核酸分离与纯化的原理及其方法学进展

核酸的分离与纯化技术是生物化学与分子生物学的一项基本技术。随着分子生物学技术广泛应用于生物学、医学及其相关等领域,核酸的分离与纯化技术也得到进一步发展。各种新方法、经完善后的传统经典方法以及商品试剂方法的不断出现,极大地推动了分子生物学的发展。现就核酸分离与纯化的原理及其方法学进展作一综述。核酸分离与纯化的原则核酸在细胞中总是与各种蛋白质结合在一起的。核酸的分离主要是指将核酸与蛋白质、多糖、脂肪等生物大分子物质分开。在分离核酸时应遵循以下原则:保证核酸分子一级结构的完整性;排除其他分子污染。核酸…     

核酸分离与纯化的原理及其方法学进展

核酸的分离与纯化技术是生物化学与分子生物学的一项基本技术。随着分子生物学技术广泛应用于生物学、医学及其相关等领域，核酸的分离与纯化技术也得到进一步发展。各种新方法、经完善后的传统经典方法以及商品试剂方法的不断出现，极大地推动了分子生物学的发展。现就核酸分离与纯化的原理及其方法学进展作一综述。     

六种新型冠状病毒核酸检测试剂的性能评价及其与核酸提取试剂匹配性分析

目的:通过比较6种新型冠状病毒（2019-nCoV）核酸检测试剂的最低检出限、扩增效率、特异性、准确度以及与6种核酸提取试剂匹配性分析,为选择核酸提取试剂、扩增试剂以及临床诊疗提供科学依据。方法:将国家标准物质进行浓度梯度稀释得到6个浓度梯度,用广州达安、北京金豪、武汉明德、四川迈克、江苏硕世和上海之江6种2019-n...     

三种游离核酸提取试剂盒对血浆cfDNA提取性能的比较

目的 综合评估3种游离核酸（cfDNA）提取试剂盒,以筛选出经济可靠的商品试剂盒。方法 我们使用了3种不同的试剂盒提取10名健康人血浆中的cfDNA,并使用Agilent 2100生物芯片分析仪对cfDNA片段大小和丰度进行评估。同时,我们还使用微滴式数字PCR(ddPCR)对cfDNA中的核糖核酸酶P蛋白亚基p30(RPP30)、NADH脱氢酶亚基1(ND1)、NADH脱氢酶亚基4(ND4)基因拷贝数进行定量,并利用实时荧光定量PCR(q PCR)检测cfDNA中藤黄节杆菌序列（ALU）ALU115和ALU247的浓度。此外,我们还在混合血浆中掺入50～766 bp的DNA Ladder,然后使用上述3种提取试剂盒对其进行提取,并使用Agilent 2100生物芯片分析仪分析各DNA片段的浓度,以计算不同试剂盒对不同大小的DNA片段的回收率和提取偏好性。结果 3种试剂盒从健康人血浆中纯化的100～300 bp cfDNA浓度分别为（5.10±1.99）、（4.64±3.09）和（1.82±1.29）ng/mL(P=0.006)。Kit A所提取的RPP30拷贝数显著高于Kit C(P...     

手工与全自动核酸提取仪提取石蜡包埋组织DNA的比较

目的：比较手工与全自动核酸提取仪提取石蜡包埋组织DNA的浓度和纯度之间的差异,探讨不同提取方法、不同消化方式对DNA提取的影响。方法：选取27例中性福尔马林固定石蜡包埋组织标本,同一技师分别用手工提取与全自动核酸提取仪提取DNA的方法以及分别置于金属浴和恒温箱中消化,进行DNA提取。结果：使用金属浴对组织进行消化,手工提取DNA的浓度为107.1±30.1 ng/μL,全自动核酸提取仪提取DNA的浓度为39.1±16.5 ng/μL;使用恒温箱对组织进行消化,手工提取DNA的浓度为75.5±28.2 ng/μL,全自动核酸提取仪提取DNA的浓度为29.6±17.1 ng/μL,手工提取DNA的浓度均较高,差异有统计学意义(两者均为P<0.01)。手工提取和全自动DNA提取中,使用金属浴消化提取的DNA浓度均比使用恒温箱消化的高(107.1±30.1 VS 75.5±28.2,39.1±16.5 VS 29.6±17.1),差异有统计学意义(两者均为P<0.05)。不同提取方法及消化方式提取DNA的纯度无显著性差异。 结论：手工提取石蜡包埋组织DNA的浓度较高,使用金属浴消化组织提取DNA较恒温箱消化好,不同方式提取的DNA质量均满足分子病理检测需求。     

