西尼罗病毒Chin-01株基因组编码区序列测定及分析

目的：对保存的西尼罗病毒Chin-01株基因组编码区序列进行测定，了解其与已报道毒株的序列差异及系统进化关系。方法：对Chin-01株病毒基因组编码区分区段进行RT-PCR扩增，分别将扩增产物直接进行测序，采用DNAstar软件将测序片段拼接获得全长编码区序列。结果与结论：Chin-01株基因组编码区全长10302nt，为单一读码框架，编码3434个氨基酸。其中结构蛋白基因为2373nt，依次编码4种结构蛋白(C，PrM，M和E)；非结构蛋白基因全长7926nt，依次编码7种非结构蛋白(NS1，NS2a，NS2b，NS3，NS4a，NS4b和NS5)。序列同源性分析表明，Chin-01株与埃及Eg101株高度同源，两者氨基酸序列仅有0．3％的差异。该株西尼罗病毒基因组编码区序列已输入GenBank数据库。     

基孔肯雅病毒WJ0601株基因组全序列测定及分析

目的对保存的基孔肯雅病毒WJ0601株基因组序列进行测定,并阐明该病毒与已报道毒株序列的关系。方法对基孔肯雅病毒基因组编码区分14段进行RT-PCR扩增,对非编码区采用RACE法进行扩增,将扩增产物直接进行测序,应用DNAStar软件将测序结果拼接得到基因组序列。结果与结论基孔肯雅病毒WJ0601株基因组核苷酸共11826nt,编码3722个氨基酸,其中5′端的2/3基因组编码4种非结构蛋白nsP1、nsP2、nsP3和nsP4;3′端的1/3基因组编码5种结构蛋白C、E3、E2、6K和E1蛋白。结构基因和非结构基因之间有68nt的连接区为非翻译区。病毒基因组5′端和3′端分别有76nt、526nt的非编码区。序列同源性分析结果表明,此株病毒与S27-African株的同源性最高,两者核苷酸序列同源性为99.9%,氨基酸序列同源性为99.8%,同属于（ESCA）基因型。     

1999年新分离的登革病毒福建株基因组非编码区的结构特征

目的：测定和分析我国登革2型病毒福建株（FJ－11）基因组非编码区（NCR）序列,为探讨其结构特征与功能的关系提供依据。方法：从登革2型病毒感染C6／36细胞中提总RNA,采用RACE法扩增病毒基因组5′和3′端片段,分别将其克隆至pGEM-T载体,挑取阳性克隆进行序列测定,利用RNAdraw软件对非编码区二级结构进行预测。结果与结论：我国登革2型病毒FJ－11株基因组5′和3′非编码区长度分别为96nt和454nt,具有黄病毒共有保守序列和二有结构。与登革2型病毒美洲基因型比较显示,5′NCR第69位核苷酸的改变对其二级结构有影响,3′NCR端约70nt能形成相同的保守结构,而前380nt呈现多处核苷酸的差异而导致峡谷者预测的二级结构差异较大,它们可能对病毒基因组RNA的复制起重要作用。     

西尼罗病毒Chin-01株5′非编码区（UTR）中复制相关元件的功能研究

目的研究西尼罗病毒Chin-01株5′非编码区(UTR)中复制相关元件的功能,为探讨该病毒基因组复制的分子机制提供理论依据。方法通过生物信息学分析,初步筛选出Chin-01株5′UTR中可能的复制相关位点,并构建相应的重组亚基因组突变体,然后以上此为模板,经体外RdRp活性分析及凝胶阻滞试验,观察NS5的RdRp活性及与突变体的结合能力,再将突变位点引入该病毒感染性全长cDNA克隆,初步观察突变体恢复病毒的生物学特性。结果5′UTR中第45-60位核苷酸缺失的突变体无法合成子链,与NS5的结合能力也显著降低。第8和9位核苷酸改变的突变体则丧失了合成子代RNA及与NS5的结合能力,第8、9、69和70位核苷酸突变后形成的结构恢复突变体则可以合成子链RNA,并可与NS5特异性结合。同时,第45-60位核苷酸缺失及第8和9位核苷酸突变的恢复病毒的增殖能力也显著降低。结论Chin-01株5′UTR中的第45-60位及第8、9、69和70位核苷酸维持的结构可能是该病毒基因组复制的关键位点。     

