人VEGF165基因在狗骨髓基质细胞中的表达

目的 :检测转染 pcDNA3 hVEGF165狗骨髓基质细胞的VEGF165mRNA表达。方法 :用脂质体介导转染狗骨髓基质细胞 ,用免疫组化及RT PCR检测VEGFmRNA的表达。结果 :重组质粒 pcDNA3 hVEGF165转染骨髓基质细胞后 ,免疫组化及RT PCR检测有VEGFmRNA的表达。结论 :采用脂质体介导的方法可将hVEGF165基因转染至狗骨髓基质细胞并表达外源性基因     

慢病毒介导NgR基因转染骨髓基质细胞的研究

目的 构建编码大鼠NgR(Nogo receptor)细胞外功能区的慢病毒载体,转染大鼠骨髓基质细胞(BMSCs),使其能高表达NgR的细胞外功能区.方法 体外分离培养大鼠BMSCs、293FT包装制备病毒,用包装好的慢病毒颗粒感染BMSCs,间接免疫荧光及Western blot方法检测BMSCs表达NgR的情况.结果 筛选阳性重组载体plenti6-NgR,酶切后得到930 bp的条带,与设计的NgR基因片段大小一致,表明载体构建成功.转染BMSCs 48 h后,间接免疫荧光法可见胞质内明显荧光表达,Western blot得到相对分子质量为37×103的条带,与NgR蛋白相对分子质量一致.结论 ViraPowerTM慢病毒表达系统可将NgR(310)ecto基因转染入骨髓基质细胞表达,后者可以作为种子细胞拮抗脊髓损伤局部形成的抑制性微环境.     

VEGF转染对骨髓基质细胞成骨功能的影响

[目的]将血管内皮生长因子121(vascular endothelial growth factor 121,VEGF121)基因转染兔骨髓基质细胞(rabbit bone marrow stroma cells,rMSCs)后,研究转染后细胞的成骨功能变化,为进一步利用经基因转染的rMSCs构建组织工程骨血管化打下基础.[方法]体外培养、扩增rMSCs,将其分为转染组和未转染组,脂质体介导下PCDI- VEGF121真核表达质粒转染rMSCs后,G- 418筛选阳性细胞克隆.通过RT - PCR法检测VEGF mRNA水平,通过碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、Ⅰ型胶原检测来评价两组细胞的成骨能力.将阳性克隆细胞和未转染的细胞植入裸鼠股部肌袋内.分别于植入后4、8周处死动物,观察异位成骨情况.[结果]转染组和未转染组的ALP表达随着时间逐渐增强,转染组细胞内ALP水平显著增高,Ⅰ型胶原在转染组细胞内高表达,转染组的rMSCs植入肌袋后,随着植入时间的延长,出现骨髓腔样结构及大量骨小梁,表现出较好的异位成骨能力.[结论]应用VEGF121基因转染rMSCs后,有利于发挥VEGF121的血管化作用,促进rMSCs的成骨能力,将会成为组织工程骨血管化探索的方向.     

骨形成蛋白-2和转化生长因子-β1双基因在骨髓基质细胞中的共表达

目的 观察骨形成蛋白(BMP)-2、转化生长因子(TGF)-β1双基因真核表达载体在骨髓基质细胞中的共表达.方法 以pGEM-T-BMP-2及pGEM-T-TGF-β1为模板,分别用引入新的酶切位点的引物,聚合酶链反应(PCR)扩增出1188 bp长度的BMP-2和1173 bp长度的TGF-β1两个目的 基因片段;依次将其定向克隆入真核双基因表达载体pIRES;酶切、分析及序列测定重组子:然后,用脂质体包裹转染骨髓基质细胞;荧光定量逆转录(RT)-PCR方法 检测BMP-2及TGF-β1基因的共表达情况.结果 双酶切可见1188 bp的BMP-2条带及核酸序列测定证实重组质粒pIRES-BMP-2-TGF-131构建正确,并在骨髓基质细胞中能同时高效表达BMP-2和TGF-β1 mRNA.结论 BMP-2和TGF-β1双基因真核载体能够在骨髓基质细胞中实现BMP-2和TGF-β1基因共表达.     

