钩端螺旋体LipL21基因真核表达载体pcDNA3.1(+)/LipL21的构建与鉴定

目的构建钧端螺旋体外膜脂蛋白LipL21基因片段的真核表达载体，寻找新的预防钧端螺旋体感染的候选疫苗。方法应用PCR技术从钧端螺旋体黄疸出血群赖型56601株基因组模板中扩增LipL21基因，纯化回收后克隆入pUCm-T载体，再亚克隆入真核表达载体pcDNA3．1（＋）。结果双酶切及测序鉴定证明成功构建了LipL21真核表达载体pcDNA3．1（＋）／LipL21，DNA测序显示重组质粒含有561bp的目的基因片段，读码框架正确，无碱基错配及移码突变。测序后结果经与GenBank登录的序列做blast比较，载体上所连目的基因片段序列与GenBank登录的LipL21基因序列完全一致。结论成功构建了钧端螺旋体LipL21基因真核表达载体pcDNA3．1（＋）／LipL21。     

高密度培养大肠杆菌生产重组钩端螺旋体DNA疫苗

目的：高密度、高质粒拷贝数培养大肠杆菌生产重组DNA疫苗pcD-flaB。方法：应用FUS－5L自控发酵罐，采用补料分批培养技术，补料的补加使溶氧控制在30％－605，pH控制在7左右，培养中后期采用42℃培养以提高质粒拷贝数。结果；重组菌E.coli DH5α/pcDNA3-flaB发酵液光密度（D600）达到45。经纯化后最终质粒DNA得率为50mg/L。质粒没有发生丢失现象。结论：本实验为钩端螺旋体DNA疫苗的大规模生产奠定了基础。     

研究钩端螺旋体外膜脂蛋白Loa22的免疫原性

目的 研究钩端螺旋体外膜脂蛋白Loa22的免疫原性.方法 取健康豚鼠12只,分蛋白免疫组和PBS(磷酸盐缓冲液)对照组,每组6只.蛋白免疫组以Loa22重组蛋白50 μg加等量完全弗氏佐剂乳化一免,Loa22重组蛋白配以不完全弗氏佐剂乳化二免和三免;对照组注射PBS与佐剂混合物.分别检测血清中抗体和T淋巴细胞增殖水平.结果 在末次免疫后2周时血清抗体效价和T淋巴细胞增殖与对照组相比,均显著升高(P<0.05).结论 Loa22重组蛋白有较好的免疫原性.     

钩端螺旋体膜表面蛋白LipL41基因的克隆、序列分析及表达

目的:进一步分析钩端螺旋体LipL41的免疫原性.方法:通过PCR的方法,以我国特有的钩端螺旋体流感伤寒群临海型lin6株(56609)的DNA 为模板,扩增目的基因LipL41,克隆至pcDNA3载体上,以自动测序仪测序后进行序列分析,然后克隆至原核表达载体pGEX-5T进行原核表达,Western印迹分析其免疫原性.结果:获得长1 068 bp的片段,DNA序列分析表明该菌株的LipL41基因与文献报道具有很高的同源性(95.0％～99.4％),在大肠杆菌中获得了表达,并与抗钩端螺旋体血清反应.结论:该抗原为致病性钩端螺旋体所具有的保守性抗原成分,可能在钩端螺旋体病的诊断和预防中发挥作用.     

钩端螺旋体外膜抗原基因OMPL1在卡介苗中的克隆和初步表达

采用ＰＣＲ技术直接从致病性钩端螺旋体（简称钩体）赖型０１７菌株基因组中扩增钩体外膜蛋白基因ＯｍｐＬ１,并克隆到大肠杆菌—卡介苗穿梭质粒载体ｐＹ６００２中,重组质粒经电转化导入卡介苗。斑点杂交筛选重组卡介苗,再通过免疫印迹对其表达进行初步研究。在所得６个重组卡介苗中,有３个表达了ＯｍｐＬ１基因产物,其中一个表达较强。该研究为发展新一代高效广谱的钩体基因工程疫苗打下了基础。     