WJBC株盖塔病毒基因组序列测定及与其他甲病毒的系统进化关系

目的对WJBC株盖塔病毒（GETV）进行基因组序列测定,阐明其与已报道的GETV及其他甲病毒的关系。方法将GETV基因组编码区分12段分别进行RT-PCR扩增,将扩增产物直接进行测序,非编码区采用RACE法进行扩增,扩增产物纯化后连入pGEM-T easy载体,经转化DH5α感受态细胞,挑取阳性克隆鉴定后测序,应用DNAStar软件将测序结果拼接获得基因组序列。结果与结论 GETV基因组核苷酸共11 696 nt,编码3721个氨基酸,非结构基因编码2468个氨基酸,结构基因编码1253个氨基酸,结构基因和非结构基因之间有44 nt的连接区为非翻译区。病毒基因组5＇端和3＇端分别有78、411 nt的非编码区。序列同源性分析结果表明,此株病毒与M1株盖塔病毒同源性最高,两者核苷酸序列同源性为99.8%,氨基酸序列同源性为99.2%。     

1株辛德毕斯病毒基因组编码区序列测定及分析

目的:对保存的一株辛德毕斯病毒基因组编码区序列进行测定,阐明其与已报道毒株序列的差异.方法:对辛德毕斯病毒基因组编码区进行分段RT-PCR扩增,将扩增产物直接进行测序,采用DNA Star软件将分段测序结果拼接得到全长编码区序列.结果与结论:此株辛德毕斯病毒基因组编码区全长11 322 nt,编码3 774个氨基酸,其中非结构基因长7 539 nt,编码4种非结构蛋白NSp1,NSp2,NSp3,NSp4;结构基因全长3 735 nt,编码5种结构蛋白E1,E2,E3,6K和C蛋白.非结构基因和结构基因之间有48 nt的不翻译连接区.序列同源性分析结果表明,此株病毒与HRsp株的同源性最高,两者核苷酸序列同源性为99.7%,氨基酸序列同源性为99.6%.此株病毒与HRsp株病毒亲缘性最高,同属于南非-欧洲组.     

登革1型病毒广州2006年分离株的基因组特征与进化分析

目的 对2006年分离自广州登革热患者血清的4株登革1型病毒(GZ57/06、GZ63/06、GZ69/06和GZ128/06)进行全基因组序列测定,并同其他毒株序列进行比对分析,以了解其基因组序列特征及可能的传播来源.方法 将登革1型病毒分离株基因组分为9个片段进行RT-PCR扩增,5'与3'末端序列采用RACE法扩增,扩增产物纯化后进行PCR测序.通过末端重叠序列拼接成全长病毒基因组序列,利用生物信息学软件对序列进行比对分析.结果 测序获得的4株广州登革1型病毒基因组全长均为10 735核苷酸(m),编码3 393个氨基酸.5'和3'端各有一段非编码区,长度分别为94nt和462nt.4株病毒的编码区与非编码区核苷酸及氨基酸序列存在一些差异,其中GZ57/06、GZ63/06和GZ69/06毒株的基因组核苷酸和氨基酸序列同源性均在99%以上,而GZ128/06株变异较其他3株大,编码区差异尤其明显.序列比对分析表明,GZ57/06、GZ63/06和GZ69/06毒株均与泰国2001年分离毒株ThD1/0049/01和ThD1/0102/01同源性最高,而GZ128/06毒株与缅甸1998年分离毒株D1.Myanrmr.31987/98同源性最高.这些新分离毒株与东南亚毒株属于同一基因型.结论 新分离毒株可能来自泰国等东南亚国家和地区,不同毒株表型差异可能与其基因组特征具有密切关系.     

