的半月板组织工程支架材料。     

四肢小口径组织工程血管的实验研究

目的研究以小肠黏膜下层组织（small—calibu tissue，SIS）为血管支架，在体内血流条件下培养小口径组织工程血管的可行性。方法自犬隐动脉分离出血管种子细胞，与Ⅰ型胶原蛋白凝胶均匀混合，种植于SIS膜表面，包绕3mm聚乙烯棒制成3层管状支架，为实验组；制成单层无细胞管状支架，为对照组。两种支架作为血管移植物，分别植入15只犬两侧股动脉缺损处进行桥接吻合。术后进行彩超、组织学评价血管的形成过程。结果术后12周，14个3层血管支架保持通畅，通畅率为93．3％，有明显的血管生物结构形成。单层血管支架5个出现部分狭窄，只有3个完全通畅，通畅率为52．6％。结论SIS膜制成的3层血管支架能直接修复血管缺损，并能在体内环境中培形成生物化的小口径组织工程血管。     

小肠粘膜下层的制备及细胞相容性的实验研究

目的了解猪小肠粘膜下层(SIS)的细胞相容性,探讨用SIS为生长载体复合骨髓基质干细胞(BMSCs)构筑组织工程骨的可能性。方法用物理和化学方法处理猪小肠粘膜下层,将兔骨髓基质干细胞与SIS进行体外复合培养,分别进行组织学、相差显微镜和扫描电镜观察。结果经物理和化学处理的SIS纯度高,孔隙多,胶原纤维未受损;BMSCs在SIS材料上生长、粘附、增殖,并能长入材料的孔隙内,分泌大量的细胞外基质成分。结论SIS的细胞相容性良好,不影响BMSCs的形态,对细胞生长和功能表达无抑制作用,可以用作骨组织工程的支架材料。     

小肠黏膜下层复合上皮细胞及成肌细胞构建组织工程食管的初步研究

目的初步探索利用小肠黏膜下层(smallintestinalsubmucosa,SIS)作为支架材料,复合食管鳞状上皮细胞与成肌细胞构建组织工程食管的可行性。方法4周龄无胸腺小鼠20只,体重20.0±2.5g,雌雄不限。体外分离、培养人胚胎食管鳞状上皮细胞、成肌细胞,并行5-BrdU标记;制备SIS材料并切割成1cm×1cm大小,在SIS材料同一表面接种两种细胞,待细胞在材料表面贴附后将其植入裸鼠体内深筋膜下,于术后第3天及1、2、3周取材行组织学和抗角蛋白、平滑肌肌动蛋白(smoothmuscleactin,SMA)免疫组织化学观察,以了解食管鳞状上皮细胞、成肌细胞在SIS材料上的增殖、分化情况和复合物在裸鼠体内的血管化情况。结果人胚胎食管鳞状上皮细胞、成肌细胞能够渗透、生长于SIS材料中,并形成数层结构。植入体内第3天可见细胞增殖为多层覆盖于材料表面,并分泌大量细胞间基质。第2周时已经形成7~8层细胞,并伴有血管长入。3周时细胞增殖为十几层,大量血管长入。通过5-BrdU标记抗体染色观察,示SIS支架材料上生长的细胞多为所植入细胞。抗角蛋白,SMA免疫组织化学染色示移植细胞能够在体内分化。结论成肌细胞与鳞状上皮细胞在SIS材料上的复合培养物,在体内能继续增殖分化形成多层细胞结构,并能快速血管化,可用于组织工程化食管的构建。     

成肌细胞-PLGA支架复合物修复比格犬半月板损伤的实验研究

目的 探讨成肌细胞种植于聚乳酸聚乙酸共聚物（PLGA）支架上,软骨定向诱导后植入比格犬体内修复半月板缺损的可能性.方法 将来源于比格犬的成肌细胞培养传代至第4代,收集后以5.0×106细胞/cm3材料体积密度将细胞接种于PLGA支架中,含50 ng/ml软骨源性形态发生蛋白-2（CDMP-2）和20 ng/ml转化生长因子β1（TGF-β1）软骨诱导培养基培养14 d.然后将细胞-支架复合体植入24只比格犬半月板缺损模型中,术后4、8、12周取材,采用大体观察、组织学、生物化学和生物力学作为评估指标.结果 术后4、8、12周各项检测结果显示PLGA支架材料逐渐降解吸收,而成肌细胞可逐渐合成分泌新生胶原,并最终形成半月板样纤维组织,而对照各组缺损区则仅见少许纤维组织样的修复组织.结论 利用成肌细胞经体外扩增及细胞因子刺激后,以PLGA支架为载体,按一定的细胞密度复合培养后,植入关节腔内修复半月板局部缺损的方法,是一种较为可行的修复半月板损伤的方法.     

