miR-181b在动脉粥样硬化血管中的表达及对H2O2诱导的血管内皮细胞增殖与凋亡的影响

目的 探讨miR-181b在动脉粥样硬化血管中的表达及miR-181b对H2O2诱导的血管内皮细胞增殖与凋亡的影响.方法 qPCR法检测动脉粥样硬化模型组小鼠主动脉和H2O2诱导的血管内皮细胞中miR-181b的表达情况;酶联免疫法检测miR-181b对鼠血清中TNF-α、IL-6和IL-10含量的影响;克隆形成实验检测miR-181b对H2O2诱导的血管内皮细胞增殖能力的影响;流式细胞术检测miR-181b对H2O2诱导的血管内皮细胞凋亡能力的影响;qPCR和Western blot法检测miR-181b对主动脉和H2o2诱导的血管内皮细胞中Caspase-3、Bax和Bcl-2 mRNA和蛋白表达的影响.结果 miR-181b在动脉粥样硬化模型组小鼠主动脉和H2O2诱导的血管内皮细胞表达水平显著下调,血清中TNF-α、IL-6含量均增加,IL-10含量减少;过表达miR-181b使小鼠血清中TNF-α、IL-6含量均减少(P＜0.05),IL-10含量增加(P＜0.05).与对照组比较,H2O2诱导的血管内皮细胞的增殖能力显著下降,凋亡能力显著提高,miR-181b过表达使血管内皮细胞增殖能力提高,凋亡能力下降;与对照组比较,动脉粥样硬化模型组小鼠主动脉和H2O2诱导的血管内皮细胞中Caspase-3、Bax的mRNA和蛋白表达水平均上调,Bcl-2 mRNA和蛋白表达水平下调,miR-181b过表达使动脉粥样硬化模型组小鼠主动脉和H2O2诱导的血管内皮细胞中Caspase-3、Bax的mRNA和蛋白表达水平均下调,Bcl-2 mRNA和蛋白表达上调(P＜0.05).结论 miR-181b在动脉粥样硬化血管和H2O2诱导的血管内皮细胞中低表达,过表达miR-181b抑制细胞凋亡及促进细胞的增殖,可能在动脉粥样硬化的治疗中起到积极作用.     

血管内皮细胞和动脉粥样硬化

作 为心脑血管病的病理基础动脉粥样硬化 (ＡＳ) ,其病变发生于动脉壁内层 ,ＡＳ的发病机制一直受到关注 ,百年来提出了种种学说 :如脂质浸润学说、血栓形成学说、平滑肌细胞克隆生长学说等 ,这意味着ＡＳ发病机理的复杂性 ,1990年代以来 ,提出了损伤反应学说 ,认为ＡＳ是一种慢性炎性疾病 ,表现为在致病因素作用下 ,动脉壁内由内皮细胞、平滑肌细胞、单核细胞和Ｔ淋巴细胞参与的细胞间相互作用 ,在ＡＳ发病机理中起着极其重要的意义。这种相互作用通过这些细胞分泌的趋化因子、生长因子和细胞因子实现调控。ＡＳ发生发展过程中包括许多病理…     

