99mTc-反义寡聚核苷酸DNA肿瘤显像的实验研究

拟探讨放射性标记反义寡聚核苷酸(Antisense oligonucleotide,ASON)DNA在荷瘤裸鼠体内显像的可行性。采用两种不同肿瘤细胞系KB-G2和KB-31,并肿瘤内注射的方法;设立ASON的对照正义寡聚核苷酸(Sense oligonucleotide,SON);用聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定所用经MAG3偶联的寡聚核苷酸的杂交活性;完成99mTc-MAG3-ASON和99mTc-MAG3-SON DNA肿瘤内注射后在荷瘤裸鼠体内的显像及其生物分布研究。经MAG3偶联的寡聚核苷酸与天然寡聚核苷酸具有相同的杂交活性。在荷KB-G2瘤裸鼠肿瘤内,99mTc-MAG3-ASON DNA的分布明显高于其对照99mTc-MAG3-SON DNA的分布(14.7vs8.5%ID/g)。但在荷KB-31瘤裸鼠肿瘤内,两者的分布无显著性差异(8.6vs4.3%ID/g)。全身显像显示99mTc-MAG3-ASON DNA较其对照正义DNA寡聚核苷酸在荷KB-G2瘤裸鼠肿瘤内的靶向分布增高,但在荷KB-31瘤裸鼠肿瘤内的靶向分布则未见显著性差异。结果表明:99mTc-MAG3-ASON DNA较其对照正义DNA寡聚核苷酸在荷瘤裸鼠肿瘤内的分布有显著性统计学差异,本研究证实了活体动物体内肿瘤反义显像的可行性。     

VIP-^131Ⅰ-ASON抑制HT29细胞的生长及癌蛋白的表达

将互补于C-myc mRNA的反义寡核苷酸（ASON）进行放射性碘（^131Ⅰ，^125Ⅰ）标记，通过多聚赖氨酸与血管活性肠肽（VIP）偶联形成放射性反义复合物（VIP-^131Ⅰ-ASON，VIP-^125Ⅰ-ASON）。以正义（SON）和无义链（MON）作为对照，比较HT29结肠癌细胞对^125Ⅰ-ASON和VIP-^125Ⅰ-ASON的摄取率；利用MTT法和流式细胞计数仪检测C-myc癌蛋白方法，研究^131Ⅰ-ASON和VIP-^131Ⅰ-ASON对HT29结肠癌细胞的作用。实验结果表明。与VIP结合后，^125Ⅰ-ASON在结肠腺癌HT29细胞中的摄取率大大提高，与未结合^1251-ASON摄取率相比差异显著（P〈0．05）。VIP-^131Ⅰ-ASON对HT29细胞生长抑制作用呈剂量依赖型，且抑制作用显著强于其它各对照组（P〈0．05）。流式细胞计数表明，与VIP-^131Ⅰ-ASON组和^131Ⅰ-ASON组荧光强度明显低于其它各组（P〈0．05），而VIP-^131Ⅰ-ASON组的荧光强度又比^131Ⅰ-ASON组低（P〈0．01），表明VIP作为载体，能有效将ASON导入结肠癌细胞，明显抑制HT29结肠癌细胞的生长和C-myc癌蛋白的表达。     

99mTc-MDR1寡聚核苷酸DNAs的制备及质量控制

研究99mTc标记多药耐药基因(MDR1)mRNA反义DNAs寡聚核苷酸及其正义DNAs寡聚核苷酸的最佳标记方法并制备其二步法冰冻试剂盒,完成99mTc标记MDR1反义DNAs寡聚核苷酸和正义DNAs寡聚核苷酸及其二步法冰冻试剂盒的的质量控制.合成20个碱基单链的MDR1 mRNR的反义DNA寡聚核苷酸(ASON)及其正义DNA寡聚核苷酸(SON),全程硫代修饰并在5′末端附加氨基酸以修饰,分别将ASON和SON DNA 与MAG3偶联后用99mTc标记,制备了99mTc-寡聚核苷酸DNA二步法冰冻试剂盒.通过改变ASON-和SON-MAG3 DNAs、氯化亚锡及缓冲液的用量,调整反应介质的pH值条件,探讨其最佳标记方法.用高压液相色谱仪(HPLC)测定该药盒化合物的放射化学纯度、标记物的体内外稳定性、药盒的稳定性.99mTc-ASON-和SON-MAG3 DNAs标记化合物的放射化学纯度＞92%,标记物室温放置24 h后其放射化学纯度＞90%;药盒在-20℃条件下放置6个月,标记物的放射化学纯度仍＞90%.99mTc-寡聚核苷酸DNAs二步法冰冻试剂盒性能优良,标记方法简单、可行、有效,且标记物稳定性良好.     