我国登革1型病毒广州株基因组全序列测定与分析

目的：对引起1980年广州登革热流行的登革1型病毒（GZ／80）株的基因组全序列进行测定,为进一步了解病毒基因组结构与功能的关系。从分子 水平探讨登革病毒的传播和流行规律及致病机制提供依据。方法：用广登革热流行期间从患者血清中分离的GZ／80株病毒感染乳腺,聚鼠脑制备病毒RNA。对基因组编码区分段进行RT－CR扩增,非编码区采用RACE法进行cDNA扩增。然后将特异产物纯化后与pGEM-Teasy载体连接,分别进行克隆测序。结果：GZ／80株基因组全长10735ng,5′和3′非编码区长度分别为94nt和465nt基因组单一的读码框架长度为10176ng,编码3392个氨基酸,与登革1型病毒16007株、WestPac74株、新加坡S275／90株和FGA／89株核苷酸序列的同源性分别为94％,93％,95％和91％;推测的氨基酸序列的同源性分别为98．0％,97．9％和97．1％。结论：GZ／80株基因组大小及结构与已知的登革1型病毒其他地区分离株一致。系统发生树分析显示,GZ／80株属于第Ⅱ基因型,与台湾87株、88株和泰国80株为同一基因型。提示广州登革热流行的病原可能来自我国。     

1株保存的马雅罗病毒基因组序列测定及分析

目的对保存的WJBC株马雅罗病毒(MAYV)基因组序列进行测定,阐明其与已报道毒株的关系及追溯其可能来源。方法将MAYV基因组编码区分10段进行RT-PCR扩增,扩增产物直接进行测序,非编码区采用RACE法进行扩增,扩增产物纯化并连接pGEM-T easy载体后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,挑取阳性克隆鉴定后进行测序,用DNAStar软件将测序结果拼接得到基因组序列。下载MAYV核苷酸序列,利用MEGA5.0软件构建系统进化发生树。结果与结论 WJBC株MAYV基因组核苷酸(nt)共11 429 nt,编码3679个氨基酸,其中5’端的2/3基因组编码4种非结构蛋白nsP1,nsP2,nsP3,nsP4;3’端的1/3基因组编码5种结构蛋白C、E3、E2、6K和E1蛋白。结构基因和非结构基因之间有26 nt的连接区为非翻译区。病毒基因组5’端和3’端分别有76、290 nt的非编码区。进化树结果显示,WJBC株马雅罗病毒与TRVL4675株MAYV亲缘性最高。     

一株西尼罗病毒基因组cDNA亚克隆的构建与鉴定

目的：构建我室保存的一株西尼罗病毒引进毒株（CH-01）基因组全长cDNA的亚克隆，为进一步构建该毒株的感染性全长cDNA克隆奠定基础。方法：根据CH-01病毒株基因组序列中含有的特异性酶切位点，利用DNAstar及Olig06软件设计5对引物。以感染细胞中的病毒RNA为模板，通过RT-PCR扩增出覆盖病毒基因组全长的5个cDNA片段，并分别将其克隆至pGEM-Teasy载体，通过片段间共有的酶切位点进行连接，最终获得基因组5′和3′半分子，并分别通过序列测定加以鉴定。结果与结论：已构建出西尼罗病毒CH-01株基因组的5′和3′半分子，经酶切鉴定和序列测定表明所获得的cDNA克隆为该株病毒的特异性序列。     