问号状钩端螺旋体外膜单克隆抗体凝集反应特性的研究

Three McAb were produced against an outer envelope preparation from Leptospira, interrogans, serovar Lai by fusion of SP2/0 myeloma cells with immune BALB/c mice spleen cells. The fusion rate was 96% and the antibody positive rate was 50%. One of the hybridomas, E4B11C9, reacted with 13 of the 13 serovars of the Icterohaemorrhagiae serogroup in microscopic agglutination test (MAT) but did not react with the 18 representative serovars of L. interrogans and L. biflexa serovar patoc and Leptonema illini. For all non-reactive serovars the MAT titres were greater than 1:25. The McAb, E4B7G5, reacted similarly with all serovars except smithi and tonkini. E4B7D4 reacted also similarly with all serovars except serovars birkini, ndambari, bogvere, smithi and tonkini. Therefore, 3 McAb showed serogroup specificity and partial serogroup specificity by agglutination. The agglutination titres were high and hybridomas were stable, so it might be useful in providing a simple, rapid method for the classification and identification of clinical isolates such as pathogenic L. interrogans in place of the complicated and time-consuming conventional methods.     

钩端螺旋体外膜抗原基因OMPL1在卡介苗中的克隆和初步表达

采用ＰＣＲ技术直接从致病性钩端螺旋体整形０１７菌株基因组中扩增钩体外膜蛋白基因ＯｍｐＬ１，并克隆到大肠杆菌－卡介苗穿梭质粒载体ＰＨ６００２中，重组质粒经电转化导入卡介苗。玉点杂交筛选重组卡介苗，再通过免疫印迹对其表达进行初步研究。     

钩端螺旋体DNA疫苗pcD-flaB的构建及其免疫机制的初步研究

观察钩端螺旋本ＤＮＡ疫苗的保护效果,并探讨疫苗的免疫机制。方法：应用定向克隆的方法构建ＤＮＡ疫苗ｐｃＤ－ｆｌａＢ,肌肉途径免疫豚鼠,观察豚鼠攻击感染钩体后保护率,以ＥＬＩＳＡ法检测特异性抗体ＩｇＧ工观察疫苗对豚鼠腹腔巨噬细胞分泌的ＴＮＦ活性的影响。结果该疫苗对同型钩体的保护率为１００％,特异性抗体水平在疫苗注射第６周达到高峰,ＴＮＦ的活性明显增高。结论：ＤＮＡ疫苗ｐｃＤ－ｆｌａＢ对同型钩体感染有较     

钩端螺旋体外膜蛋白研究现状

<正>钩端螺旋体病(leptospirosis,简称钩体病),是由致病性钩端螺旋体(简称钩体)引起的钩端螺旋体病(钩体病),是一种全球性自然疫源性疾病,广泛分布在世界各地。我国是受钩体病危害十分严重的国家,目前已发现有18个血清群75个血清     

一种钩端螺旋体DNA疫苗的免疫原性和免疫保护性研究

为了研究赖型钩体内鞭毛蛋白基因在动物体内的表达及其免疫保护性。采用ＰＣＲ扩增内鞭毛蛋白编码基因,以表达质粒ＶＰ１０１２为载体,构建了合有钩体的内鞭毛基因的重组质粒,在新西兰大白兔四头肌内注射该重组质粒ＤＮＡ５００μｇ／只,重复３次,每次间隔３周,于每次注射前和末次注射后３周,检测血清抗赖型钩体抗体效价,结果显示,在第１次加强免疫注射后３周,试验组血清抗体效价显著增高,豚鼠免疫保护试验表明,该ＤＮＡ     

肺炎衣原体0308基因真核表达载体构建及表达检测

目的构建肺炎衣原体AR39株Cpn0308基因真核表达重组质粒,体外转染HeLa细胞并检测表达情况,为Cpn核酸疫苗的研制做准备。方法应用PCR技术从CpnAR39株基因组中扩增Cpn0308全长基因,重组入pcDNA3.1/HisA真核表达载体相应位点,进行酶切鉴定和序列分析后,运用脂质体介导重组质粒转染HeLa细胞,间接免疫荧光技术检测目的蛋白在真核细胞中表达情况。结果 PCR扩增得到393bp的特异性Cpn0308基因,筛选鉴定出pcDNA3.1/HisA-Cpn0308真核表达重组体,序列测定证实与GeneBank登录的CpnAR39株Cpn0308基因一致;间接免疫荧光法检测到重组质粒转染的HeLa细胞能够表达目的蛋白。结论成功构建pcDNA3.1/HisA-Cpn0308真核表达重组体,且该重组体能够在体外真核细胞中表达目的蛋白,为进一步研究CpnDNA疫苗以及研究该蛋白的生物学功能提供实验基础。     

