多重荧光PCR方法对结直肠癌进行微卫星不稳定检测及其临床价值

目的探讨多重荧光PCR方法检测结直肠癌微卫星不稳定（MSI）及其临床意义。方法将2004-2005年间进行手术治疗的110例结直肠癌患者建立队列，以多重荧光PCR方法检测结直肠癌MSI，并对MSI和微卫星稳定（MSS）结直肠癌患者的临床病理特点进行比较。结果多重荧光PCR方法扩增出所有患者的5个微卫星序列。其中MSI．H10例（8．1％），MSI-L13例（11．8％），MSS为87例（79．1％）。共检测BAT．26变异9例（8．2％）、BAT．25变异11例（10．0％）、D2S123变异11例（10．0％）、D5S346变异6例（5．5％）和D17S250变异8例（7．3％）。MSI-L、MSI．H和MSS组结直肠癌患者年龄比较，差异有统计学意义（P〈0．05）；其他临床病理特点差异无统计学意义（P〉0．05）。结论多重荧光PCR方法检测MSI结果稳定，宜于临床应用；MSI和MSS结直肠癌患者临床病理特点比较未见差异。     

微卫星高度不稳定结直肠癌的免疫治疗

微卫星高度不稳定（MSI-H）结直肠癌约占所有结直肠癌患者的10%~15%,而晚期患者中MSI-H人群仅占5%。既往研究显示,早中期MSI-H结直肠癌预后佳,但晚期患者预后差,对化疗不敏感。程序性死亡蛋白-1（PD-1）抗体的出现显著改变了该人群的预后和治疗格局,不仅在后线治疗获得良好疗效,而且在一线治疗中疗效也显著优...     

结直肠癌环氧化酶-2、错配修复酶-1微卫星不稳定与基因调控的关系

目的 检测临床手术切除42例结直肠癌及相应正常组织环氧化酶-2(COX-2)、错配修复酶-1(hMLH1)微卫星不稳定状态(MSI)及二种基因启动子甲基化,探讨它们与结直肠癌发生的关系.方法 采用聚合酶链反应(PCR)技术检测5个位点的MSI状态;甲基化特异性PCR(MSP)方法检测结直肠癌及正常组织COX-2、hMLH1二种基因启动子CpG岛甲基化状态.结果 42例结直肠癌中MSI总检出率为42.86%(18/42),5个位点的MSI检出率差异无统计学意义(P＞0.05).COX-2和hMLH1基因启动子CpG岛甲基化在42例结直肠癌中分别有13例和15例.MSI-H组中COX-2基因启动子CpG岛甲基化8例,且有6例结直肠癌同时出现hMLH1和COX-2基因启动子CpG岛甲基化.结论 MSI结直肠癌hMLH1基因启动子CpG岛甲基化率高于MSS结直肠癌,hMLH1基因启动子CpG岛甲基化有助于判断肿瘤类型.     

采用逆转录聚合酶链反应来预测溃疡性结肠炎相关性结直肠癌

非肿瘤性黏膜中的基因变异可能是预测溃疡性结肠炎相关性结直肠癌（UC-Ca）的有效标志物。Watanabe T等为建立相关基因表达与UC-Ca关系的预测模型,采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测了53例UC患者（其中10例为UC-Ca患者,43例为非UC—Ca患：苦）非肿瘤性直肠黏膜中的189个基因（其中40个基因为笔者前期芯片研究中认为对UC-Ca有预测价值的基因,另149个基因为报道的重要的癌基因）。研究结果：     

微卫星不稳定与Ⅱ期结直肠癌化疗的相关性探讨

FOLFOX方案[氟尿嘧啶（5-FU）、甲酰四氢叶酸（LV）加奥沙利铂]为目前Ⅲ期结肠癌术后标准辅助治疗方案,其中FOLFOX4方案的5年无病生存率达66.4%[1].而Ⅱ期结直肠癌术后是否需要辅助化疗,一直是争论的热点,至今仍未达成共识.研究表明,结直肠肿瘤的临床特征对Ⅱ期患者预后评估和化疗反应性预测作用是有限的[2].具有类似临床特征的患者对相同化疗方案的反应性不同,这很可能与肿瘤的遗传学和表观遗传学特征有关,同时也取决于个体的微环境.因此,理想的治疗方案应着眼于肿瘤和宿主的分子（基因组学和蛋白组学）特征,并结合患者的临床病理特点综合决定.目前,对肿瘤分子生物学认识的进展,提示肿瘤相关分子标记物可能更好的辨别能从辅助化疗中受益的高危群体.其中微卫星不稳定性（microsatellite instability,MSI）是目前的研究热点之一.     