动脉粥样硬化中CARHSP1基因的表达对缺氧诱导的血管内皮细胞活力凋亡及免疫因子的影响

目的:探讨动脉粥样硬化斑块中钙调节热稳定蛋白1(CARHSP1)基因的表达对缺氧诱导的血管内皮细胞活力、凋亡及白细胞介素6(IL-6)和C-反应蛋白(CRP)表达的影响。方法:用Western blot检测动脉粥样硬化斑块中CARHSP1的蛋白表达;缺氧处理人脐静脉内皮细胞(HUVECs),将细胞分为正常培养组、缺氧组、缺氧+CARHSP1-siRNA组和缺氧+pc DNA3. 1-CARHSP1组,用CCK-8法及流式细胞术分别检测各组细胞活力及凋亡率; RT-PCR检测IL-6和CRP的表达; Western blot检测凋亡蛋白caspase-3、cleaved caspase-3、Bcl-2和Bax的蛋白水平。结果:CARHSP1在动脉粥样硬化斑块中的蛋白表达显著高于对照组(P 0. 05);缺氧可明显增加CARHSP1的表达。缺氧组HUVECs活力及Bcl-2表达显著低于正常培养组,细胞凋亡率及IL-6、CRP、cleaved caspase-3和Bax的蛋白水平显著高于正常培养组(P 0. 05);与缺氧组比较,缺氧+CARHSP1-siRNA组的活力及Bcl-2表达显著升高,细胞凋亡率及IL-6、CRP、cleaved caspase-3和Bax的蛋白水平显著降低(P 0. 05),pc DNA3. 1-CARHSP1组的细胞活力及Bcl-2表达显著降低,细胞凋亡率及IL-6、CRP、cleaved caspase-3和Bax表达显著升高(P 0. 05)。结论:CARHSP1在动脉粥样硬化斑块中表达升高,抑制CARHSP1表达可提高HUVECs的活力,降低细胞凋亡,下调免疫因子IL-6和CRP的表达,而过表达CARHSP1则反之。     

血管内皮细胞生长因子对内皮细胞凋亡拮抗作用的研究

目的 :初步探讨缺氧对培养人脐静脉内皮细胞凋亡的影响及血管内皮生长因子的干预性影响。方法 :( 1)人脐静脉内皮细胞的培养及鉴定。 ( 2 )建立人脐静脉内皮细胞缺氧模型 ,TUNEL法观测不同缺氧时间 ( 0、12、2 4、48h)对内皮细胞凋亡的影响及不同剂量血管内皮生长因子的拮抗作用。结果 :随缺氧时间延长 ,HUVECs凋亡率显著升高 ,呈时间相关性 ;血管内皮生长因子显著抑制缺氧导致的内皮细胞凋亡 ,呈剂量相关性。结论 :缺氧作为一种致病因素 ,对内皮细胞凋亡的促发作用是随缺氧时间的延长而加重的。内皮细胞的过度凋亡是引起内皮功能障碍的一个重要因素 ,血管内皮生长因子通过抑制内皮细胞凋亡 ,而具有内皮细胞保护作用。     

流动剪切和不同流型对血管内皮细胞增殖的影响

动脉粥样硬化的非随机分布与局部的血流动力环境有关，而内皮细胞增殖引起的内皮层失稳与动脉粥样硬化早期发生过程有关。本文比较了不同大小的切应力对内皮细胞增殖的影响，发现切应力抑制细胞增殖并与切应力大小相关。同时构建了平行板式突然扩张流槽，探讨流型改变对细胞增殖的影响，发现扩张效应和流线偏转效应使得这种剪切抑制作用被减弱。     

剪切力对血管内皮细胞表达IL-8的影响

本文利用改进的流室装置, 通过精密蠕动泵提供剪切力, 选择5dyne/cm2、10dyne/cm2、15dyne/cm2三种剪切力, 施加于体外培养的血管内皮细胞, 作用不同时间, 用RIA的方法检测流体动力学对血管内皮细胞表达IL-8的影响.结果表示, 不同剪切力作用内皮细胞后, IL-8的表达量与剪切力大小及作用时间有关, 为时间依赖性增长, 在5dyne/cm2组和10dyne/cm2组中, IL-8表达量明显高于空白对照组, 而15dyne/cm2组与对照组相比有下降趋势, 提示高剪切力有可能抑制IL-8的分泌.通过观察不同大小剪切力对血管内皮细胞表达IL-8的影响, 为探讨剪切力对动脉粥样硬化的影响提供一些数据.     

人endostatin体外诱导血管内皮细胞凋亡的实验研究

目的 探讨人endostatin抑制血管内皮细胞增殖的作用机制。方法 在含重组人endostatin蛋白和10%小牛血清的DMEM培养基中，培养人脐静脉内皮细胞ECV304。72h后，采用透射电镜，流式细胞术细胞周期分析和细胞核DNA的1.5%琼脂糖凝胶电泳，检测重组人endostatin蛋白作用后，血管内皮细胞的凋亡。结果 透射电镜下可见实验组ECV304细胞核染色质浓缩，边集，核碎裂及胞浆浓缩等，呈典型的凋亡细胞的形态学表现，流式细胞术细胞周期分析显示，在G1期峰前存在1个凋亡峰（20.6%)，1.5%琼脂糖凝胶电泳显示，细胞核DNA呈梯状，对照组ECV304细胞表达正常。结论 重组人endostatin蛋白可诱导血管内皮细胞凋亡，是其抑制血管内皮细胞增殖的原因之一。     