血小板制品细菌污染的核酸检测方法评价

目的探讨实时荧光定量PCR法检测血小板制品中细菌污染的C t值用于血液细菌污染筛查的可行性。方法用实时荧光定量PCR技术检测单采血小板样本740份,包括420份阳性样本及320份阴性样本。通过受试者工作特征曲线(ROC)分析检测结果,确定最佳工作点的特异性和灵敏度。结果通过对检测结果C t值分析,确定最佳工作点即C t值在31.97时灵敏度和特异性分别为99.4%和99.3%。通过对不同诊断点的结果分析初步确定C t值<31.97时发阳性报告,>33.00时发阴性报告,之间则为疑似样本。结论通过ROC曲线分析证实血小板制品细菌污染的实时荧光定量PCR检测法是一种高效、可靠、便于临床应用的检测手段。     

三种核酸共提取试剂盒对血液病毒提取效能的比较研究

目的比较不同核酸共提取试剂盒对血液病毒的提取效能差异。方法选择国内外广泛使用的3种血液病毒核酸共提取试剂盒,分别为OMEGA试剂盒、QIAGEN试剂盒和WATSON试剂盒,HBV阳性、HBV阴性、HCV阳性和HCV阴性血清样本均取自南京军区南京总医院。样本核酸提取按照各试剂盒说明书进行操作,定量方法采用实时荧光定量PCR。结果 OMEGA试剂盒对DNA的提取效率最高,对RNA的提取效率最低,耗时最短,成本居中;QIAGEN试剂盒DNA和RNA提取效率均较高,耗时居中,成本最高;国产WATSON试剂盒对DNA或RNA提取效率居中,耗时最长,成本最低。结论不同试剂盒对血液病毒的提取效能各不相同。对于已知病毒载量和病毒种类的样本,根据提取液DNA浓度和RNA浓度选择试剂盒;而对于未知病毒载量和病毒种类的样本,首选QIAGEN试剂盒,其次可选WATSON试剂盒。如只考虑成本,则首选WATSON试剂盒。     

Ⅳ型胶原的提取纯化与抗血清的制备

Ⅳ型胶原（Ⅳ．C）是基底膜的主要组成部分．人胎盘经胃蛋白酶消化，氯化钠分级盐析沉淀后，进一步经过DEAE－52和CM－52柱层析纯化制各Ⅳ．C．氨基酸分析表明甘氨酸含量占30％，羟脯氨酸占13％，两个α链的分子量分别在95000和70000，与Timpl报道相似，符合Ⅳ．C特征．将充分溶解的Ⅳ．C与等体积的完全Freund佐剂混合致敏新西兰大白兔制备抗血清，用放免和间接血凝法测定抗体效价分别为1：1200和1：512。与Ⅲ型前胶原和层粘连蛋白无明显交叉反应。Ⅳ．C经（125）Ⅰ标记，以固相二抗作为分离剂可建立血清中Ⅳ．C放射免疫测定方法。     

不同方法提取血培养瓶培养的抗凝血中布鲁氏菌核酸的比较

目的 比较不同提取方法对血培养瓶培养的抗凝血中布鲁氏菌检出率的影响。方法 将定量检测的灭活菌液/基因组DNA梯度添加至含抗凝血的血培养瓶中,选择不同的方法提取核酸,利用荧光定量检测其含量。结果 磁珠法和裂解法最低能检测添加10² CFU/mL的灭活菌液以及10-3 ng/μL的基因组DNA;离心柱法无法检测未经红细胞裂解液处理的添加10⁶ CFU/mL的灭活菌液以及10 ng/μL的基因组DNA,经红细胞裂解液处理后也只能检测到添加10⁴ CFU/mL的灭活菌液以及1 ng/μL的基因组DNA的模拟样品。结论 红细胞裂解液处理模拟样品能够增加核酸的提取量,裂解法提取效果最好,其次是磁珠法,再次是离心柱法。本研究为疑似布鲁氏菌病样品血培养物的核酸检测提供了方法参考,为提高布鲁氏菌病的诊断率提供了新的思路。     

血液净化专业护士核心能力评价指标体系的建立与评价

目的 建立适合血液净化专业护士核心能力的评价指标体系,为护士核心能力职级和岗位评价、选拔、认证、聘用提供科学依据.方法 以<血液净化专业护士核心能力培训模块>为理论基础确定评价指标体系初稿,采用Delphi法对备选指标进行专家咨询.结果 经过3轮函询后确定了4个不同层级岗位(N1-1级、N1-2级、N2级、N3级),每个层级岗位均有知识、技能和临床实践等3类评价指标,各层级知识、技能、临床实践的一级指标条目分别有5、5、4个;5、5、4个;5、5、5个;5、5、1个;二级指标条目分别有20、20、24个;20、20、20个;25、25、48个;23、24、14个.三级指标条目只有N1-1、N1-2和N2级知识评价指标有,分别有16、5、13个.结论 初步建立的核心能力评价指标体系基本能够合理的评价血液净化专业护士的能力.     