转染重组人骨形态发生蛋白-7基因对骨髓基质细胞生物学行为的影响

目的 观察重组人骨形态发生蛋白-7(rhBMP-7)基因转染骨髓基质细胞(BMSCs)后的稳定表达及表达产物对BMSCs生物学行为的影响。方法利用脂质体介导法将rhBMP．7基因转染BMSCs，以G418筛选出阳性克隆并扩大培养，用免疫组织化学链霉抗生物素蛋白-生物素-过氧化物酶复合物(SABC)法检测转基因细胞的稳定表达；转染48h后，用转基因细胞的培养液上清刺激正常培养的BMSCs，利用^3H标记的胞腺嘧啶氧核苷(^3H-TdR)掺入法、Na2^35SO4掺入法以及氯胺T法检测基因表达产物对BMSCs增殖、合成蛋白多糖以及胶原的影响。结果 转基因细胞4周时仍能表达外源性基因；基因表达产物能明显促进BMSCs的增殖以及蛋白多糖和胶原的合成。结论 rhBMP-7基因转染BMSCs后可获得稳定表达，且基因表达产物能促进BMSCs增殖。诱导其向软骨细胞分化并增强其生物学活性。     

转化生长因子-β1基因转染骨髓基质细胞的瞬时表达与稳定表达

目的 探讨转化生长因子-β1（TGF-β1）基因转染骨髓基质细胞（BMSCs）的表达能力。方法 取6周龄新西兰白兔BMSCs,传代培养后以3μl阳离子脂质体（Lipofectamine):1μg pcD-NA3J-TGF-β1的比例转染,通过免疫组织化学染色及图像分析对3组15份样本检测TGF-β1表达水平;利用水貂肺上皮细胞生长抑制法检测TGF-β1生物活性,分析转染的量效关系和时效关系。结果 瞬时表达组转染后48h免疫组织化学染色部分细胞呈强阳性,稳定表达组全部细胞呈强阳性表达持续4周以上。图像分析显示转染细胞TGF-β1表达显著增强,与对照组比较差异有非常显著性（P＜0．01）。量效关系显示,在转染体系中pcDNA3-TGF--β1(μg）：阳离子脂质体（μl）为1：3时,TGF-β1表达效率最高;时效关系显示,稳定表达组TGF-β1表达活性较瞬时表达组更强。结论 TGF-β1基因转染可使BMSCs有效地表达活性TGF-β1而产生生物效应。     

骨髓基质细胞基因表达的研究进展

目的介绍骨髓基质细胞(marrow stromal cells，MSCs)基因表达与其生物学特性、诱导分化、基因治疗、造血调控和创伤修复中的炎症反应等方面的研究进展。方法查阅国内外近年有关文献，并做综合分析。结果MSCs不仅能在不同的条件下表达中胚层、内胚层和外胚层的特异性基因，而且能稳定地表达转导的外源基因，并且对造血系统有支持作用，也参加创伤修复过程中的炎症反应。结论MSCs是一种具有自我更新和多向分化潜能的干细胞，且体外易于扩增，是一种理想的细胞治疗和基因治疗的靶细胞。     

人胰岛素样生长因子Ⅰ基因转染骨髓基质细胞的实验研究

目的检测人胰岛样生长因子Ⅰ基因转染骨髓基质细胞的效果及目的基因的表达情况，寻找一种改良组织工程种子细胞的新方法。方法抽取成年雄性山羊髂嵴骨髓，贴壁分离法接种培养骨髓基质细胞，检测细胞生长特性。取第2代细胞，按3：1比例用FuGene6转染试剂介导，将重组真核表达质粒pIRES2-EGFP-hIGF-Ⅰ(EGFP为增强绿色荧光蛋白，hIGF-Ⅰ为人胰岛素样生长因子Ⅰ)转染骨髓基质细胞，转染后4～72h和传代后分别用倒置荧光显微镜观察标志基因增强绿荧光蛋白的表达情况，计算转染效率。酶联免疫吸附试验检测培养上清液中hIGF-Ⅰ的浓度变化。转染细胞爬片行hIGF—Ⅰ免疫组化染色检测hIGF-Ⅰ的表达。提取转染后48h的细胞总RNA，RT-PCR检测hIGF-Ⅰ和内核糖体进入位点(IRES)的表达。收集转染前及转染后48h的细胞行流式细胞仪检测细胞周期分布及荧光表达情况。结果成年山羊骨髓基质细胞在接种后24h开始贴壁，伸展成长梭形，原代细胞呈集簇状分布。在转染后4h即有细胞表达绿色荧光蛋白，荧光强度和表达细胞总数在48h达高峰，72h时见部分细胞荧光强度下降，传代后仍可观察到EGFP的表达。转染后4～72h转染上清液中分泌hIGF-Ⅰ的浓度呈逐渐上升趋势，在72h最高可达34．75ng／ml。转染后部分细胞形态发生变化。hIGF-Ⅰ免疫组化染色证实在胞浆中有大量棕黄色颗粒。RT-PCR证实有与hIGF-Ⅰ cDNA和IRES大小相符条带出现。流式细胞仪检测表明转染后骨髓基质细胞S期比例增加，荧光检测转染效率约22％。结论使用FuGene 6转染试剂可有效地转染体外培养的成年山羊骨髓基质细胞。在较长时间内有较高浓度的hIGF-Ⅰ蛋白质分泌人培养上清。hIGF-Ⅰ基因转染可促进骨髓基质细胞的增殖、分化。     

