肝细胞生长因子体外对肝癌细胞HepG2增殖和凋亡的影响

目的:探讨肝细胞生长因子(HGF)对肝癌细胞 HepG2 增殖和凋亡的影响. 方法: 人肝癌细胞株 HepG2加入不同浓度HGF(0, 1, 10, 50 μg/L) 培养2, 4, 6 d,应用MTT 法检测细胞增殖情况,流式细胞仪检测细胞周期及凋亡百分率的变化,免疫细胞化学法检测增殖细胞核抗原(PCNA)的表达. 结果: HGF 抑制 HepG2 细胞增殖呈剂量及时间依赖性,并诱导其凋亡[50 μg/L HGF,培养时间为4, 6 d,其抑制率: (30.7±10.2)%, (49.8±11.1)% vs 1 μg/L HGF: (10.7±11.2)%, (4.2±9.4)%; P《0.05, P《0.01]. 随着HGF浓度增大S期细胞明显减少[试验组10, 50 μg/L HGF: (7.5±4.4)%, (7.8±1.6)% vs对照组0 μg/L HGF: (16.6±2.8)%; P《0.05, P《0.01],同时可见G0/G1 期细胞累积现象[试验组10, 50 μg/L HGF: (80.5±3.2)%, (73.1±3.9)% vs对照组0 μg/L HGF:(59.6±6.2)%; P《0.05, P《0.01]. 试验组 G1 峰前出现明显的凋亡峰,凋亡率亦较对照组显著增加(P《0.05). 且试验组细胞 PCNA 表达明显高于对照组. 结论: HGF 对肝癌细胞 HepG2 有抑制增殖和诱导其凋亡的作用,诱导细胞 G0/G1 期阻滞为可能机制之一.     

丹芍化纤方对CCl4损伤大鼠原代肝细胞保护作用的研究

目的探讨丹芍化纤方抗肝纤维化作用的机制。方法采用Ⅳ型胶原酶消化及Ficoll密度梯度离心的方法，分离、培养大鼠肝细胞，先加入5％、10％和20％药物血清干预体外培养的肝细胞24h，再用四氯化碳（CCl4）蒸熏法制造肝细胞损伤模型。分别用MTT法及荧光实时定量PT—PCR（Real Time RT—PCR）法检测CCl4损伤肝细胞的增殖、天冬氨酸特异的半胱氨酸蛋白酶-3（cysteinyl aspartate—specific protease，cas—pase-3）mRNA表达，并检测细胞培养上清中的谷草转氨酶（aspartatetransaminase，AsT）活性。结果丹芍化纤方药物血清能促进损伤肝细胞的增殖，下调肝细胞内caspase-3mRNA的表达，降低培养上清中的AST活性，与正常大鼠血清比较差异有显著性，呈明显的血清浓度依赖关系。结论丹芍化纤方抗肝纤维化机制与其抑制肝细胞凋亡、保护肝细胞免受损害有关。     

肝细胞生长因子对大鼠心脏移植细胞凋亡的影响

目的 探讨肝细胞生长因子(HGF)对大鼠心脏移植后细胞凋亡的影响.方法 建立大鼠异位心脏移植模型,将32只受体SD大鼠随机分为两组对照组术后注射生理盐水1 ml·kg-1·d-1;实验组术后15 d注射HGF 50 μg·kg-1·d-1.用HE染色和TUNEL技术检测移植心脏切片进行排斥反应的病理分级,计算凋亡指数,并观察移植存活时间.结果 与对照组比较,HGF能明显减少心肌细胞凋亡(P＜0.05),减轻移植物的组织损伤,延长移植物存活时间(P＜0.05).结论 外源性HGF能抑制移植心脏细胞凋亡,发挥抗排斥反应作用,显著延长移植物存活时间.     

肝细胞生长因子对肝纤维化的保护作用及其机制研究

目的 观察肝细胞生长因子(HGF)对实验性肝纤维化大鼠的保护作用及其可能的作用机制.方法 采用CCl4复合因素造模,HE染色观察肝组织形态学变化,赖氏法检测ALT、AST,TUNEL标记法检测肝细胞凋亡百分率,免疫组化方法观察增殖细胞核抗原(PCNA)、bcl-2、bax、Cyt C、caspase-3表达.结果 造模5～8周时,模型组可见肝小叶结构紊乱,纤维组织明显增生,并向肝小叶内延伸分割肝小叶,造模8周可形成假小叶.与模型组比较,HGF治疗组肝细胞变性坏死、炎性细胞浸润及纤维组织增生较轻(P<0.01),ALT、AST水平下降(P<0.05),肝细胞凋亡明显减少(P<0.05),PCNA阳性表达明显增高(P<0.05),bcl-2表达明显增多(P<0.01),同时bax、Cyt C、caspase-3表达显著减少(P<0.05).结论 HGF通过调节线粒体途径抑制肝细胞凋亡、促进肝细胞增殖而发挥对实验性肝纤维化大鼠的保护作用.     