登革4型病毒5''非编码区SLB元件对病毒复制和翻译的调控作用

目的探讨登革4型病毒5′非编码区SLB元件对病毒复制和翻译的调控作用。方法首先通过mfold3·2软件对登革4型病毒5′端RNA二级结构进行预测,确定了3个突变位点:SLB1,缺失位于短茎环82-87位5′UAR环化序列,并破坏其保守茎环结构;SLB2,在次环引入突变破坏其环状结构(M77G/C);SLB3,突变仅涉及核苷酸,不破坏该次环二级结构(M77-78AG/GA)。然后在含有海肾荧光素酶(Renilla Luciferase,R·luc)报告基因的复制子(DEN-R·luc2A-RP)基础上,利用重叠PCR构建上述突变体。将突变体(包括相关的阳性和阴性对照复制子)分别线性化并体外转录成RNA后,取等量各转录体RNA,以脂质体法分别转染BHK-21细胞。通过间接免疫荧光(IFA)、RT-PCR、R·luc报告基因技术和实时定量RT-PCR对突变体的复制和翻译水平进行检测。结果SLB1突变体的翻译水平并未受到显著影响,但其复制水平出现显著下调。SLB2突变体的翻译水平亦未受到显著影响,但其复制水平受到完全抑制;SLB3突变体的复制和翻译水平均受到了完全抑制。结论登革4型病毒5′非编码区SLB元件对基因组RNA复制和翻译具有重要的调控作用。     

丙型肝炎病毒的分子遗传学研究现状

丙型肝炎病毒(HCV)基因组是线性、正链RNA分子,其全长核苷酸(nt)序列约为10kb,由5′端(332nt)非编码区、3′端(54nt)非编码区和一长的开读框架(ORF:1～9033nt或9075nt、9097nt)3部分构成;根据编码区基因序列可推定出HCV多聚蛋白前体(3011aa)的组成。用计算机对基因组的核苷酸序列进行分析,结果表明HCV基因组具有较高的突变频率,因而基因序列呈现出较大的变异,其中以E_1区和E_2/NS_1区的变异性最高;相对而言,C区、NS_3～NS_5区和5′-NCR的核苷酸序列则有明显的保守性;同时将HCV和已知的其它病毒的基因组及多聚蛋白进行比较,结果显示在分类上HCV与黄病毒和瘟病毒有关。     

我国两株森林脑炎病毒的生物学性质及E蛋白基因核苷酸序列的比较

目的：比较我国1953年从患者脑组织分离的森张株和2001年从患者血清中分离的MDJ01株森林脑炎病毒(TBE)的生物学特性及E蛋白基因核苷酸序列的变化，分析TBE病毒E蛋白基因的变化与功能的关系，从分子水平上探讨我国TBE的传播、流行规律及致病机制。方法：两株病毒同时接种乳鼠和，BHK／21细胞，观察两株病毒对乳鼠和BHK／2l细胞的致病性；从两株病毒感染的BHK／2l细胞中提取病毒的RNA，对E蛋白基因进行RT-PCIR扩增，扩增产物纯化后与pGEM-T载体连接，分别进行克隆测序。结果：森张株对乳鼠和BHK／21的致病性均比MDJ01株明显；两株病毒E蛋白基因长为l488nt，编码496个氨基酸，核苷酸的变异为33个，导致了2个氨基酸的变化，第一个氨基酸的变异发生在113位(MDJ01株由Ⅰ变成Ⅴ)，第二个氨基酸的变异发生在163位(MDJ01由P变成A)，两株病毒核苷酸序列的同源性为97．8％，推测的氨基酸序列的同源性为99．6％。与国外远东株比较，森张株核苷酸序列的同源性稍高于MDJ01株，与欧洲株、西伯利亚株的同源性基本一致。结论：新分离株MDJ01对细胞和乳鼠的致病性稍低于1953年分离的森张株，E蛋白基因的核苷酸序列分析表明两株病毒同属于远东亚型，推测MDJ01株可能是由森张株在自然界长期演变而来。     