骨髓基质细胞成骨作用研究进展

18 67年 ,德国病理学家Ｃｏｈｎｈｅｉｍ在研究伤口愈合过程时 ,提出骨髓中有骨髓基质细胞 (ＭａｒｒｏｗＳｔｏｍａｌＣｅｌｌ,ＭＳＣ)存在的观点。 1974年Ｆｒｉｅｄｅｎｓｔｅｉｎ等[1] 发现 ,骨髓标本中小部分贴附细胞在培养过程中能够分化形成类似骨或软骨的集落。 1988年Ｍａｍｉａｔｏｐｏｕｌｏｓ等[2 ] 首次报道鼠骨髓基质细胞在体外培养能形成钙化的骨样组织 ,经Ｘ线衍射分析确定形成的钙化物具有羟基磷灰石结构 ,证明体外培养骨髓基质具有成骨能力。Ｂｅｎａｋｙａｈｕ等[3 ] 将骨髓基质细胞体外培养获得具有典型的成骨细胞 (Ｏ…     

兔骨髓基质细胞的分离培养

目的 为骨组织工程寻找一种理想的种子细胞。方法 采取兔骨髓组织，应用梯度离心获取骨髓基质细胞，体外培养传代，通过光镜、透射电镜及成骨特性的鉴定，观察细胞的形态、生长特点及成骨特性。结果 培养的骨髓基质细胞形态多为三角形或梭形，生长增殖迅速，具有成骨能力，易于定向分化为成骨细胞。结论 自骨髓获得的骨髓基质细胞具有明显的增殖能力和成骨活性，可以做为骨组织工程中比较理想的种子细胞。     

体外诱导小鼠骨髓基质干细胞向成骨细胞分化相关基因表达的研究

目的体外培养小鼠骨髓基质干细胞(BMSCs)诱导分化为成骨细胞,定量分析其骨生成关键标志基因的表达水平。方法体外培养小鼠BMSCs 7、14、21 d,提取细胞总RNA,采用实时荧光定量RT-PCR方法检测Ⅰ型胶原、碱性磷酸酶(ALP)、骨桥蛋白(OPIN)和骨唾液酸蛋白(BSP)基因的表达水平。结果小鼠BMSCs体外稳定增殖和分化,Ⅰ型胶原培养14 d和21 d mRNA水平分别是培养7 d时的0．75±0．04倍和(0．34±0．03)倍;ALP、OPN和BSP基因表达水平随着培养时间延长而上升,其中培养21 d时的ALP、OPN和BSP mRNA水平分别是培养7 d时的(19．70±2．36)倍、(150．12±9．31)倍和(7．73±0．58)倍。结论荧光定量RT-PCR可以灵敏地检测成骨细胞关键标志基因表达水平,随着培养时间延长,Ⅰ型胶原的表达水平逐渐下降,而ALP、OPN和BSP的表达水平显著上升。     

髓内脂肪细胞对骨髓基质细胞成骨能力的影响

目的探讨在骨髓腔中,来源于骨髓基质细胞的脂肪细胞对骨髓基质细胞成骨能力的影响。方法将骨髓基质细胞以1×106个/ml浓度接种于24孔培养板中,共分为5组,分别加入0、103、104、105、106/ml浓度的脂肪细胞悬液,建立脂肪细胞和骨髓基质细胞共培养体系。共培养12d,每4d取细胞样本,检测细胞内碱性磷酸酶活性,利用原位杂交方法检测I型胶原mRNA表达,3H脯氨酸掺入实验检测骨髓基质细胞胶原合成能力。结果经过12d培养,不同时段的共培养体系中,随着脂肪细胞浓度上升,骨髓基质细胞内碱性磷酸酶相对活性下降,各实验组明显低于对照组(P<0.05或P<0.01);I型胶原mRNA表达减弱,对照组染色最深,实验组着色较淡;各实验组3H脯氨酸掺入实验min-1值均低于同期对照组(P<0.05或P<0.01)。结论髓内脂肪细胞干扰了骨髓基质细胞的成骨能力,可能与原发性骨质疏松症的发病有关。     