大鼠肝再生过程中肝细胞caspase-3和caspase-8活性的变化

目的:研究大鼠肝再生过程中肝细胞caspase-3和caspase-8活性的变化规律.方法:雄性SD大鼠70%肝切除(PH),制作肝再生模型,制备肝匀浆液,经离心后用酶标仪分别测定肝再生过程中不同时期(共8个时间点),肝细胞的凋亡酶活性.结果:Caspase-3活性,与对照组相比,在PH后3、6、72、120 和168 h时显著性增高(P<0.001);而整个过程中Caspase-8的活性除了在PH后168 h时高于对照组外(P<0.05),其余时间点没有明显增高.结论:肝再生过程中肝细胞凋亡酶Caspase-3活性的升高可能主要是由内源性线粒体途径引起的.     

Bcl-2蛋白及caspase-3基因表达与暴发性肝衰竭肝细胞凋亡关系的研究

目的：研究Bcl-2蛋白与caspase-3基因表达在实验性暴发性肝衰竭（FHF）中对肝细胞凋亡的作用。方法：用脂多糖和D-氨基半乳糖制备FHF小鼠模型；免疫组化法检测肝组织内Bcl-2蛋白表达；原位杂交法检测肝组织内ccqspcqse-3基因表达；缺口原位末端标记技术检测肝细胞凋亡。结果：模型组用药后2h Bcl-2有较多表达，4h表达最多，以后逐渐减少，4h与2h比较差别显著（P〈0．05），与8h、12h比较差别十分显著（P〈0．01）。模型组用药后2h caspase-3开始少量表达，8h达最高峰，并出现典型的肝细胞凋亡改变。12h表达下降，且同时存在肝细胞凋亡和坏死。Bcl-2与caspase-3表达及肝细胞凋亡均呈负相关。结论：在FHF中，肝细胞凋亡与caspase-3的激活有关；Bcl-2可能通过抑制caspase-3的活性而抑制肝细胞凋亡。     

氟对大鼠肝组织中caspase-3和caspase-9基因表达的影响

目的 观察氟对大鼠肝组织caspase-3和caspase-9基因表达的影响,探讨其对肝组织损伤的作用机制. 方法 将48只SD雄性大鼠随机分为：对照组、低氟组、中氟组和高氟组,每组12只,分别饮用含0,50,100,200 mg/L氟化钠去离子水,采用自由饮水方式进行连续染毒120 d.测定肝系数;采用荧光定量PCR检测肝组织中caspase-3、caspase-9基因表达水平.结果 染氟组与对照组相比,体重差异无统计学意义.染氟组大鼠肝脏脏器系数与对照组相比差异无统计学意义.低、中、高染氟组caspase-3基因表达量分别是对照组的0.34±0.10、1.37±0.43和2.27±0.73倍;低、中、高染氟组caspase-9基因表达量分别是对照组的1.03±0.36、3.05±0.68和5.85±0.52倍. 结论 氟化物对肝细胞DNA损伤以及诱导细胞的凋亡,可能是通过激活caspase-3和caspase-9而促进了它们的发生.     

肝细胞生长因子对大鼠心脏移植再灌注损伤保护作用的实验研究

目的:探讨肝细胞生长因子(HGF)在心脏移植缺血再灌注损伤的保护作用.方法:健康雄性Wistar大鼠40只,建立大鼠同系异位心脏移植模型.随机分为3组:假手术组、对照组、实验组(供心切取时用含HGF100 mg/L 4 ℃改良ST.Thoms液10 ml主动脉根部灌注停跳).术后5 h测定血清中丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)含量,TUNEL法染色检测心肌细胞凋亡,电镜观测心肌细胞超微结构变化.结果:实验组MDA、CK-MB明显减少(P<0.01),SOD明显增加(P<0.01),心肌细胞凋亡指数显著减低(P<0.01),心肌超微结构改变明显减轻.结论:HGF能抑制心肌细胞凋亡,对心脏移植缺血再灌注损伤有保护作用.     