人舌黏膜上皮细胞体外构建组织工程尿道的初步研究

目的 探索人舌黏膜上皮细胞和脱细胞支架体外复合构建组织工程尿道的可行性.方法 前尿道狭窄患者10例,手术切取0.5 cm×0.8 cm大小舌黏膜组织,分离获得舌黏膜上皮细胞,AE1/AE3抗体行细胞免疫荧光鉴定.收集第3代上皮细胞,按1×107/ml密度分别接种于脱水BAMG支架、液体保存BAMG支架以及4层脱细胞基质(SIS)支架表面,体外培养7d后行HE及扫描电镜检测.结果 10例患者术后1个月未出现舌部相关并发症.14 d后原代舌黏膜上皮细胞融合达90％～95％并呈典型的“鹅卵石”状生长.第3代时增殖速度达顶峰,平均7d达到90％～95％融合,第4代开始细胞逐渐老化.HE及扫描电镜检测液体保存BAMG支架表面仅复合极少量细胞,脱水BAMG以及SIS支架表面可见明显多层上皮细胞覆盖,其中4层SIS支架内部可见局部细胞浸润性生长迹象 结论 人舌黏膜上皮细胞可以作为组织工程尿道上皮种子细胞来源之一,与脱水处理后的SIS和BAMG有很好的组织相容性和黏附能力,二者的有效复合可以构建适合尿道修复重建需要的组织工程替代材料.     

食管黏膜上皮细胞与SIS复合培养及生物学特性研究

目的 探讨体外快速培养犬食管黏膜上皮细胞（esophageal mucosa epithelial cells，EMECs）及其与SIS体外复合培养的方法，为组织工程食管研究提供实验依据。方法 取2～5周龄幼犬5只，无菌获取其食管组织，采用混合酶消化法，分离培养EMECs，于倒置相差显微镜下观察细胞生长情况，取第2代细胞培养1～5d绘制生长曲线并进行细胞表面标志物细胞角蛋白19（cytokeratin 19，CK-19）检测。取第2代EMECs与SIS复合培养4、8d，行形态学、组织学及扫描电镜观察。结果 倒置相差显微镜下EMSCs呈典型铺路石样。CK-19免疫组织化学染色可见细胞胞浆呈阳性染色。MTT法测定第2代细胞在传代培养2d生长达高峰。EMECs与SIS复合培养4d，细胞呈多角形，细胞间连接紧密，呈铺路石样排列；SIS表面形成1～2层细胞组成的复层上皮样结构。8d时，细胞密度增大，SIS表面形成2～3层细胞组成的复层上皮样结构；扫描电镜见细胞在材料上已大量增长，呈层状排列。结论 采用混合酶消化法，用含6％FBS的DKSFM培养犬EMECs，方法简便，适合推广应用。SIS与EMECs有良好的相容性，可作为构建组织工程食管的理想支架材料。     

一种双相半月板支架修复兔内侧半月板缺失的实验研究

目的研究脱钙骨基质/脱细胞半月板基质双相支架对兔内侧半月板缺失的修复作用的影响。方法取健康成年新西兰大白兔24只,建立兔膝关节左膝内侧半月板缺损模型,随机分为两组。A组:空白对照组,兔左膝内侧半月板切除术后旷置;B组:双相支架植入组,兔左膝内侧半月板切除术后,脱钙骨基质/脱细胞半月板基质双相支架原位植入。分别于内侧半月板切除术后3、6个月处死兔并取材对比,行HE染色、甲苯胺蓝染色、番红O染色以及天狼星红染色,并对各组半月板修复情况及其软骨保护情况进行形态学及组织学观察。结果本研究中的兔在手术后3、6个月处死后,观察其膝关节半月板及其对应股骨髁和胫骨平台软骨形态学和组织学,结果显示双相支架植入组要明显好于对照组,HE、甲苯胺蓝、番红O、天狼星红染色可见实验组新生半月板已经接近正常半月板。结论脱钙骨基质/脱细胞半月板基质双相支架对兔内侧半月板缺失后半月板的修复以及关节软骨的保护具有良好的作用,可以很好的促进半月板的再生,是一种良好的组织工程半月板的支架。     