髓内脂肪细胞促骨髓基质细胞凋亡的实验研究

目的观察髓内脂肪细胞对骨髓基质细胞凋亡的影响,拟阐明骨质疏松的可能发病机制.方法建立脂肪细胞与骨髓基质细胞的共培养体系,用TUNEL法与流式细胞仪检测凋亡.结果在各实验组中均可见到凋亡细胞,且随着脂肪细胞浓度增加,凋亡细胞数目增多.流式细胞仪上表现为Annexin V^＋和PI^-.结论髓内脂肪细胞能够诱导骨髓基质细胞凋亡.     

骨髓基质细胞转化为神经细胞的研究

目的 探讨骨髓基质细胞体外转化为神经细胞的可能性。方法 骨髓基质细胞原代培养、传代后使用3种不同方法诱导。行大体观察，免疫组织化学，及细胞电生理检查和长期培养研究。结果 骨髓基质细胞体外可诱导为突触明确的神经细胞。诱导率分别为80％、10％和40％；诱导后细胞表面有神经特异性抗原NSE、GFAP表达；同时具有早期神经细胞电流特性。结论 骨髓基质细胞可横向转化为早期神经细胞。     

靶向性非病毒载体K16GRGDSPC寡肽的合成及转染骨髓基质干细胞的研究

目的设计合成新型靶向性非病毒载体K16GRGDSPC寡肽,探讨其作为载体介导外源基因转染骨髓基质干细胞(BMSCs)的可行性。方法用固相合成法合成K16GRGDSPC并用质谱仪和高压液相色谱仪进行检测。以其作为载体转染增强型绿色荧光蛋白质粒pcDNA3-EGFP并计数转染效率；转染转化生长因子(TGF)-β1质粒pcDNA3-TGF-β1并通过逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和TGF-β1敏感细胞株水貂肺上皮细胞(MV1)生长抑制法检测目的基因TGF-β1稳定表达情况及表达产物的生物学活性。结果质谱图显示合成肽的平均分子量为2741．3307 m/z,与理论上计算的平均分子量一致。高压液相色谱仪示合成肽的纯度为94%～95%,满足试验需求。以K16GRGDSPC寡肽为载体转染BMSCs的效率为(18．6±2．1)%,与脂质体(Lipofectamine)介导转染的效率(19．3±2．3)%差异无统计学意义(P＞0．05)；转染TGF-β1基因阳性细胞克隆经RT- PCR扩增有特异性产物,TGF-β1敏感细胞株MV1的增殖受到明显抑制,与对照组比较差异有统计学意义(P＜0．05)。结论所合成的肽是设计的K16GRGDSPC寡肽,以其为载体介导外源基因转染BMSCS是确实可行的,为下一步构建载基因仿生基质材料奠定了基础。     

自体骨髓基质干细胞在齿槽裂骨缺损修复中的应用

目的探讨人自体骨髓基质干细胞（human bone marrow stromal cells，hBMSCs）在治疗齿槽裂骨缺损中的可行性。方法2002至2005年，选择齿槽裂骨缺损患者7例（单侧6例，双侧1例），以患者自体骨髓基质干细胞为种子细胞，部分脱钙骨（partly demineralized bone matrix，pDBM）为支架材料构建组织工程骨，治疗齿槽裂骨缺损。从患者髂前上棘穿刺取骨髓，密度梯度离心法分离hBMSCs，经体外成骨诱导和扩增至第3代。将诱导的hBMSCs，复合部分脱钙骨体外培养1周后，手术回植骨缺损区。分别于术后1、3、6、12、24、36个月进行临床外形和三维CT检查随访。结果6例患者头部三维CT检查，结果示术后3个月能形成组织工程化骨，并修复骨组织缺损。术后1～3年的随访表明组织工程骨稳定存在，无明显骨吸收现象，临床治疗效果稳定。1例患者（双侧齿槽裂）植入物外露感染。结论以自体hBMSCs为种子细胞，部分脱钙骨为支架材料，利用组织工程技术可在人体内形成稳定的组织工程化骨组织，并临床修复齿槽裂骨缺损。     