广西壮族自治区霍乱监测系统的建立与效果评价

目的　通过在广西壮族自治区境内建立霍乱监测系统,及时发现疫源,控制霍乱发生和流行。 方法　选择30个监测点并进行分类管理,确定监测内容和任务量,并组织实施;统计分析8年监测结果并评价效果。 结果　8年间共检索标本561 147份,总检出率为0.051%,腹泻病例及疑似病例、重点人群、水体、食品及其他外环境标本检出阳性率分别为0.061%、0.032%、0.099%、0.055%和0.115%;1999-2001年疫情期间分离菌株均为流行株或产毒株,2002-2006年无疫情期间菌株均从外环境检出,92.31%为非流行株或非产毒株;三类地区检索总阳性率分别为0.061%、0.043%和0.134%;3个有疫情年份的首例病例均是通过监测系统的腹泻病门诊发现,8年间通过腹泻病门诊发现了93.23%的霍乱病例;阳性标本多出现在疫区,疫区检出阳性率0.378%高于非疫区0.005%,总阳性率与流行强度呈正相关关系,与流行情况相符。 结论　腹泻病门诊提高了发现病例的敏感性,监测系统掌握的数据真实反映了流行情况,能有效指导预防控制措施的制定;亟待制定针对不同地区各级医疗机构的腹泻病门诊设置和工作规范。     

深圳市传染病暴发疫情监测系统的建立与运行结果分析

目的对2005年深圳市暴发疫情监测系统的运行结果进行流行病学分析,探讨利用计算机信息系统开展传染病聚集性和暴发疫情监测的模式与意义。方法对法定传染病疫情报告开展主动监测并对医疗机构和区级疾控机构报告的暴发疫情案例进行汇总,对2005年深圳市暴发疫情监测系统监测数据进行统计分析。结果2005年深圳市暴发疫情以流感、水痘、流行性腮腺炎为主;中小学和幼儿园等集体单位的暴发疫情需要引起高度重视;春季和冬季是传染病暴发疫情发生概率最高的两个季节,这与法定传染病散发疫情发病的时间分布不尽相同。结论依托计算机信息技术并充分利用国家疾病监测信息报告管理系统开展暴发疫情监测是传染病防制工作可行的方向,根据传染病聚集性监测结果实施高效及时的疫情控制和健康教育是传染病暴发监测的基本目标所在。     

连续性血液净化治疗多器官功能障碍对机体免疫功能的影响

目的观察连续性血液净化(CBP)治疗多器官功能障碍综合征(MODS)对机体免疫功能的影响。方法20例多器官功能障碍综合征患者,CBP治疗72h。在治疗0、24、48、72h时,各取肝素抗凝血15ml,分离单核细胞,脂多糖(LPS)10mg/L(10μg/ml)刺激12h,ELISA法测定其分泌的细胞因子水平(TNF-α、IL-6、IL-10);测定单核细胞人类白细胞DR抗原(HLA-DR)的表达情况判断其抗原呈递功能(流式细胞仪),同时观察外周血白细胞、单核细胞计数及血浆中各种细胞因子水平的变化。结果20例患者在接受CBP治疗时,①单核细胞分泌功能:治疗前,单核细胞分泌活跃。治疗后,该组单核细胞分泌TNF-α、IL-6和IL-10均明显减少(P<0.05);②单核细胞抗原呈递功能:与正常人相比,MODS患者单核细胞表达HLA-DR都明显降低(P<0.001)。治疗后,明显改善,(P<0.01);③单核细胞数量:治疗前,与正常指标比较单核细胞数量均明显降低。治疗后,单核细胞数量明显上升接近正常水平。CBP治疗后,血浆TNF-α和IL-6水平较治疗前明显降低(P<0.01);④3例死亡患者IL-10较其他患者明显升高,HLA-DR的表达则明显低下,CBP治疗后无明显改变。结论:①CBP能明显改善多器官功能障碍综合征患者单核细胞功能,重建机体免疫系统内稳状态;②单核细胞HLA-DR表达及血浆IL-10水平是反映多器官功能障     

