副溶血弧菌检测方法研究进展

副溶血弧菌是海产品中常见致病菌,可引起恶心、呕吐、腹痛、腹泻等疾病。由于我国是海产品消费大国,所以必须建立快速、准确、灵敏的方法监测海产品中的副溶血弧菌。目前主要应用分子生物学方法和分析化学方法,从细胞水平和分子水平来检测副溶血弧菌,主要包括实时荧光定量PCR和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDITOF MS),这两种方法可以对副溶血弧菌进行准确定性和定量,是检测食品中副溶血弧菌的快速、特异、灵敏的方法,可用来评估和监管海产品污染副溶血弧菌的风险,保证人们的饮食安全。     

海口市市售贝类海产品副溶血性弧菌污染调查及耐药和毒力基因研究

目的了解海口市市售贝类海产品中副溶血性弧菌的污染情况、菌株血清学分型情况以及不同来源菌株的耐药情况,分析海口市市售贝类海产品受副溶血性弧菌污染的特点。方法 2014—2016年,按照GB 4789.7—2013《食品安全国家标准食品微生物学检验副溶血性弧菌检验》和《国家食品污染和有害因素风险监测工作手册》对五类海产品(白贝、排海、毛蚶、蛏子、芒果螺)进行副溶血性弧菌分离鉴定和血清学分型,采用实时荧光聚合酶链式反应(PCR)进行毒力基因检测,采用K-B法对分离菌株进行相关耐药分析。结果五类海产品样品共157份,其中65份样品检出副溶血性弧菌,白贝的检出率最高,为63.6%(21/33)。所分离的65株副溶血性弧菌主要血清群为O3和O5,完全分型26株,总体分型率为40.0%,其中以O1∶K25为主要血清型。65株菌对氨苄西林普遍耐药(95.4%,62/65),对头孢噻肟的中介率较高(33.8%,22/65),对8种抗生素产生了5种耐药谱。65株分离菌株神奈川试验结果均为阴性,且均未检出与致病性相关的耐热直接溶血素(TDH)及耐热相关溶血素(TRH)。结论海口市市售贝类副溶血性弧菌污染较重,应加强养殖区域海水水质的监测力度,预防副溶血性弧菌感染。     

荧光染料EMA在实时荧光PCR定量检测海产品中致病性副溶血弧菌活细胞中的应用

将荧光染料--叠氮溴乙锭(ethidium bromide monoazide,EMA)与实时荧光-聚合酶链式反应(real-time polymerase chain reaction,RT-PCR)技术相结合,对其在RT-PCR定量检测海产品中致病性副溶血弧菌活细胞中的应用进行研究。纯培养条件下,在2.2×102～2.2×107CFU范围内细胞数的常用对数值与Ct值之间呈严格的负相关性,并且不添加EMA时的检测灵敏度(22CFU)略大于添加EMA(2.2×102CFU)时的检测灵敏度;人工污染牡蛎样品,利用RT-PCR和EMA RT-PCR以及平板计数法分别进行副溶血弧菌定量检测,结果表明EMA RT-PCR更接近于平板计数的结果,单纯RT-PCR定量的结果偏大;在采集的45份海产品样品中,不经富集培养,利用EMA RT-PCR方法仅有一份牡蛎样品呈阳性,牡蛎样品污染程度为114CFU/g。该方法能够快速、灵敏、准确地进行海产品中致病性副溶血弧菌活细胞的定量检测,具有很好的应用价值。     

巢式PCR快速检测海产品中的副溶血弧菌

副溶血弧菌是一种世界范围性的食源性致病菌,食用了该菌污染的海产品可导致胃肠炎等疾病。为了建立一种可快速、特异地检测海产品中副溶血弧菌的方法,通过把副溶血弧菌基因组序列和其它不同种类弧菌的基因组序列进行比较分析,筛选出了一个副溶血弧菌特异性的标记基因-VP1331,根据该基因建立了副溶血弧菌的巢式PCR快速检测方法,并评估了其特异性、敏感性和稳定性。实验结果表明,该方法只有在以副溶血弧菌基因组DNA为模板时才能扩增出目的片段,而其它11种弧菌和非弧菌均不能扩增出目的片段。该方法的最低检测限为副溶血弧菌基因组DNA 10 fg、纯培养物6.6 CFU。人工污染实验表明,初始菌液浓度为25.7 CFU/100 mL时只需经过2 h的增菌培养即可检出。上述结果表明,VP1331基因可以作为副溶血弧菌种特异性标记,本方法可以用于污染海产品中该菌的检测与鉴定。     