骨质疏松大鼠骨髓基质细胞膜片的体外构建研究

目的探讨骨质疏松大鼠骨髓基质细胞膜片的构建及基本生物学特性。方法建立大鼠绝经后骨质疏松症(PMOP)模型,分离培养骨质疏松大鼠骨髓基质细胞(O-r BMSCs),并以O-rBMSCs为种子细胞构建细胞膜片。通过倒置显微镜、HE染色、扫描电镜及透射电镜对细胞膜片进行形态学检测;以免疫组织化学染色检测细胞外基质相关蛋白的表达情况。结果成功建立了大鼠PMOP模型,体外分离培养的O-rBMSCs具有多向分化潜能。显微镜下可见细胞复层生长,采用富含维生素C的培养基连续培养10 d左右即可获得白色膜样结构,该细胞膜片具有较好的弹性,HE染色及扫描电镜观察发现O-rBMSCs膜片由多层细胞及丰富的细胞外基质组成。透射电镜下可观察到细胞间连接。免疫组织化学染色示O-rBMSCs膜片高表达Ⅰ型胶原、纤维连接蛋白。结论 O-rBMSCs体外采用富含维生素C的培养基连续培养可构建细胞膜片,该细胞膜片富含细胞外基质,有望应用于骨质疏松机体的组织再生。     

Adenovirus vector-mediated ex vivo gene transfer of brain-derived neurotrophic factor to bone marrow stromal cells promotes axonal regeneration after transplantation in completely transected adult rat spinal cord

The aim of this study was to evaluate the efficacy in adult rat completely transected spinal cord of adenovirus vector-mediated brain-derived neurotrophic factor (BDNF) ex vivo gene transfer to bone marrow stromal cells (BMSC). BMSC were infected with adenovirus vectors carrying β-galactosidase (AxCALacZ) or BDNF (AxCABDNF) genes. The T8 segment of spinal cord was removed and replaced by graft containing Matrigel alone (MG group) or Matrigel and BMSC infected by AxCALacZ (BMSC-LacZ group) or AxCABDNF (BMSC-BDNF group). Axons in the graft were evaluated by immunohistochemistry and functional recovery was assessed with BBB locomotor scale. In the BMSC-BDNF group, the number of fibers positive for growth associated protein-43, tyrosine hydroxylase, and calcitonin gene-related peptide was significantly larger than numbers found for the MG and BMSC-LacZ groups. Rats from BMSC-BDNF and BMSC-LacZ groups showed significant recovery of hind limb function compared with MG rats; however, there was no significant difference between groups in degree of functional recovery. These findings demonstrate that adenovirus vector-mediated ex vivo gene transfer of BDNF enhances the capacity of BMSC to promote axonal regeneration in this completely transected spinal cord model; however, BDNF failed to enhance hind limb functional recovery. Further investigation is needed to establish an optimal combination of cell therapy and neurotrophin gene transfer for cases of spinal cord injury.     

体外诱导猕猴骨髓基质干细胞向雪旺细胞分化

目的探讨体外诱导猕猴骨髓基质干细胞向雪旺细胞分化的实验方法。方法采用BME、b-FGF、ATRA、BDNF、heregulin、Forskolin、PDGF依次联合诱导,倒置相差显微镜观察细胞形态学变化,免疫细胞化学鉴定S-100蛋白、GFAP和P75受体的表达率。结果诱导后的猕猴骨髓基质干细胞具有类似雪旺细胞的形态,免疫细胞化学结果显示S-100蛋白、GFAP和P75受体的表达率分别为(66.8±4.6)%、(57.3±5.4)%和(72.4±5.9)%。结论采用BME、ATRA、BDNF、heregulin、Forskolin、b-FGF、PDGF依次联合诱导,可使猕猴骨髓基质干细胞在体外向雪旺样细胞分化。     

大鼠骨髓基质干细胞体外诱导分化为类许旺细胞

目的 研究大鼠骨髓基质干细胞在体外分化为类许旺细胞的方法。方法 采用β—巯基乙醇、全反式视黄酸、Forskolin、碱性成纤维细胞生长因子等依次按顺序诱导。神经胶质纤维酸性蛋白、S—100免疫细胞化学染色鉴定、计数诱导前后不同时间的细胞阳性表达率。结果 诱导后骨髓基质干细胞形态改变，胞体呈椭圆形，有2—3个纤细的细胞突起，成纵形栅栏状排列，免疫细胞化学染色神经胶质纤维酸性蛋白表达率为42．5％-68.7％、S—100表达率为39．6％-60.2％。结论 采用β—巯基乙醇、全反式视黄酸、Forskolin、碱性成纤维细胞生长因子、血小板源生长因子、HRG可以诱导大鼠骨髓基质干细胞在体外分化为类许旺细胞。