Tc-MDR_1寡聚核苷酸DNAs的制备及质量控制

研究99mTc标记多药耐药基因(MDR1)mRNA反义DNAs寡聚核苷酸及其正义DNAs寡聚核苷酸的最佳标记方法并制备其二步法冰冻试剂盒,完成99mTc标记MDR1反义DNAs寡聚核苷酸和正义DNAs寡聚核苷酸及其二步法冰冻试剂盒的的质量控制。合成20个碱基单链的MDR1 mRNR的反义DNA寡聚核苷酸(ASON)及其正义DNA寡聚核苷酸(SON),全程硫代修饰并在5′末端附加氨基酸以修饰,分别将ASON和SON DNA与MAG3偶联后用99mTc标记,制备了99mTc-寡聚核苷酸DNA二步法冰冻试剂盒。通过改变ASON-和SON-MAG3 DNAs、氯化亚锡及缓冲液的用量,调整反应介质的pH值条件,探讨其最佳标记方法。用高压液相色谱仪(HPLC)测定该药盒化合物的放射化学纯度、标记物的体内外稳定性、药盒的稳定性。99mTc-ASON-和SON-MAG3 DNAs标记化合物的放射化学纯度>92%,标记物室温放置24h后其放射化学纯度>90%;药盒在-20℃条件下放置6个月,标记物的放射化学纯度仍>90%。99mTc-寡聚核苷酸DNAs二步法冰冻试剂盒性能优良,标记方法简单、可行、有效,且标记物稳定性良好。     

~（99m）Tc标记DTPA-生物素和hIgG在正常小鼠体内分布实验

目的：探讨DTPA-生物素和hIgG的99mTc标记方法,并观察标记物在体内、外的稳定性及其在正常小鼠体内分布。方法：99mTc标记DTPA-生物素采用直接标记法,99mTc标记hIgG采用2-巯基乙醇还原法,标记率及放化纯测定采用纸层析法,并分别观察99mTc-生物素和99mTc-IgG在生理盐水（NS）中的稳定性;取24只正常小鼠,分为两组,分别经尾静脉注入99mTc-生物素和99mTc-hIgG,注入剂量为7.4MBq/100μl,于注入后1h、3h、6h、12h行SPECT显像并处死小鼠分离各脏器,测量放射性计数,计算各脏器每g组织百分注射剂量（%ID/g）。结果：99mTc标记DTPA-生物素的标记率〉80%,99mTc标记hIgG的标记率〉70%,99mTc-hIgG的放化纯〉90%;在NS中温育12h未观察到99mTc-生物素和hIgG放化纯度明显降低;体内生物分布显示99mTc-生物素肾内摄取高,主要经泌尿系统排泄;99mTc-hIgG在体内主要分布于肝、脾、肾,且在血液中存留时间较长。结论：99mTc标记DTPA-生物素和hIgG具有良好的标记率及体外稳定性,小鼠体内分布实验表明,99mTc-生物素和99mTc-hIgG体内分布的明显不同,为下一步基于亲和素-生物素系统预定位技术各组分的应用提供实验依据。     

肺癌特异性靶向小分子多肽的核素分子探针的制备

目的:研究用NHS-MAG3作为双功能螯合剂进行99mTc标记针对肺癌特异性靶向小分子多肽的核素分子探针的制备方法.方法:利用组合化学肽库技术筛选得到与非小细胞肺癌(A549)发生特异性结合的小分子多肽cNGQGEQc,在合成多肽的过程中直接完成多肽与双功能螯合剂NHS-MAG3的偶联,然后采用氯化亚锡直接进行99mT...     