巢式PCR快速检测海产品中的副溶血弧菌（英文）

副溶血弧菌是一种世界范围性的食源性致病菌,食用了该菌污染的海产品可导致胃肠炎等疾病。为了建立一种可快速、特异地检测海产品中副溶血弧菌的方法,通过把副溶血弧菌基因组序列和其它不同种类弧菌的基因组序列进行比较分析,筛选出了一个副溶血弧菌特异性的标记基因-VP1331,根据该基因建立了副溶血弧菌的巢式PCR快速检测方法,并评估了其特异性、敏感性和稳定性。实验结果表明,该方法只有在以副溶血弧菌基因组DNA为模板时才能扩增出目的片段,而其它11种弧菌和非弧菌均不能扩增出目的片段。该方法的最低检测限为副溶血弧菌基因组DNA 10 fg、纯培养物6.6 CFU。人工污染实验表明,初始菌液浓度为25.7CFU/100 m L时只需经过2 h的增菌培养即可检出。上述结果表明,VP1331基因可以作为副溶血弧菌种特异性标记,本方法可以用于污染海产品中该菌的检测与鉴定。     

基于DNA染料EMA的RT-PCR技术定量检测海产品中病原性副溶血弧菌活细胞

将一种DNA染料叠氮溴化乙锭(ethidium bromide monoazide,EMA)与实时定量聚合酶链式反应(RT-PCR)技术相结合,建立一种能选择性定量检测牡蛎中trh阳性副溶血弧菌活细胞的新方法。结果表明：使EMA成功插入死细胞DNA并且光解溶液中游离EMA的最佳曝光时间为20min;不抑制副溶血弧菌活细胞DNA扩增的最大EMA质量浓度为2.0μg/mL;完全抑制热致死细胞DNA扩增的最小EMA质量浓度为1.0μg/mL;人工污染牡蛎样品,不经过富集,在2.0×103～2.0×107CFU范围内细胞数的常用对数值与Ct值之间呈严格的负相关性,并且纯培养与人工污染牡蛎样品的RT-PCR检测限均为2×103CFU,即人工污染牡蛎样品的RT-PCR检测灵敏度为每克牡蛎样品400个活细胞;冻融实验表明,在温度低于55℃的水浴中对冷冻海产品进行解冻时,冻融过程对副溶血弧菌活细胞几乎没有影响。该方法是一种快速、灵敏且能有效鉴别并定量检测病原活细胞的新方法。     

烟台海域海产品中食源性致病菌污染状况调查及膳食风险分析

目的了解烟台濒临的黄海和渤海海域海产品中食源性致病菌污染分布特征,掌握致病菌污染的"基线值",为市场监管、消费指导和风险预警提供数据支持。方法按照GB 4789规定的方法,进行6种食源性致病菌检测。借助快速微生物定量风险评估(s QMRA)方法,评价海产品中副溶血性弧菌的感染风险。结果 6类260种海产品中仅有副溶血性弧菌阳性检出,创伤弧菌、金黄色葡萄球菌、沙门菌、单增李斯特菌和大肠杆菌O157:H7均未检出。海产品中副溶血性弧菌总体污染率为19.62%(51/260),贝类、甲壳类污染水平较高,鱼类、海藻类偏低,污染率分别为26.42%(28/106)、20.00%(6/30)、10.00%(3/30)、10.00%(3/30);贝类中牡蛎是副溶血性弧菌高污染的海产品,污染率为31.03%(9/29)。普通人群摄食加热海产品后副溶血性弧菌致病风险概率值为2.97×10-7,年均患病率为6.03×10~(-6)次/人年,7~9月份为高发病时间段。结论烟台海域鲜活海产品主要存在副溶血性弧菌的污染,摄食人群具有潜在的感染风险,尤其温度较高的第三季度。     