微卫星不稳定对散发性结直肠癌患者预后的影响

目的 探讨微卫星不稳定(MSI)对散发性结直肠癌预后的影响.方法 收集2004年8月至2006年9月南京中医药大学第三附属医院手术治疗并具有完整随访资料的134例结直肠癌病例,根据MSI检测结果 将其分成MSI组和微卫星稳定(MSS)组.采用单因素和多因素预后分析来评估MSI的预后价值.结果 134例患者中MSI组26例,MSS组108例.两组患者术后复发率分别为7.7%(2/26)和35.2%(38/108),差异有统计学意义(P=0.006);两组患者5年生存率分别为92.3%和63.5%,差异亦有统计学意义(P=0.016).经多因素分析,MSI为结直肠癌患者的独立预后因素(P=0.029).结论 微卫星不稳定是影响散发性结直肠癌患者预后的重要因素.

Abstract：

Objective To investigate the role of microsatellite instability (MSI) in Chinese sporadic coloretal cancer. Methods A total of 146 patients with colorectal cancer were treated surgically from August 2004 to September 2006 in the Third Affiliated Hospital of Nanjing University of Traditional Chinese Medicine. Data were collected prospectively. Univariate and multivariable analyses were performed for parameters such as age, gender, tumor location, differentiation, MSI, tumor type, lymph node metastasis,TNM stage, and survival. Results Follow-up was available in 134 patients including telephone call and office visit. MSI(P=0.029), tumor type (P=0.000), TNM stage (P=0.000) were independently associated with survival on Cox regression model. There were 26 patients with MSI, and the 1-, 3-, and 5-year survival rates were 100% , 92.3% , and 92.3% , respectively. The remaining 108 patients had microsatellite stable tumor, and the 1-, 3-, and 5year survival rates were 96.3% , 72.2% , and 63.5% , respectively. The difference was statistically significant(P=0.016). Conclusion Microsatellite instability is an important factor associated with patient survival in Chinese sporadic colorectal cancer.     

微卫星标志BAT-26、BAT-25在遗传性非息肉病性结直肠癌中的变异特征及临床意义

目的　探讨微卫星标志BAT 2 5、BAT 2 6在遗传性非息肉病性结直肠癌 (HNPCC)患者中变异特征及其在HNPCC家系筛选中的价值。方法　对典型和非典型HNPCC患者各 12例进行BAT 2 5、BAT 2 6聚合酶链反应 (PCR)结合单链多态性分析 (PCR SSCP) ,并与 16例散发性大肠癌进行对照。结果　 12例典型HNPCC患者中BAT 2 6阳性 11例、BAT 2 5阳性 7例 ;12例非典型HNPCC患者中BAT 2 6阳性 7例、BAT 2 5阳性 4例 ;16例散发性结直肠癌中BAT 2 6阳性 1例、BAT 2 5阳性 3例 ,3组之间差异有显著性 (P <0 .0 5 ) ;BAT 2 6筛选HNPCC家系的敏感性为 0 .92、特异性为 0 .94;BAT 2 5检测的敏感性为 0 .5 8、特异性为 0 .81。结论　BAT 2 6和BAT 2 5在HN PCC患者变异率明显高于散发性结直肠癌 ,利用BAT 2 6和BAT 2 5对大肠癌筛选 ,敏感性和特异性较高 ,成本低 ,适合于在临床广泛应用     

抑癌基因甲基化检测结直肠癌患者的研究

目的 应用甲基化特异的聚合酶链反应(PCR)法(MSP)法分析抑癌基因高甲基化对诊疗结直肠癌的应用价值。方法 应用MPS法检测20例结直肠癌患者血清、术中癌旁组织及癌组织中的抑癌基因hLMH1、p15、p16甲基化的发生率。结果 20例结直肠癌患者术前血清及术中癌组织的hLMH1、p15、p16甲基化发生率为61％—97％；癌旁组织略低；术后1周血清中hLMH1、p15、p16与术前比较明显下降(P＜0．01)，而正常对照组抑癌基因甲基化发生率均为0。结论 MSP法的建立，直接检测结直肠癌患者的抑癌基因的高甲基化状态，有助于临床判断和动态观察治疗效果。     