N-乙酰半胱氨酸对慢性间歇缺氧大鼠海马神经元凋亡及氧化应激的影响

目的：探讨N-乙酰半胱氨酸(NAC)对慢性间歇缺氧(CIH)模型大鼠海马组织氧化应激及海马神经元凋亡的影响。方法:30只雄性Wistar大鼠随机分为慢性缺氧组、NAC治疗组及正常对照组3组，每组10只。采用化学比色法测定海马组织丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)水平，同时应用免疫组化方法检测海马CA1 区磷酸化JNK(p-JNK)表达水平，应用TUNEL法检测海马CA1区神经元凋亡率。结果:NAC治疗组 MDA水平低于CIH组（1.71±0.43 vs 1.37±0.26，P＜0.05）、SOD活性高于CIH组（44.94±14.01 vs 57.66±14.07，P＜0.05），p-JNK表达水平低于CIH组 （0.53±0.10 vs 0.39±0.16，P＜0.05），海马神经元凋亡率显著低于CIH组（0.32±0.18 vs 0.20±0.11，P＜0.05）。结论:NAC能抑制慢性间歇缺氧导致的氧化应激，从而影响JNK信号转导通路，减少海马神经元凋亡。     

血管平滑肌细胞体外摄取寡核苷酸探针的研究

目的:以99mTc标记针对c-myc和bcl-2 mRNA的寡核苷酸并检测其在血管平滑肌细胞(VSMC)中的摄取情况,初步探讨其在粥样硬化病变中的诊断价值。方法99mTc标记寡核苷酸后分别加入体外培养对数生长期及平台期猪冠状动脉VSMC,37℃条件下温育,检测不同时段摄取百分数。结果:增殖期或平台期VSMC对bcl-2探针的摄取均低于对c-myc探针的摄取。在c-myc探针组,增殖期细胞较平台期摄取高反义探针较正义探针摄取高。结论:增殖期VSMC对c-myc反义探针的摄取增高和(或)对bcl-2反义探针的摄取减少,有望成为粥样病变的早期诊断指标。     

自身免疫性甲状腺病患者血清免疫球蛋白及甲状腺自身抗体、ANA、抗ENA抗体变化及临床意义

目的 探讨自身免疫性甲状腺病(AITD)患者血清免疫球蛋白及甲状腺自身抗体、抗核抗体(ANA)、抗可溶性抗原(ENA)抗体水平变化及临床意义.方法 选取2017年1月1日至2020年8月1日我院收治的110例AITD患者作为研究对象,包括桥本甲状腺炎(HT)和毒性弥漫性甲状腺肿(GD),其中HT组共62例,GD组共48例,另外选取同期60例健康体检者作为对照组,采集所有受检者静脉血,应用免疫学方法分别检测其血清免疫球蛋白以及甲状腺自身抗体、ANA、抗ENA抗体水平.结果 3组自身免疫球蛋白IgM、IgG和IgA水平比较差异均具有统计学意义(P＜0.05),其中HT组患者IgM和IgG水平显著高于对照组(P＜0.05),GD组患者IgG和IgA水平显著高于对照组(P＜0.05),且HT组IgM和IgG水平显著高于GD组,IgA水平显著高于GD组(P＜0.05);3组TPOAb和TGAb水平比较差异均具有统计学意义(P＜0.05),其中HT组明显高于GD组和对照组,GD组明显高于对照组(P＜0.05);在AITD患者中ANA和抗双链DNA (ds-DN A)抗体阳性率显著高于对照组(P＜0.05),抗U1-RNP抗体阳性率比较差异无统计学意义(P＞0.05);而在所有受检者中均未检出ENA谱中其他抗体.结论 血清免疫球蛋白和血清甲状腺自身抗体检测对AITD的临床鉴别诊断具有一定积极的指导意义;ANA与抗ENA抗体在AITD中并无特异性,关于其确切病理机制和意义有待进一步深入研究.     

^99mTc—HL9l肿瘤乏氧显像的动物实验

目的　用99mTc -HL91乏氧显像剂对肺腺癌小鼠模型进行体内分布和显像实验 ,以探索其对肿瘤显像的适用性 .方法　99mTc -HL91一步法标记 ,放化纯 >95 % .对 15只肺腺癌动物模型腹腔注射99mTc -HL9118 5MBq ,于 1～ 2 4小时处死取血液、肿瘤、脑、肺、心、肝、脾、肾、骨等标本称重 ,测定放射性计数 ,计算ID % /g及肿瘤组织与非肿瘤组织放射性比值 (T/NT) .同时在腹腔注射99mTc-HL91后于不同时间对模型进行静态显像 .结果　肿瘤组织对99mTc-HL91有较早较高的摄取和滞留 ,T/NT比值随时间延长而有增高趋势 .显像示肿瘤组织有较好的放射性浓聚 ,图像清晰 ,对比度良好 .结论　99mTc-HL91标记简单 ,标记率高 ,使用方便 ,在肿瘤组织中有较好的摄取与滞留 ,是一种良好的肿瘤乏氧显像剂 ,但需要进一步研究其机理和改进方法 ,提高T/NT比值 ,以开展临床试验     