重组乙肝表面抗原真核表达质粒的构建及表达

采用限制性内切酶从重组的真核表达质粒pcDNA-S2S中分离出经过测序鉴定的乙肝表面抗原中蛋白（preS2 S)基因片段,将其亚克隆于pVAX1真核表达载体,构建编码乙肝表面抗原中蛋白的卡那霉素抗性真核表达质粒pVAX-S2S,酶切鉴定后将重组质粒体外转染COS7细胞,ELISA法检测上清液中的HBsAg呈阳性,说明重组质粒pVAX-S2S在体外能够有效表达HBsAg,为进一步的体内免疫反应打下基础。     

人颗粒溶素基因真核表达载体的构建及在肝癌细胞中表达的实验研究

目的： 构建人颗粒溶素（GNLY） 全长编码序列的真核表达载体,转染肿瘤细胞,观察GNLY在细胞内的表达及其对细胞增殖的抑制作用. 方法：用RT-PCR技术获取人GNLY 全长编码序列cDNA,克隆至pGEM-T 载体进行测序,再将克隆片段插入质粒pcDNA3.1（＋）中,构建真核表达载体pcDNA3.1（＋）/GNLY,用阳离子聚合物转染试剂转染肝癌细胞系SMMC-7721,检测目的基因mRNA的表达,WST-8法检测细胞增殖活性. 结果：获得人GNLY全长编码序列cDNA ,并成功构建真核表达载体pcDNA3.1（＋）/GNLY;转染SMMC-7721细胞后,检测出目的基因mRNA的表达;重组质粒转染组与空质粒对照组细胞增殖活性有非常显著性差异（P〈0.01和P〈0.001）,并且随着转染基因浓度的增加,细胞增殖活性逐渐降低,2.0μg/ml pcDNA3.1（＋）/GNLY转染组细胞增殖活性下降至0.329. 结论：pcDNA3.1（＋）/GNLY真核表达载体构建成功,GNLY基因转染对SMMC-7721细胞能产生细胞毒性效应,对肝癌细胞具有一定的杀伤作用.     

空肠弯曲菌Pen:19 cadF基因真核表达重组质粒的构建与表达

目的：构建空肠弯曲菌Pen：19cadF基因真核表达重组质粒，并证实其能在COS-7细胞中表达。方法：以含有KpnI和EcoRI酶切位点的同一对引物行PCR反应，获得空肠弯曲菌Pen：2、Pen：8、Pen：19和Pen：21cadF基因DNA片段。并选择与格林-巴利综合征最为相关的空肠弯曲菌Pen：19PCR产物为目的基因片段，插入到真核表达载体pcDNA3．1（＋）中，以构建重组质粒pcDNA3．1（＋）-cadF。重组质粒经双酶切、PCR反应鉴定和DNA双向测序确认后转染至COS-7细胞。运用RT-PCR方法检测重组质粒在细胞mRNA水平的表达。结果：双酶切反应、PCR反应和DNA双向测序证实cadF基因插入成功。采用RT-PCR方法能够从重组质粒转染的COS-7细胞中扩增出与目的基因大小一致的DNA片段。结论：空肠弯曲菌Pen：19cadF基因真核表达重组质粒pcDNA3．1（＋）-cadF构建成功，并能在COS-7细胞中表达。为空肠弯曲菌DNA疫苗的研究奠定了良好的基础。     