公共卫生危机信息媒体监测平台的建立与运用

目的为了进一步丰富公共卫生监测信息的来源,提高疾病预防控制系统对突发公共卫生事件的早期预警能力,充分利用媒体资源信息,开展早期干预,及时应对。方法利用网络平台技术及RSS新闻聚合器,对目前互联网1000多个中文新闻媒体网站进行监测,搜索大多数公共卫生危机信息进行计算机智能分类并及时发布于网站。结果该系统建立能达到预期目标,可加载大部分网站的公共卫生相关新闻,并及时在公共卫生风险沟通平台（www.riskcommunication.org.cn）分类发布公共卫生危机信息。系统工作人员接受性较好。不同事件新闻可实现按地区、事件类别、时间、点击率进行分类排列,并提供RSS信息订阅。结论该系统能根据公众和专业技术人员所处地区、关心的事件种类、关心热点等提供量身订做的公共卫生危机信息,作为公共卫生信息聚合和媒体监测的工具,为预防疾病、早期发现事件、及时采取应急反应等均可以起到一定作用。     

临床检验试剂耗材网络化管理系统的建立及应用

目的探讨临床检验试剂耗材网络化管理系统的建立及其应用价值。方法采用三层B/S模式,基于"互联网+"和实验室信息管理系统建立临床检验试剂耗材网络化管理系统。结果建立了临床检验试剂耗材网络化管理系统,实现了对临床检验试剂耗材的全程数字化管理。结论该系统的建立有效提高了对临床检验试剂耗材管理水平和工作效率,确保了试剂耗材信息的完整性和可追溯性。     

死因监测质量评价方法及应用

目的 探讨质量评价方法,通过质量评价,提高死因监测质量.方法 综合指数法,监测指标为:单位报告率、审核率、报告及时性、报告合格率、审核及时性、审核合格率、各区县站报告死亡病例数占总人群死亡病例数的比例、数据库质量、根本死因填报.结果 太原市死因单位报告率为83.62%,审核率为98.42%,全市平均报告合格率为60.78%,平均审核合格率为94.27%,全市报告病例数占总人群病例数为36.64%,缺漏项数占报告病例数的1.62%,有死因链根本死因正确率为52.71%,无死因链根本死因正确率为82.22%.结论 太原市死因监测工作情况表明,质量评价是行之有效的质量管理方法.目前太原市死因监测工作中,需要采取相应措施降低漏报,加强死亡病例报告、审核的及时性,提高根本死因判定的准确性.     

6年临床常见病原茵对环丙沙星耐药趋势分析

目的 :调查我院 1998- 2 0 0 3年间临床常见病原菌对环丙沙星耐药性趋势 ,为临床合理用药提供依据。方法 :用MicroScanWalkAway- 4 0全自动微生物鉴定和药敏试验。结果 :10种临床常见菌 :金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、粪肠球菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、阴沟肠杆菌、变形杆菌属、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌和嗜麦芽窄食单胞菌 6年间对环丙沙星的耐药率增加 ,总耐药率从 1998年 4 4 0 %上升到 2 0 0 3年 5 2 7% ,其中金黄色葡萄球菌的耐药率增长最明显 ,年平均增加 7 4 % ;比较病原菌 1998～ 2 0 0 0年和 2 0 0 1～ 2 0 0 3年同一菌株间耐药率的变化 ,除鲍曼不动杆菌的耐药率有所下降外 ,其余 9种病原菌的耐药率均增加 ,且金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、大肠埃希菌、变形杆菌、铜绿假单胞菌前三年与后三年的耐药率差异有统计学意义。结论 :临床常见病原菌对环丙沙星的耐药率较高 ,临床经验用药应予以注意。     

SSA/Ro60自身抗原的基因克隆与表达纯化

目的克隆人SSA/Ro60自身抗原并表达纯化,为辅助诊断自身免疫提供物质基础。方法采用RT-PCR技术扩增SSA/Ro60基因,定向插入pPICZ表达载体,转入毕赤酵母表达系统,将获得的重组蛋白行SDS-PAGE和Western blotting鉴定。结果扩增出约1.5kb的SSA/Ro60全长序列,获得相对分子质量60×10~3的重组蛋白,经鉴定具有SSA/Ro60抗原性。结论成功克隆并表达SSA/Ro60,为诊断自身免疫疾病奠定基础。     

PRISMA血液净化系统常见报警原因分析与预防措施

本文对我科10例行连续性血液净化(CBP)患者治疗中出现的报警原因进行总结分析,并针对性地提出了预防护理措施,从而延长了滤器寿命,为今后行CBP治疗的患者提供帮助。