2008—2010年上海市夏秋季市售海产品中副溶血性弧菌污染监测结果分析

目的 了解上海市夏秋季节市售海产品中副溶血性弧菌的污染水平和特征.方法 2008-2010年5-10月,采用GB/T 4789.7-2008《食品卫生微生物学检验副溶血性孤菌检验》方法,对上海市批发市场、集贸市场、卖场超市和餐饮单位等污染物监测点的市售海产品进行副溶血性弧菌的定性和定量检测.结果 共监测市售海产品941件,副溶血性弧菌总体检出率为13.2％,不同种类、不同监测月份和不同采样地点的海产品,其副溶血性弧菌检出率和样品几何平均浓度总体上差异有统计学意义(P＜0.05).其中,海产虾类副溶血性弧菌检出率(25.0％)和样品几何平均浓度(5.0 MPN/g)显著高于其他类海产品(P＜0.05);8月份海产品副溶血性弧菌检出率(27.4％)和样品几何平均浓度(3.3 MPN/g)显著高于其他监测月份(P＜0.05);集贸市场副溶血性弧菌检出率(28.5％)和批发市场样品几何平均浓度(3.9 MPN/g)显著高于其他采样地点(P＜0.05).结论 上海市市售海产品中副溶血性孤菌的污聚率较高,应进一步开展海产品中副溶血性弧菌的风险监测和评估,并针对副溶血性弧菌污染的高风险环节开展监管.     

水产品中致病性弧菌污染状况研究

目的了解水产品中致病性弧菌污染状况。方法采用实时荧光PCR方法对样品中的致病性弧菌进行初筛,阳性样品用传统培养法确证。结果检测了海产品、淡水水产品共12类1 356份样品,未检出致病性的O1群霍乱弧菌,但有非O1群霍乱弧菌存在;海产品的虾类、蟹类、贝类、软体类带副溶血性弧菌率高。结论珠海地区水产品中弧菌污染较为普遍,且存在着多重污染现象。     

漳州水产养殖环境中副溶血弧菌的流行状况分析

为探究漳州市养殖环境中副溶血弧菌流行状况和基因多态性,无菌采集2019年1～7月份本地区7个养殖场中罗非鱼、石斑鱼和虾的新鲜样品。用硫代硫酸盐柠檬酸盐胆盐蔗糖琼脂培养基（thiosulfate citrate bile salts sucrose agar culture medium, TCBS）对样品的疑似副溶血弧菌进行分离纯化,用聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）扩增tlh基因和16S rDNA基因片段并测序,鉴定疑似菌株。用随机扩增多态性法（random amplified polymorphic DNA, RAPD）对分离株进行分型。实验共采集228份样品,微生物学初筛得到111株疑似菌株,PCR检测并测序鉴定69株为副溶血弧菌,阳性率为30.26%。RAPD技术对分离株分型,得到了较清晰的电泳条带,分析指纹图谱发现69株副溶血弧菌可分为9个主要类型,遗传相似性在83%～100%范围内。养殖场中的水产品一定程度上受到副溶血弧菌的污染,且不同水产品、不同养殖场、不同时间副溶血弧菌的污染程度都不同。     

食源性副溶血弧菌脉冲场凝胶电泳分型

副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是-种革兰氏阴性嗜盐杆菌,广泛分布于近岸海水、海底沉积物和海产品中,是引起食源性疾病的主要病源之一.尤其在我国沿海地区,由副溶血弧菌引发的食物中毒的发生规模及人群暴露规模呈明显上升趋势.因此,快速准确的检测鉴定副溶血弧菌成为控制其引起的食源性疾病的关键.本文以从海产品中分离的副溶血弧菌为研究对象,利用脉冲场凝胶电泳技术对副溶血弧菌进行分子分型,为副溶血弧菌引起的食源性疾病溯源及副溶血弧菌的分子流行病学研究提供技术基础.     

海产品中副溶血弧菌检测方法研究进展

副溶血弧菌是主要的食源性致病菌之一,主要存在于鱼虾贝等海产品中。人们在食用被副溶血弧菌感染的海产品时,容易出现腹泻、呕吐、腹痛等急性肠胃炎症状。本文主要介绍了副溶血弧菌的分子生物学、免疫学等几种快速检测方法,并对未来的发展前景做了展望。     

褶牡蛎体内菌落结构分析及创伤弧菌的定量检测

食用被致病菌污染的牡蛎常引起食品安全问题。采用16S rDNA克隆文库法研究褶牡蛎体内的菌落结构,用荧光定量PCR技术对样品体内的副溶血弧菌、沙门氏菌、创伤弧菌和钩端螺旋体进行定性、定量检测。研究结果表明:褶牡蛎体内的优势菌属为螺旋体属和类杆菌属,分别占总菌数的39.21%和23.53%;样品中含有创伤弧菌,含量为(8.48±0.48)×103cfu/g,而副溶血弧菌、沙门氏菌和钩端螺旋体未检测到。     