Sjcb2 DNA疫苗的构建及其在真核细胞中的表达（英文）

目的 克隆日本血吸虫组织蛋白酶B基因，构建真核表达重组质粒，转染真核细胞，观察其表达情况。方法用PCR技术从已构建好的重组质粒pBCSK＋／Sjcb2中扩增出Sjcb2基因片段，重组入克隆载体pUCm-T。再将Sjcb2基因片段亚克隆入真核表达载体pcDNA3．1（＋）。进行PCR、双酶切和DNA序列鉴定后，运用电穿孔技术将重组体pcDNA3．1（＋）／Sjcb2转染HeLa细胞，间接免疫荧光技术观察目的基因的表达。结果成功扩增出Sjcb2基因片段并构建DNA疫苗；重组质粒在HeIJa细胞中获得表达。结论Sicb2基因能够在体外真核细胞中表达。     

重组质粒pLMP1-p53mt的构建与表达

目的构建含突变型p53基因和EB病毒LMP1基因的双基因真核表达质粒,为研究突变型p53基因和EB病毒LMP1基因在鼻咽癌发生中的相互作用奠定基础.方法通过分子克隆技术,构建含突变型p53基因和EB病毒LMP1基因的真核表达载体pLMP1-p53mt;培养HeLa细胞,采用脂质体lipofectAMINETM 2000将该质粒转入HeLa细胞中,转染后48h,利用免疫细胞化学法研究突变型p53基因和EB病毒LMP1基因的表达情况.结果重组质粒限制性内切酶酶切及PCR鉴定结果与预期一致;观察到转染细胞中突变型p53基因和EB病毒LMP1基因的高效表达.结论成功构建了含突变型p53基因和EB病毒LMP1基因的双基因真核表达质粒.     

MCP-1真核表达载体的构建和鉴定

目的构建大鼠MCP-1真核表达载体pcDNA3.1（＋）-MCP-1。方法据Genebank中大鼠MCP-1cDNA序列设计并合成特异性引物,提取糖尿病模型大鼠肾脏总RNA,利用PCR技术扩增出MCP-1全编码区基因片段,并将扩增产物TA克隆至pMD-18T载体,然后分别双酶切pMD-18T-MCP-1回收目的片段再克隆到真核表达载体pcDNA3.1（＋）中。结果PCR扩增得到大鼠成熟MCP-1的cDNA片段大小为500 bp,重组子利用限制性内切酶进行酶切、PCR鉴定和DNA序列分析得到真核表达载体pCDA3.1（＋）-MCP-1。结论成功构建了大鼠MCP-1真核表达载体,为进一步研究MCP-1的DNA疫苗奠定基础提供了条件。     

人纤溶酶真核表达重组质粒的构建

目的：构建人纤溶酶真核表达载体以用于抗栓、溶栓的研究。方法：人胎肝组织经PCR技术扩增人纤溶酶基因,定向克隆至真核表达质粒pC-DNA-3后测序。经测序鉴定正确后构建人纤溶酶真核表达重组质粒,利用PCR和酶切方法鉴定重组真核表达质粒的正确性。结果：目的基因 PCR扩增产物为1 740 bp,测序结果显示,目的基因PCR扩增产物与GenBank登记的序列完全相同。PCR和酶切鉴定结果显示,构建的重组真核表达质粒中含有正确编码的人纤溶
酶基因全长序列。结论：成功构建了含有人纤溶酶基因的真核表达重组质粒,并进行了鉴定。     

不可分型流感嗜血杆菌外膜蛋白P6基因真核质粒的构建及表达

目的:构建不可分型流感嗜血杆菌(nontypeableHaemophilus influenzae,NTHi)外膜蛋白P6(outermembrane protein P6,P6)真核表达的重组质粒,并在HeLa细胞中表达,为核酸疫苗的开发奠定基础。方法:以NTHi基因组为模板,扩增编码P6蛋白的基因片段,酶切、纯化P6基因与真核载体pcDNA3.1/HisA后进行连接,之后转化并筛选含有目的基因的重组质粒pcDNA3.1/HisA-P6;将重组子转染至HeLa细胞,荧光蛋白法检测其表达产物。结果:经质粒PCR、酶切、测序证实插入的基因片段为NTHi-P6蛋白编码基因;荧光显微镜下显示,该重组质粒能够在HeLa细胞中表达目的蛋白。结论:成功地构建了真核重组质粒pcD-NA3.1/HisA-P6,并在HeLa细胞中表达。