99Tcm标记抗PSMA单克隆抗体在荷瘤裸鼠体内的生物分布

目的研究99Tcm-抗前列腺特异性膜抗原(PSMA)抗体(J591)对前列腺癌细胞体外结合性能、在荷人前列腺癌裸鼠体内生物分布。方法用改进的Schwarz方法进行99Tcm标记,经Sephadex G-50柱分离纯化;用纸层析法和三氯醋酸法测定标记率与放化纯;用流式细胞术测定抗体与肿瘤细胞在体外的结合性能;PSMA阳性的C4-2前列腺癌裸鼠为实验组,PSMA阴性的PC3前列腺癌裸鼠为对照组,裸鼠静脉注射7.5 MBq(25μg/只)99Tcm-J591,分别于2、6、12及24h测定体内放射性分布,计算每克组织百分注射剂量率(%ID/g)及T/NT比值。结果表明99Tcm–J591标记率为(78.9±6.2)%,放化纯90%。J591与99Tcm–J591在体外能结合PSMA阳性的C4-2细胞,与PSMA阴性的PC3细胞不结合,显示出J591具有良好的特异性。生物分布实验显示:实验组裸鼠肿瘤部位出现99Tcm浓聚,对照组则没有。肿瘤组织百分注射剂量率(%ID/g)在12h达高峰,为(15.91±5.16)%ID/g,与对照组(3.22±1.33)%ID/g相比差异有统计学意义(P0.05),其余组织和器官的百分注射剂量率在两组间差异无统计学意义(P0.05)。结论 J591具有良好的免疫活性和对前列腺癌的靶向定位性能,可望用于前列腺癌的导向诊断及导向治疗。     

VIP-131I-ASON抑制HT29细胞的生长及癌蛋白的表达

将互补于C-m yc mRNA的反义寡核苷酸(A SON)进行放射性碘(131I,125I)标记,通过多聚赖氨酸与血管活性肠肽(V IP)偶联形成放射性反义复合物(V IP1-31I-A SON,V IP1-25I-A SON)。以正义(SON)和无义链(M ON)作为对照,比较HT 29结肠癌细胞对125I-A SON和V IP1-25I-A SON的摄取率;利用M TT法和流式细胞计数仪检测C-m yc癌蛋白方法,研究131I-A SON和V IP1-31I-A SON对HT 29结肠癌细胞的作用。实验结果表明,与V IP结合后,125I-A SON在结肠腺癌HT 29细胞中的摄取率大大提高,与未结合125I-A SON摄取率相比差异显著(P<0.05)。V IP1-31I-A SON对HT 29细胞生长抑制作用呈剂量依赖型,且抑制作用显著强于其它各对照组(P<0.05)。流式细胞计数表明,与V IP1-31I-A SON组和131I-A SON组荧光强度明显低于其它各组(P<0.05),而V IP1-31I-A SON组的荧光强度又比131I-A SON组低(P<0.01),表明V IP作为载体,能有效将A SON导入结肠癌细胞,明显抑制HT 29结肠癌细胞的生长和C-m yc癌蛋白的表达。     

99mTc—HSA（FSA）药盒的制备研究

目的 研制一种快速、简便、可靠的~99nzTc标记的心血池显像剂.方法 用二氧硫脲(FSA)作人血清白蛋白(HSA)还原剂,用放射性直接标记方法制备~99nzTc标记一步法药盒,测定该药盒及其标记产物的~99nzTc-HSA的理化性质、还原蛋白巯基(-SH)数目及生物性能.结果 对还原后的HSA进行了~99nzTc的标记,放化纯度大于95%,标记后室温放置24小时,放化纯度仍大于95%,体外稳定性很好,小鼠体内分布血中浓度高且较稳定.结论 采用该方法制备的药盒明显提高了~99nzTc-HSA在小鼠体内血中浓度,与~99nzTc-二亚乙基三胺五乙酸一人血清白蛋白(~99nzTc-DTPA-HSA)小鼠体内分布数据二者无显著差异,宜于临床进一步研究.     