副溶血弧菌毒力基因的检测研究

为了解不同来源的副溶血弧菌携带毒力基因的情况,对杭州地区临床和海产品中分离到的174株副溶血弧菌采用ehelex100法提取基因组DNA,并进行溶血素基因tdh和trh的PCR检测.结果显示,Chelex100法能够简单、快速地提取副溶血弧菌基因组DNA,以满足PCR检测条件的需要.在杭州地区副溶血弧菌感染的病例中,tdh阳性和trh阴性菌占主导地位,其中84株临床分离株中携带tdh基因的比例为92.86%,携带trh基因的比例为2.38%;90株海产品中仅检测出1株tdh阳性菌和2株trh阳性菌,分别占1.11%和2.22%,96.67%海产品中未检测出tdh和trh基因;海产品中携带tdh或trh的副溶血弧菌有增长的趋势,是潜在的危险病源.     

同时检测海产品中副溶血弧菌和霍乱弧菌的合检方法评价研究

目的建立水产品中副溶血弧菌和霍乱弧菌合检方法,并对合检方法对比进行评价。方法利用副溶血弧菌和霍乱弧菌阳性菌株,制备纯菌液、不同浓度梯度的人工污染样品。通过对30份纯菌液、30份人工污染样品和250份实际样品的检测,将建立的合检方法与行业标准(SN/T 1022-2010进出口食品中霍乱弧菌检验方法和SN/T 0173-2010进出口食品中副溶血性弧菌检验方法)进行比较,对合检方法进行效果评价。结果实验结果表明副溶血弧菌和霍乱弧菌合检方法,与行业标准检测结果完全一致。结论该方法可靠,对实验仪器和操作人员的要求低,具有良好的实用性,适合基础检测实验室。     

2016年北京市海产品中创伤弧菌的污染调查及两种检测方法比较

目的 对北京市市售海产品的创伤弧菌污染情况进行调查,并比较实时荧光聚合酶链式反应(RT-PCR)法与VITEK鉴定方法检测结果的一致性。方法 采用传统检验方法结合分子生物学方法对在北京市市场随机采集的105份海产品进行创伤弧菌检验,并比较了RT-PCR法和VITEK鉴定方法的准确性。结果 105份海产品中,有40份样品检出创伤弧菌,检出率为38.10%;其中,虾类产品检出率高达52.38%(11/21),其次为贝类产品(37.88%,25/66)和鱼类产品(22.22%,4/18)。经rpoB基因测序验证,RT-PCR和VITEK方法的准确率分别为100.00%(40/40)和67.50%(27/40)。结论 北京市海产品中存在创伤弧菌的污染,应对海产品中创伤弧菌引起食源性污染的潜在风险进行评估,预防食物中毒的发生。     

2017年广西壮族自治区5个城市贝类海产品致病性弧菌污染状况分析

目的 了解广西壮族自治区贝类海产品中副溶血性弧菌、创伤弧菌、溶藻弧菌和霍乱弧菌的污染现状,为食源性疾病防控和微生物风险评估提供参考依据。方法 2017年在广西壮族自治区3个沿海和2个内陆城市采集贝类海产品进行定性检测,其中副溶血性弧菌同时进行定量检测和毒力基因检测。结果 5个城市共采集800份贝类海产品,致病性弧菌总阳性率为76.5%(612/800),副溶血性弧菌、创伤弧菌和霍乱弧菌阳性率分别为73.9%(591/800)、18.4%(147/800)、0.1%(1/800),未检出溶藻弧菌。副溶血性弧菌阳性率与采样地区、样品状态和贝类品种有关,沿海地区阳性率高于内陆地区,但含量却低于内陆地区;活产品阳性率和含量均高于鲜/冰鲜海产品;蛏子、泥蚶、牡蛎和蛤/蚬子阳性率较高,均在75.0%以上,扇贝和贻贝阳性率相对较低,但含量较高;1.0%(6/591)的菌株检出致病性毒力基因。创伤弧菌阳性率与样品来源、采样地区和贝类品种有关,沿海地区高于内陆地区,农村高于城市,蛏子和泥蚶阳性率最高,均在35.0%以上。结论 广西壮族自治区贝类海产品中副溶血性弧菌和创伤弧菌污染较严重,需重点加强贝类海产品食品安全卫生宣教,加强沿海农村地区创伤弧菌监测。     