川芎嗪和剪切率对悬浮血管内皮细胞凋亡的影响

目的 探讨川芎嗪和剪切率对悬浮血管内皮细胞凋亡的影响。方法 体外培养大鼠脑微血管内皮细胞(rCMEC)，以川芎嗪和锥一板旋转剪切方式共同作用于悬浮rCMEC，采用Annexinv-FITC／PI双染法，流式细胞仪检测川芎嗪和剪应力对rCMEC凋亡的影响。结果 方差分析表明，川芎嗪和剪切率对rCMEC凋亡率有显著影响，川芎嗪降低凋亡率；剪切率增加凋亡率，二者作用相反但无交互作用。组间t检验表明：单独使用川芎嗪时，在本实验剂量范围内(3l.5～126μg／m1)，川芎嗪对静态悬浮rCMEC凋亡率无显著影响。高剪切率(6000，8000s-1)可诱导rCMEC凋亡，川芎嗪对此具有显著抑制作用。结论 适当剂量的川芎嗪可用于抑制高剪切率诱导的血管内皮细胞凋亡。     

同型半胱氨酸与动脉粥样硬化患者血管内皮细胞损伤相关性

目的 探讨动脉粥样硬化患者高同型半胱氨酸水平与血管内皮细胞损伤相关性.方法 循环酶法检测心肌梗死和脑梗死患者血清Hcy水平,ELISA法检测其ET-1、TM和vWF,对各组Hcy和血管内皮细胞损伤指标分别进行相关分析.结果 排除常见危险因素的差异后,心肌梗死组和脑梗死组分别与对照组相比较,血清Hcy、ET-1、TM和vWF水平均显著升高,差异均有统计学意义(P＜0.05).心肌梗死组和脑梗死组血清Hcy、ET-l、TM和vWF水平无统计学差异(P＞0.05).心肌梗死组和脑梗死组患者血清Hcy水平与ET-1、TM和vWF水平均呈明显相关性(P＜0.05).结论 动脉粥样硬化患者Hcy水平与血管内皮细胞损伤标志物ET-1、TM和vWF水平均显著相关,高同型半胱氨酸血症可能通过介导机体血管内皮细胞的损伤参与了动脉粥样硬化性心脑血管疾病的发生发展.     

PM2.5对血管内皮细胞氧化应激和凋亡的影响及机制

目的:从大气细颗粒物PM2.5对血管内皮细胞氧化应激和凋亡的影响,研究PM2.5对血管内皮细胞的毒性。方法:体外培养血管内皮细胞株EA.hy926,用不同浓度的PM2.5染毒24 h后,用CCK-8法测细胞的活性,用DCFH-DA荧光标记法检测细胞内氧自由基生成情况,用流式细胞术检测细胞凋亡率,然后用Western blot法检测凋亡相关蛋白细胞色素C、cleaved caspase-9和cleaved caspase-3的表达变化。结果:CCK-8法结果显示PM2.5对血管内皮细胞有明显的毒性,在浓度大于25 mg/L时可使EA.hy926细胞活性显著下降;PM2.5染毒24 h后可见DCFH-DA荧光染色增强,说明细胞内有大量的氧自由基形成;流式细胞术和Western blot检测证实PM2.5可以通过上调细胞色素C表达和活化cleaved caspase-9和cleaved caspase-3而诱导EA.hy926细胞凋亡。此外,用N-乙酰半胱氨酸抑制氧自由基生成可以抑制血管内皮细胞凋亡,提示PM2.5引起的细胞凋亡与氧化应激有关。结论:PM2.5可导致血管内皮细胞氧化应激水平增强和凋亡增加,这可能是其影响心血管系统功能的机制之一。     