基于机器学习的结直肠癌微卫星不稳定基因挖掘及其应用价值分析

背景与目的 结直肠癌（CRC）是全球第三大最常诊断的恶性肿瘤和第二大癌症死亡原因。最新指南推荐所有的CRC患者需要进行微卫星不稳定（MSI）的检测。MSI患者往往具有错配修复蛋白缺失（dMMR）。MSI/dMMR状态已被用作生物标志物预测对免疫治疗的有利反应和预后。然而MSI特征基因及其与肿瘤浸润的免疫细胞的关系未进行阐述。因此本研究通过使用机器学习的方式发掘CRC中新型的MSI特征基因,并且验证其的诊断价值及其与免疫细胞浸润的关系。方法 按照纳入排除标准,将GEO数据库中GSE39582数据集作为训练集,将TCGA数据库中COAD数据集作为外部验证集。使用机器学习的方法（LASSO回归、SVM-RFE算法）,在GSE39582结直肠癌数据集中筛选MSI特征基因,并在TCGA结直肠癌数据中进行验证。采用受试者工作特征（ROC）曲线和曲线下面积（AUC）评价基因对MSI的诊断效能。CIBERSORT算法评估肿瘤样本浸润的免疫细胞成分,Spearman相关性分析验证MSI特征基因和免疫细胞的关系。结果 训练集共纳入536例CRC患者,其中高频MSI（MSI-H）77例（14.37%）。在验证集中,共计389例CRC患者,其中MSI-H 67例（17.22%）。基线资料分析显示,MSI-H/dMMR CRC的TNM分期存活率优于低频MSI（MSI-L）或微卫星稳定（MSS）/错配蛋白完整（pMMR）CRC（P<0.05）。在GSE39582数据集中,LASSO回归筛选MSI特征基因21个,SVM-RFE算法筛选基因6个,结合两种算法确定MSI特征基因为EIF5A、CXCL13、HNRNPL、HOXC6、RPL22L1、Y16709。在TCGA数据库中进一步验证MSI特征基因的诊断效能,研究发现EIF5A的诊断效能最高。在训练集和验证集中,EIF5A的AUC值分别为0.922和0.805。同时,Spearman相关性分析发现,EIF5A主要与CD8⁺T细胞,活化的树突状细胞,辅助性T细胞,M1型巨噬细胞,γδT细胞,中性粒细胞成正相关;与CD4⁺记忆性T细胞,M2型巨噬细胞,静止树突状细胞,嗜酸性粒细胞,调节性T细胞呈负相关。结论 CRC的新型MSI特征基因分析结果表明,EIF5A对CRC MSI的诊断具有较好的诊断作用和临床价值,同时提示EIF5A与免疫细胞及免疫微环境相关。因此,EIF5A可能成为免疫检查点治疗的新型标志物。     

改良聚合酶链反应法快速诊断常染色体显性遗传型多囊肾病

目的：检测微小卫星体ＳＭ７快速诊断常染色体显性遗传型多囊肾病（ＡＤＰＫＤ）。方法应用改良二温式聚合酶链反应（ＰＣＲ）法扩增与ＰＫＤ１位点紧密连锁的微小卫星体ＳＭ７,并对１０个家系进行基因连锁分析。结果在１０个家系１０３个家庭成员中,２９例先证者,９例无症状者通过基因连锁分析得到确诊,结论改良二温式ＰＣＲ法检测微小卫星体ＳＭ７可早期快速诊断ＡＤＰＫＤ。     

A prospective analysis of microsatellite instability as a molecular marker in colorectal cancer

BACKGROUND: Microsatellite instability (MSI) may be a molecular marker of colorectal tumor biology. We sought to evaluate the incidence and significance of MSI in an unselected colorectal cancer population. METHODS: Colorectal cancer cases from a community health system were prospectively evaluated for MSI and patient outcomes monitored. RESULTS: Of 240 eligible, 140 underwent testing; 43 (31%) had high-frequency MSI (MSI-H). Those with MSI-H tumors presented with earlier disease stage (P = .014) and lymphocytic infiltration (P < .001). Stage III MSI-H patients trended toward improved disease-free survival (P = .065). MSI-H patients were more likely to have other primary malignancies. CONCLUSIONS: Prevalence of MSI-H in the general colorectal cancer population is higher than previously reported. MSI testing of colorectal cancers is useful as part of a molecular profile to stratify patients for prognosis, treatment, and further study. Patients with MSI-H tumors are more likely to have other primary malignancies, suggesting a role for heightened screening.     

散发性大肠癌微卫星不稳定及hMSH2基因突变研究

目的了解散发性大肠癌微卫星不稳定及其hMSH2基因突变情况。方法用6个微卫星位点标记，PCR法检测微卫星不稳定性（microsatelliteinstabilty，MI），银集PCR－SSCP法检测hMSH2基因5、7、8、12、13、15外显子突变。结果60例大肠癌中，微卫星改变总的发生率为50％（30／60）；20例（3333％）表现微卫星不稳定性，其中4例同时有杂合性缺失（lossofheterozygosityLOH），DNA复制错误（RER）阳性11例（1833％）；14例（233％）检测到LOH。8例微卫星不稳定性大肠癌组织检测到第5外显子杂合性突变，而未发现胚系突变。结论散发性大肠癌中微卫星不稳定是一个常见的分子事件，与hMSH2基因胚系突变无关，可能为体细胞性突变或／和缺失所致。     