不同比例小肠粘膜下层复合双相磷酸钙修复骨缺损的组织学研究

目的 观察小肠粘膜下层（small intestinal submucosa，SIS）和双相磷酸钙（hydroxyapatite—tricalcium phosphate，HA—TCP）以不同比例制备的复合材料修复兔股骨髁缺损的效果，探讨复合仿生骨组分的合适比例。方法 分别以SIS和HA／TCP质量比1，0．5，0．25制备复合材料。取36只新西兰大白兔，制备双侧股骨髁直径6mm、深10mm的骨缺损模型，分别采用按三种比例制备的复合材料修复缺损[SIS／HA—TCP（1）、SIS／HA—TCP（0．5）及SIS／HA—TCP（0．25）组]。术后2、4、8和12周观察三种材料修复骨缺损的大体情况，并采用组织学和图像分析技术评价材料的修复效果。结果 组织学观察SIS／HA—TCP（1）组在12周有少量新生骨形成，骨缺损未修复。SIS／HA—TCP（0．5）组在2周即出现新生骨，4周新生编织骨增多并形成骨小梁融合，8周出现大量小髓腔，12周骨缺损基本修复，并出现大量板层骨。SIS／HA—TCP（0．25）组成骨过程基本与SIS／HA—TCP（0．5）组相似。组织学评分，术后各时间点SIS／HA—TCP（1）组均低于另两组（P〈0．05），4、8周SIS／HA—TCP（0．5）组和SIS／HA—TCP（0．25）组差异无统计学意义（P〉0．05），2、12周SIS／HA—TCP（0．5）组优于另两组（P〈0．05）。在新生骨形成及HA—TCP颗粒降解方面，术后8、12周各组之间差异均有统计学意义（P〈0．05），且SIS／HA—TCP（1）组明显差于另两组，但SIS／HA—TCP（0．5）组优于SIS／HA—TCP（O．25）组。结论 SIS与HA—TCP以质量比为0．5制备的复合材料对骨缺损具有良好的修复作用；0．5的成分比可作为构建复合仿生骨支架材料的参考指标。     

骨髓间充质干细胞体外构建组织工程化半月板

目的探索以骨髓间充质干细胞（BMSCs）为种子细胞,在体外构建具有完整内侧半月板形态的软骨样组织的方法。方法运用模具制备内侧半月板形的PGA/PLA支架。抽取犬骨髓,分离培养BMSCs,将其接种于支架材料上,5 d后使用软骨诱导液培养。体外培养6周后,行大体观察、组织学检测及生物力学检测。结果细胞材料复合物能够较好地维持半月板三维立体结构,形成了表面光滑、触之有弹性的瓷白色软骨样组织。 HE染色可见典型的软骨陷窝出现,说明成熟软骨组织的形成。Safranine O染色证实有蛋白聚糖基质产生。生物力学检测显示,新生组织弹性模量达正常半月板组织的12.7%。结论 BMSCs通过体外诱导,可在体外分化为较成熟的软骨组织,并构建出组织工程化半月板。     

小肠粘膜下层表面肝素化及肝素化后其抗凝血性能的研究

目的研究等离子体引发血管组织工程支架——小肠粘膜下层(SIS)表面肝素化及肝素化后SIS膜的抗凝血性能。方法利用等离子体引发技术在SIS膜表面结合肝素,通过体外凝血时间检测及循环血流下观察肝索化SIS管腔的长期通畅性,以评价SIS膜的血液相容性。结果肝素结合到低温等离子体引发的SIS膜表面。肝素化SIS膜表面水接触角降低,亲水性增强,表面自由能增大,其凝血酶原时间、部分凝血活酶时间及凝血酶时间明显延长,肝素化SIS小口径血管支架保持通畅达6周。结论SIS膜表面通过等离子体进行肝素固化处理后具有良好而持久的抗凝血性能,表现出良好的血液相容性。     

仿生型人工小血管支架的构建与体内降解研究

目的 以复合成型工艺构建可降解仿生型人工小血管支架,观察其体内降解过程及组织反应.方法 模仿天然血管的三层结构,使用可降解的聚埘二氧环己酮(PDS)编织支架作为中间弹力层、以小肠黏膜F层(SIS)为外层、内层用共混硫酸软骨素胶原海绵涂层构建复合型人工小血管支架,将支架材料植入比格犬背部脊柱两侧肌肉内,于2、4、12、24周取材,行组织学和透视电镜观察.结果 所有实验动物术后活动正常,切口I期愈合.2～4周时,SIS与胶原结构基本保持,日J见较多的炎细胞浸润,胶原海绵网孔结构开始破坏融合,形成板层结构.12周时,自身纤维结缔组织完全取代胶原海绵材料,纤维组织广泛长人网材孔间隙内,PDS发生了部分的降解,炎细胞浸润明显消退.24周时,支架材料完全吸收,被新生纤维组织填充,炎细胞和和异物巨噬细胞少见.降解过程中未见材料周围组织变性、坏死或肉芽肿异常增生现象.结论 本实验制备的仿生型人工小血管支架组织反应轻,降解时间合适,满足体内组织再生要求,可用于下一步实验.