PTEN抑制剂对软脂酸引起脐静脉内皮细胞凋亡的保护作用

目的 探讨抑癌基因PTEN（phosphatase and tensin homology deleted on chromosome ten）的抑制剂双过氧钒（bpV）对软脂酸（PA）引起人脐静脉内皮细胞（HUVEC）凋亡的保护作用。方法 四甲基偶氮唑盐(MTT)测定细胞生存率;Hoechst-PI染色荧光显微镜观测细胞凋亡形态;Annexin-Ⅴ-PI流式细胞术测定细胞凋亡,Western blotting检测总PTEN和磷酸化PTEN蛋白水平,实时定量PCR测定细胞PTEN mRNA的表达。 结果 MTT显示,PA（0.2~0.6mmol/L）作用24h后可明显抑制HUVEC细胞的生长;Hoechst-PI染色荧光显微镜及Annexin-Ⅴ-PI双染流式细胞检测证实不同浓度的PA处理24h后,随着PA浓度(0.2~0.6mmol/L)的增高,其诱导HUVEC细胞的凋亡作用增强,实时定量PCR 及Western blotting显示,PA浓度(0.2~0.6mmol/L)作用细胞后PTEN的转录及活性随浓度增高而增加,并呈现一定的剂量依赖性。bpV作用细胞可以增加细胞的生存率,抑制细胞的凋亡,PTEN的转录及蛋白表达降低。结论 一定浓度范围内PA剂量依赖性诱导HUVEC细胞发生凋亡性损伤,在此过程中伴随细胞内PTEN表达上调和活性增强,PTEN抑制剂双过氧钒使细胞的凋亡作用减轻,在此过程中PTEN转录及蛋白表达降低,PTEN信号通路可能是PA诱导脐静脉内皮细胞凋亡的重要通路之一, PTEN抑制剂可抑制此通路起到对细胞的保护作用。     

NK4基因在人胰腺癌细胞中的表达及其对血管内皮生长的影响

目的:构建NK4基因真核表达载体并进行转染研究。方法:对重组质粒pcDNA3/hNK4进行酶切,将目的基因NK4克隆到较强的真核表达载体pRC/CMV2中,应用脂质体将NK4基因转染到胰腺癌细胞株SW1990中,G418筛选获得稳定表达克隆,采用RT-PCR及Western blot鉴定及筛选出高转录和高表达的细胞克隆。以MTT法检测转染重组质粒pRC/CMV2-hNK4的细胞克隆表达产物对血管内皮细胞生长的影响。结果:在转染NK4基因的SW1990细胞克隆中,RT-PCR能扩增出NK4 mRNA预期的453bp片段,但强弱不同,Western blot显示均有约50 kD的NK4蛋白的表达。其上清可显著抑制血管内皮细胞的生长。结论:重组质粒pRC／CMV2-hNK4是一种高效真核表达载体,并且能够在SW1990细胞中高表达;NK4能够抑制血管内皮细胞的生长,提示其在肿瘤基因治疗中可能具有重要意义。     

一氧化氮在VEGF介导的内皮细胞增殖与分泌效应中的作用

目的: 探讨一氧化氮在血管内皮生长因子(VEGF)介导的血管内皮细胞增殖与分泌效应中所起的作用,了解VEGF可能的作用机制。方法:将体外培养的兔主动脉内皮细胞分成对照组、VEGF处理组和VEGF+N-硝基-L-精氨酸甲酯(L-NAME)处理组,采用四氮唑盐WST-1比色法、放免法和酶联免疫双抗体夹心法分别检测吸光值及内皮素-1和Ⅷ因子辅因子水平。结果:VEGF处理组吸光值明显高于VEGF+ L-NAME处理组,且均高于对照组(P＜0.01);VEGF处理组内皮素-1和Ⅷ因子辅因子水平明显低于VEGF+L-NAME处理组,且均低于对照组(P＜0.05和P＜0.01);提示VEGF能促进内皮细胞增殖,抑制内皮细胞分泌内皮素-1和Ⅷ因子辅因子,而L-NAME能部分拮抗VEGF的上述作用。结论:一氧化氮在VEGF促进内皮细胞增殖及抑制内皮细胞分泌内皮素 -1和Ⅷ因子辅因子中起中介作用,VEGF可能部分通过一氧化氮起作用,一氧化氮是VEGF作用机制中的一个重要信号通路。     