微卫星不稳定性和肝细胞生长因子对结直肠癌患者生存状况的影响

目的探讨微卫星不稳定性(MSI)和肝细胞生长因子(HGF)对结直肠癌患者生存状况的影响。方法选取2012年1月至2014年5月收治的82例结直肠癌患者为研究对象。采用免疫组织化学法检测MSI及HGF表达情况。所有资料采用SPSS 20.0进行分析处理,计量资料采用均数±标准差表示并行t检验,MSI及HGF表达阳性率采用χ2检验,多因素分析采用Cox回归分析,生存分析采用Kaplan-Meier法,MSI与HGF表达的关系采用spearman相关性分析。P0.05作为差异有统计学意义。结果 MSI阳性患者32例,占39.0%;HGF表达阳性58例,占70.7%。MSI与分化程度相关(P0.05),与年龄、性别、肿瘤部位、肿瘤大小、组织学类型、大体类型、淋巴转移无关(P0.05)。HGF表达与上述指标均无关(P0.05)。MSI与HGF表达之间具有明显负相关性(r=-0.6531,P=0.032)。年龄、淋巴转移、MSI和HGF表达阳性是结直肠癌患者总生存期的独立影响因素(P0.05)。结论HGF在结直肠癌中表达较MSI更明显,MSI和HGF表达水平与结直肠癌患者生存期相关。     

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目的 探讨大肠癌区淋巴结微转移的检测和临床意义。方法 采用逆转录聚合酶链反应（ＲＴＰＣＲ）技术,扩增角蛋白１９（Ｋ１９）,１２例病人大肠癌肿瘤组织和９５个区域淋巴结进行检测。结果 １２例病人大肠癌组织均有Ｋ１９ｍＲＮＡ表达,良性病人的２１个淋巴结均无表达。大肠癌区域淋巴结１１个经病理检查有转移,其Ｋ１９ｍＲＮＡ表达阳性。８４个病理检查未发现转移的淋巴结中有８个Ｋ１９ｍＲＮＡ表达阳性。结论 Ｋ１９ｍ     

大肠重复癌MMR、p53、Bax、PCNA表达及微卫星不稳定性研究

目的探讨微卫星不稳定性 (MSI)在大肠重复癌与单发癌中的变化规律 ,及MMR、p5 3、Bax、PCNA表达与MSI的关系。 方法采用免疫组化、PCR SSLP法对 38例大肠重复癌患者的 5 1处癌灶及 35例单发大肠癌分别进行MMR、p5 3、Bax、PCNA表达的检测和 5个微卫星位点MSI检测。结果重复癌组复制错误阳性率为 5 3% (2 7/ 5 1) ,单发癌组为 17% (6 / 35 ) ,差异有显著性意义 (χ2 =11 2 5 ,P <0 0 1)。重复癌组中 ,RER 与MMR表达缺失有密切的相关性 ;RER 与 p5 3表达呈负相关 ;RER 组PCNA标记指数显著低于RER-组 ;RER 与低分化、近端大肠癌密切相关。结论MSI在大肠重复癌的发生上起着重要作用 ,MSI可作为预测大肠重复癌发生的重要标志。     

人大肠肿瘤CD44基因mRNA的表达

目的检测大肠息肉、癌及相应正常大肠粘膜组织ＣＤ４４基因ｍＲＮＡ表达,探讨该基因表达在大肠肿瘤进展转移中的意义以及癌组织上皮源性亚型与造血源性亚型比值（Ｅ／Ｈ）的临床意义。方法应用逆转录、多聚合酶链反应和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交技术,检测２６例大肠癌患者癌组织、正常大肠粘膜组织和７例大肠息肉ＣＤ４４基因ｍＲＮＡ表达。结果息肉、癌、转移淋巴结中上皮源性亚型及含Ｖ６、Ｖ１０外显子的变异型均明显表达,而正常粘膜组织中表达不明显。Ｄｕｋｅｓ分期Ａ、Ｂ期癌Ｅ／Ｈ为１４±１０,Ｃ、Ｄ期癌Ｅ／Ｈ为１４±０９;癌浸润肌层者Ｅ／Ｈ为１６±１０,浸润全层者Ｅ／Ｈ为１３±０９;有肝或淋巴结转移者Ｅ／Ｈ为１４±１０,无转移者为１４±１０,未发现Ｅ／Ｈ与肿瘤分期、有无转移、浸润深度有关（ｔ检验,Ｐ＞００５）。结论ＣＤ４４ｍＲＮＡ包括含有Ｖ６、Ｖ１０外显子的变异型在大肠肿瘤发生发展的早期已有表达,变异型的表达在大肠肿瘤发生发展中具有重要意义。Ｅ／Ｈ值的临床价值需进一步探讨。