抗ProGRP(31-98) scFv的131I标记及生物分布研究

目的 研究抗胃泌素释放前体（ProGRP（31-98）单链抗体（scFv）的131I标记方法,并对其标记后的稳定性、免疫活性及生物分布进行分析.方法 采用氯胺T法碘化标记制备131I-anti-ProGRP（31-98）scFv,凝胶柱层析法分离纯化标记产物,利用纸层析法测定标记物的标记率、放化纯度和稳定性,采用细胞结合分析法比较131I-anti-ProGRP（31-98）scFv对小细胞肺癌细胞株NCI-H446和肺腺癌细胞株A549的免疫结合率.将131I-ProGRP（31-98）scFv注射入动物体内,研究其在实验动物体内的分布情况.结果 131I-anti-ProGRP（31-98）标记率为（93.35±0.67）％,标记产物纯化后即刻放化纯度为（98.49±1.21）％.131I-anti-ProGRP（31-98）scFv对人小细胞肺癌NCI-H446和肺腺癌A549细胞株的免疫结合率分别为（85.36±1.45）％和（21.02±2.16）％,且差异有统计学意义（P＜0.05）.131I-anti-ProGRP（31-98）scFv在实验动物体内主要通过肾脏和肝脏代谢,血液清除快.结论 131I-anti-ProGRP（31-98） scFv的标记率高,且有良好的稳定性和免疫活性,在实验动物体内主要通过肝脏和肾脏代谢,血液清除快.     

cRGD肽二聚体对B16黑色素瘤细胞的体外抑制作用及在荷瘤鼠体内分布及显像研究

目的 探讨cRGD肽二聚体对B16黑色素瘤细胞的体外抑制作用及其在荷B16黑色素瘤细胞小鼠动物模型体内的分布及显像研究.方法 用MTT法检测不同浓度及作用时间cRGD肽二聚体对B16黑色素瘤细胞体外增殖能力的影响.采用直接标记法标记99 Tcm-c(RGD)2.建立荷B16黑色素瘤株动物模型,待肿瘤体积为1.0 ～ 1.5cm3左右时,分别于30min、1h、2h、3h、4h、5h及6h时,进行荷瘤鼠体内生物分布及动态显像研究.结果 cRGD肽二聚体浓度为500mg/L、作用48h时,对B16黑色素瘤细胞的增殖具有明显的抑制作用.室温下、ρ(SnCl2·2H20)=1 g/L、反应时间为30 min时,99Tcm-c(RGD)2的标记率可达(87.42±3.21)％,标记产物经Sephadex G10分离纯化后放射化学纯度大于95％;静脉注射后30min行小鼠全身SPECT显像,肿瘤部位可见明显显像剂聚集,但肿瘤与周围组织的对比度较低;延迟至6小时肿瘤仍清晰可见,且随时间延迟肿瘤与周围组织的对比度增高,此时肿瘤/血液为2.15±0.24,肿瘤/肌肉为5.07 ±0.03.结论 该结构cRGD肽二聚体对B16黑色素瘤细胞株具有一定的体外抑制作用,且动物体内肿瘤组织摄取率高,显像清晰,证明其可进一步应用于聚合物多肽靶向药物的研发.     

Preparation of 67Ga-labeled antibodies using deferoxamine as a bifunctional chelate. An improved method

Radionuclides or anti-cancer drugs may be coupled to antibodies for specific transport to target tissues. We have previously reported that several proteins could be rapidly and efficiently labeled with gallium (67Ga) by using deferoxamine (DFO) as a bifunctional chelating agent. In the present paper, we have described the use of hetero-bifunctional agents for the conjugation of DFO with antibodies and investigated the effect of coupling agents on in vitro properties and biodistribution of 67Ga-labeled antibodies. 67Ga-labeled monoclonal antibodies retained antigen-binding activity when prepared under optimum conditions. The use of hetero-bifunctional reagents, such as succinimidyl 6-maleimido-hexanoate (EMCS) or N-succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)-propionate (SPDP), which link thioether bonds and disulfide bridges prevented the formation of polymerized antibodies. Although high non-specific uptake in the liver was observed with radiolabels prepared by the homo-bifunctional agent glutaraldehyde, uptake in the liver was low with conjugates linked by hetero-bifunctional agents. 67Ga-labeled antibodies with thioether bonds showed in vivo stability, but the clearance from the circulation was the fastest with the radiolabel holding disulfide bonds. The coupling reagents used to link DFO and antibodies greatly influenced both in vitro properties and in vivo distribution of labeled antibodies and 67Ga-labeled antibodies provide a good model for the study of coupling methods and biodistribution of antibody conjugates.