miR-146a在卵巢癌组织中的表达及其对卵巢癌SKOV3细胞增殖-凋亡的影响

目的探讨miR-146a在卵巢癌组织中的表达及其对卵巢癌SKOV3细胞增殖与凋亡的影响。方法RT-qPCR检测21例卵巢癌组织及对应癌旁正常卵巢组织中miR-146a表达;将miR-146a模拟物和miR-146a阴性对照转染到卵巢癌SKOV3细胞中,RT-qPCR检测转染后SKOV3细胞中miR-146a的表达;CCK8检测转染后miR-146a对SKOV3细胞增殖的影响;流式细胞仪检测转染后miR-146a对细胞凋亡的影响;Western blot检测SKOV3细胞p-Akt和Bcl-2的表达。结果 miR-146a在卵巢癌组织中的表达水平显著低于癌旁组织;转染miR-146a模拟物能显著提高SKOV3细胞miR-146a的表达量,显著降低SKOV3细胞的增殖能力,提高SKOV3细胞的凋亡率,抑制SKOV3细胞p-Akt和Bcl-2的蛋白表达(P0.01)。结论 miR-146a在卵巢癌癌组织低表达,转染miR-146a模拟物能抑制SKOV3细胞增殖,促进SKOV3细胞凋亡。     

具有梯度的流体切应力促进血管内皮细胞增殖

目的探讨流体切应力(shear stress,SS)对血管内支架边缘内皮细胞(endothelial cells,ECs)增殖的影响。方法应用具有切应力梯度的平行平板流动腔(梯度切应力组)和普通矩形平行平板流动腔(恒定切应力组),分别对ECs施加0.566￣1.438Pa和1.137Pa的切应力,加载时间6h,以未施加切应力的ECs为静止对照组。流式细胞仪检测各组ECs细胞周期的变化。结果梯度切应力组ECs在受力6h后进入S期与G2+M期细胞明显多于静止对照组与稳定切应力组(P<0.05);恒定切应力组的ECs受力后进入S期与G2+M期细胞明显少于其他两组(P<0.05)。结论梯度切应力促进ECs进入分裂增殖期,而稳定的层流切应力则产生对ECs细胞周期的抑制作用。提示血管内支架植入后,继发的血流切应力改变诱导细胞进入分裂、增殖期,这可能是引起支架内再狭窄过程中血管内膜增生的原因之一。     

Effects of vascular endothelial growth factor released from cultured dermal substitute on proliferation of vascular endothelial cells in vitro

Allogeneic cultured dermal substitute (CDS) was prepared by culturing fibroblasts on a two-layered spongy matrix of hyaluronic acid and atelocollagen. CDS can be cryopreserved and transported to other hospitals in a frozen state. The present study was designed to analyze the amounts of vascular endothelial growth factor (VEGF) released from fibroblasts in fresh and cryopreserved CDS and to investigate the effects of this VEGF on proliferation of vascular endothelial cells in vitro. The culture medium used in preparing CDS (fresh CDS culture medium sample) was collected and stored at –30°C for the quantitative analysis of VEGF. After thawing cryopreserved CDS, it was recultured in a culture medium for 1 week. The culture medium used was collected and stored at –30°C for quantitative analysis of VEGF. The amounts of VEGF released from the fresh and cryopreserved CDS into the culture medium were about 610pg/ml and 640pg/ml, respectively. This finding suggests that the cryopreserved CDS retains its ability to release VEGF. Immunohistological analysis indicated that some of the VEGF adhered to the matrix. Human vascular endothelial cells were cultured in medium mixed with the fresh or cryopreserved CDS culture medium sample. Proliferation of vascular endothelial cells was enhanced by increasing the concentration of both CDS culture medium samples. When antihuman VEGF antibody was added to the culture medium, the proliferative activity of vascular endothelial cells was reduced. These findings confirm that VEGF released from CDS promotes proliferation of vascular endothelial cells.     