广州市售海产品中副溶血弧菌分离菌株的鉴定及其耐药性分析

对8株分离自广州市售海产品中的副溶血弧菌菌株进行鉴定,并分析了其耐药性。于2017年4～5月采集市售海产品,按照国标法对其中的副溶血弧菌进行分离鉴定,并进行16S r DNA同源性比较。采用K-B纸片法和结晶紫染色法分别评估了副溶血弧菌菌株对20种常见抗生素的药物敏感性及其生物膜形成能力。结果表明,8株分离菌株对多粘菌素B、头孢他啶、庆大霉素、强力霉素、氯霉素、红霉素、环丙沙星、萘啶酸这8种抗生素均为敏感,对青霉素、万古霉素2种抗生素均显示耐药,对其他10种抗生素有不同程度的耐药性。相比ATCC17802菌株,分离菌株多重耐药性更为显著,耐抗生素数量为3～10种。分析菌株的生物膜形成能力,发现其耐药性与生物膜形成能力呈正相关。海产品中副溶血弧菌耐药性普遍且多重耐药性显著的现象,应该予以广泛关注和重视。     

上海市售海产品中副溶血性弧菌的分布状况

海产品中副溶血性弧菌引起的食物中毒已成为我国沿海地区细菌性食物中毒的首要病原。本研究中针对上海市闵行区某农贸市场的海产品开展为期1年的调查分析,共采集257份样品。按照国家标准(GB/T4789.7-2008),以硫代硫酸钠柠檬酸胆盐蔗糖培养基(TCBS)和科玛嘉弧菌显色培养基(CV)两种选择性培养基辅助分离副溶血性弧菌疑似菌株,结合生化试验和PCR方法对疑似菌株进行鉴定,从84份阳性样本中获得107株副溶血性弧菌分离株。其结果表明:该农贸市场市售海产品中副溶血性弧菌的污染率为32.7%,其中牡蛎中副溶血性弧菌污染率最高(达54.4%),蛤蜊和海瓜子次之(分别为33.9%,25.6%)。牡蛎中副溶血性弧菌的污染水平与季节性变化直接相关。对107株分离株的主要毒力基因tdh和trh进行PCR筛查,tdh阳性菌株为10株,trh阳性菌株为1株,并且此株菌为tdh、trh双阳性菌株,tdh和trh的携带率分别为9.4%和1.0%,tdh、trh双基因的携带率为1.0%。结论:市售海产品中副溶血性弧菌污染状况较为严重。这为政府相关职能部门开展食品安全防控提供了参考依据。     

磁珠提取技术在副溶血弧菌检测中的应用

副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是一种常见的食源性致病菌,为解决副溶血弧菌检测步骤复杂且周期长的问题,研究开发了一种磁珠提取与PCR联用技术快速检测食品中的副溶血弧菌。首先通过碱性共沉淀法完成Fe3O4磁珠的制备,随后在室温条件下通过水解正硅酸乙酯完成Fe3O4@SiO2磁珠制备。探讨了正硅酸乙酯添加量对Fe3O4@SiO2磁珠粒径和磁性的影响。以DNA提取能力为目标,已知浓度DNA为提取对象,分析了Fe3O4@SiO2磁珠粒径和提取体系pH值对Fe3O4@SiO2磁珠与DNA结合能力的影响。结果表明,Fe3O4@SiO2磁珠结合副溶血弧菌DNA的较佳粒径为105.89nm、Fe3O4@SiO2磁珠的SiO2层为25nm,此条件下Fe3O4@SiO2磁珠表面光滑、分散性良好、饱和磁化强度高,在磁场的作用下10s即可完成副溶血弧菌DNA与杂质的分离,副溶血弧菌DNA的提取率高达80%(提取体系pH值为5.0)。采用优化后的Fe3O4@SiO2磁珠进行DNA提取,结合PCR联用技术,对92份市售水产样品(32份对虾、25份牡蛎、35份贻贝)进行副溶血弧菌筛查。结果表明,Fe3O4@SiO2磁珠提取的DNA均可直接用于PCR检测,被测水产样品中有17份样本的副溶血弧菌检测结果为阳性。此技术与国标检测方法(GB 4789.7—2013)相比,检测时间由一周缩短至4h,提高了副溶血弧菌的检测效率。磁珠提取结合PCR联用技术可检测不同食品中的多种微生物菌种,此研究为食品中的微生物快速检测提供了一种实用新方法。