梯度回波采样自旋回波序列测量脑R2'及氧摄取分数值稳定性及重复性的研究

目的 通过梯度回波采样自旋回波序列(GESSE)测量脑组织R2'值与传统梯度回波序列(GRE)间接测量R2'值的方法在正常志愿者内进行比较,初步评价该序列的稳定性及重复性.方法 8名正常健康志愿者,平静状态下进行头颅单层GESSE序列和该层面T2图(T2 map)和有效横向弛豫时间图(T2*map)扫描.1 d之后,再重复进行相同层面的上述序列扫描.应用北大医院和北京大学工学院生物医学工程系共同自主开发的软件对GESSE序列原始图像进行后处理得到R2'图(R2'map)及氧摄取分数图(OEF map),将左、右大脑半球等分为前、中、后3个区域,测量该区域R2'值和OEF值;T2 map及T2*map的数据在Functool工作站上进行后处理得到自旋-自旋弛豫率图(R2 map)和表观自旋-自旋弛豫率图(R2*map),利用公式计算得到R2'值(R2'=R2*-R2,R2*=1/T2*,R2=1/T2),ROI测量方法及部位同GESSE序列.通过配对t检验比较GESSE序列及传统序列2次测得R2',初步评价该序列的稳定性,通过配对t检验比较GESSE序列前后2次扫描得到的OEF值,初步判断该序列测量OEF值的重复性.结果 GESSE序列前后2次扫描得到的R2'值分别为(4.21±0.92)、(4.45±0.94)Hz,差异无统计学意义(t=-0.83,P＞0.05).前后2次传统方法得到R2'平均值分别为(7.37±1.47)、(6.42±2.33)Hz,差异有统计学意义(t=1.80,P＜0.05),第1次GESSE序列和传统方法所测R2'差异有统计学意义(t=1.71,P＜0.05).GESSE序列前后2次所测OEF值分别为0.327±0.036和0.336±0.035,差异无统计学意义(t=-1.48,P＞0.05).结论 在正常被试者中GESSE序列测量R2'值与传统方法相比稳定性较好.GESSE序列测量的OEF值重复性较好.该技术有进一步临床应用的前景.     

SEN病毒中国分离株基因克隆及序列分析

目的：测定SENV-D亚型中国分离株的基因组序列，并对其进行初步分析。方法：根据国外已发表的SEN病毒基因序列设计特异性引物，应用套式PCR方法从一份非甲-非戊型(non-A-E)肝炎患者血清中，分段扩增了包括SENV-D型所有编码区(ORFs)长3175bp的DNA片段，将其克隆到T载体后测序。结果：测序结果经BLAST软件分析，与国外发表的3株D型SEN病毒SENV-D(AX025730)，SENV-D(AB059352)，TTV(AB028668)的核苷酸序列同源性分别为90％，88％和91％；与2株D型SEN病毒SENV-D(AX0Z5730)，TTV(AB028668)0RF1所编码蛋白的氨基酸同源性分别为93％和92％。ORF1蛋白中含有Rep蛋白(在病毒复制中起作用的一种蛋白)的两个保守基序，此外还有一个保守的ATP／GTP结合基序(P-loop)以及若干个高度保守的蛋白激酶磷酸化位点。结论：测定得到了SENV-D亚型中国分离株的基因组序列，有助于其检测方法及致病性的研究，并为研究SEN病毒的进化地位提供方便。     

我国登革2型病毒43株包膜E蛋白基因的特征

对我国1987年流行的登革2型病毒43株包膜E蛋白基因的核苷酸序列进行了分析。结果表明登革2型病毒43株包膜E蛋白基因核苷酸序列含1485个核苷酸，编码495个氨基酸，并就其核苷酸序列及其相应的氨基酸序列与其它的登革2型病毒株进行了比较，发现核苷酸序列与我国1985年分离的登革2型病毒04株，新几内亚C株（NGC），牙买加株1409（JAM）和马来西亚当地流行株M1（登革出血热）、血2（登革休克综合征）、M3（登革热）同源性分别是95.8%、94.6%、97.5%、925%、92.7%和939%，氨基酸序列的同源性分别是94.3%、94.3%、96.0%、93.7%、93.7%和91.5%，推断出的氨基酸序列显示出12个保守的半胱氨酸残基和两个潜在的糖基化位点，分别位于Asn-67和Asn-153位。