脂质体介导的VEGF基因对培养血管细胞增殖的影响

目的：观察脂质体介导转移的VEGF基因在血管平滑肌细胞（VSMC）中的表达，比较VEG对血管内皮细胞（VEC）及VSMC增殖的影响。方法：将含血管内皮生长因子（VECF）CDNA的真核表达载体pSV121用脂质体介导的基因转移法导入血管平滑肌细胞（VSMC）中，取此VSMC条件培养液，再行血管内皮细胞（VEC）培养，用Northmblot杂交，Westem印迹法及[~3H]胸腺嘧啶核苷掺入法，观察了VEGF在VSMC及其条件培养液中的表达，比较了VEGF对VEC及VSMC增殖的影响。结果：转基因组VSMC中VEGFmRNA呈稳定高表达，转基因组VSMC条件培养液中，VEGF抗原表达显著高于对照组（P均＜0．01），加入此条件培养液的各组VEC的[~3H]胸腺嘧啶核苷掺入量均显著高于对照组（p均＜0．01），而在VSMC组无显著差异。结论：VEGF的转录和表达表明脂质体介导的血管细胞VEGF基因转移是成功的。VEGF具有促VEC增殖作用，但对VSMC无促增殖作用，有利于缺血性疾病及血管再狭窄的防治。     

CCDC34在非小细胞肺癌中的表达及其对肺癌细胞增殖能力的影响

目的 探讨CCDC34在非小细胞肺癌(NSCLC)中的表达情况及其对肺癌细胞增殖能力的影响.方法 利用GEPIA数据库分析CCDC34在NSCLC中的差异表达;利用Kaplan-Meier Plotter数据库分析CCDC34与NSCLC患者预后的相关性;构建稳定干扰CCDC34的A549和H1299肺癌细胞系,通过MTT方法和克隆形成实验明确CCDC34对肺癌细胞增殖和克隆形成能力的影响.结果 CCDC34在肺腺癌和肺鳞状细胞癌中的表达均显著高于正常肺组织(P＜0.01);CCDC34的高表达与NSCLC患者的不良预后显著相关(P=0.00013);MTT检测显示干扰CCDC34能够显著抑制A549和H1299的增殖能力(P＜0.05);克隆形成实验检测显示干扰CCDC34能够显著抑制A549和H1299的克隆形成能力(P＜0.05).结论 CCDC34在NSCLC中高表达,增强肺癌细胞的增殖能力,进而促进NSCLC的恶性进展.     

腺病毒介导的shRNA下调PTEN表达对体外活化肝星状细胞增殖与凋亡的影响

目的:探讨腺病毒介导的shRNA下调第10号染色体缺失的磷酸酶和张力蛋白同源物基因(PTEN)表达对体外培养的大鼠活化肝星状细胞(HSCs)增殖和凋亡的影响及其信号转导机制。方法:体外培养活化HSCs,以腺病毒为载体将靶向PTEN的shRNA干扰重组体转染至体外活化的大鼠HSCs;四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测HSCs增殖;末端转移酶标记技术(TUNEL)及流式细胞术测定HSCs凋亡;Western blotting方法检测PTEN、Bax、Bcl-2、Akt、p-Akt、ERK1/2及p-ERK1/2蛋白表达情况;实时荧光定量PCR方法检测PTEN、Akt及ERK1 mRNA表达情况。结果:(1)靶向PTEN的RNA干扰重组腺病毒成功感染体外活化HSCs,并在一定范围内呈时间依赖性地促进HSCs增殖,腺病毒感染HSCs后72 h,HSCs凋亡率显著下降(P<0.05);(2)Bax表达降低,Bcl-2表达增加(P<0.05);(3)p-Akt和p-ERK1/2蛋白表达显著增加(P<0.05);而Akt蛋白及其mRNA、ERK1蛋白及其mRNA表达均无显著改变(P>0.05)。结论:RNA干扰下调PTEN基因表达可能通过Bcl-2/Bax途径促进体外活化HSCs增殖并抑制其凋亡,此外,RNA干扰下调PTEN基因表达促进p-Akt和p-ERK1/2表达增多,提示PTEN可能通过影响PI3K/Akt和ERK1/2信号通路而在调控HSCs增殖和凋亡中发挥重要作用。