肝细胞生长因子在人肝细胞中的表达及对肝细胞损伤的保护作用

目的　构建肝细胞生长因子 (HGF)真核细胞表达载体 ,并观察其在人正常肝细胞中的表达以及对细胞增殖和抗损伤能力的影响。方法　利用基因重组技术将HGF与绿色荧光蛋白 (GFP)融合并构建真核表达质粒 ,通过脂质体介导法 ,导入正常人肝细胞系中。用荧光显微镜以及免疫组织化学方法观察HGF表达情况。采用 [3 H] TdR掺入DNA法、PCNA免疫组织化学观察肝细胞DNA合成 ,了解肝细胞增殖能力的变化。用CCl4造成急性肝细胞损伤 ,通过测定细胞存活率、细胞内丙氨酸氨基转移酶 (ALT)、K+ 的漏出量了解肝细胞的抗损伤能力。结果　酶切鉴定证实HGF片断已克隆到pEGFP N3 的BamHⅠ和SalⅠ位点之间 ,在转染人正常肝细胞后 ,利用荧光显微镜观察可见到绿色荧光蛋白的表达 ,用免疫组化方法进一步证实了HGF蛋白在细胞中的表达。 [3 H] T转导HGF的肝细胞的DNA合成明显增加 (转染 96h后 ,[3 H] TdR掺入量为对照组的 7倍 )。PCNA免疫组化结果显示转导HGF的肝细胞阳性率明显增加 ,肝细胞增殖活性增加。转导HGF的肝细胞抗CCl4损伤的能力明显增强 ,肝细胞存活率显著提高 (83%与 6 1% ,P <0 0 5 ) ,细胞内丙氨酸氨基转移酶 (ALT)、K+ 的漏出显著降低 (分别为 35 16U·L-1与 6 5 31U·L-1,P <0 0 1,5 5 9mmol/L与 6 0 2mmol/L ,P     

人源性肝细胞生长因子稳定转染细胞株的建立

目的通过实验获得人源性肝细胞生长因子(hHDSSF)稳定转染细胞株,为重组产品的获得奠定基础.方法通过脂质体包裹重组质粒pcDNA3.1hisB-HDSSF转染Hela细胞,以G418筛选转染细胞;进而通过RT-PCR和Northerm Blot鉴定G418筛选后的单克隆抗性细胞株.结果重组质粒pcDNA3.1hisB-HDSSF转染Hela细胞后,第20天可见G418单克隆抗性细胞株的形成.G418抗性Hela细胞株RT-PCR扩增出600 bp左右的目的条带;Northem Blot获得了明显的阳性杂交影.结论我们的实验证实HDSSF表达重组体被成功转入Hela细胞,并稳定表达;从而获得了HDSSF稳定表达细胞株,为进一步研究HDSSF表达、蛋白纯化和测定其生物学活性奠定了基础.     

survivin基因沉默对腺样囊性癌细胞生长和凋亡的影响

目的 探讨RNA干扰下调survivin基因表达后腺样囊性癌细胞生物学行为变化及其与caspase-3基因表达的相关性.方法 设计、合成小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA),构建表达载体pGenesil-shRNA-survivin,将重组质粒导入人腺样囊性癌ACC-2细胞株,G418筛选阳性克隆.采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、Western blot分别检测转染后的ACC-2细胞中survivin、caspase-3 mRNA及蛋白表达的变化,用噻唑蓝(MTT)法检测细胞的增殖,原位细胞凋亡(TUNEL)法及透射电子显微镜研究细胞凋亡.结果 测序证实表达载体构建成功,在pGenesil-shRNA-survivin的ACC-2细胞株中,survivin mRNA及蛋白表达明显降低(P＜0.05),caspase-3 mRNA及蛋白表达明显增加(P＜0.05),survivin与easpase-3的mRNA和蛋白表达呈显著负相关(r=-0.333,P＜0.05).ACC-2细胞增殖受到抑制,透射电镜及TUNEL法可见细胞出现凋亡.结论 成功构建了survivin基因的RNAi真核表达载体,pGenesil-shRNA-survivin重组质粒能有效抑制腺样囊性痛细胞生长.     

肿瘤坏死因子相关诱导凋亡配体与放、化疗联合应用诱导喉癌Hep-2细胞凋亡途径研究

 目的 探讨肿瘤坏死因子相关诱导凋亡配体（TRAIL）诱导喉癌Hep-2细胞凋亡的敏感性及其与放、化疗联用时的凋亡途径。方法 采用CCK-8法检测TRAIL、顺铂、紫杉醇作用下Hep-2细胞生长抑制率;流式细胞仪检测Hep-2细胞凋亡率;Western blot法检测Hep-2细胞内caspase蛋白表达变化。结果 Hep-2细胞对TRAIL诱导的凋亡不敏感,24 h IC₅₀为596. 92 μg/L;顺铂、紫杉醇、放射线与TRAIL联合应用时Hep-2细胞凋亡率显著高于单药应用（P＜0.05）;caspase-9抑制剂Z-LETD-FMK使TRAIL、顺铂、紫杉醇对Hep-2细胞的生长抑制率显著下降（P＜0.05）;联合用药组caspase-8,caspase-9表达量均有显著升高（P＜0.05）。结论 人喉癌Hep-2细胞对TRAIL诱导的细胞凋亡不敏感,TRAIL通过内源性途径诱导Hep-2细胞凋亡;活化后的caspase-9、caspase-3通过环状反馈作用激活caspase-8,增强了Hep-2细胞对TRAIL的敏感性,是联合用药对Hep-2细胞发挥协同效应的机制之一。     

力达霉素抑制K562细胞增殖和诱导凋亡作用及其机制

目的: 研究力达霉素(LDM)对人慢性粒细胞白血病(CML)K562细胞的增殖抑制和凋亡诱导作用,并探讨其机制。方法: 选取处于对数生长期的人CMLK562细胞,采用不同浓度(0.01、0.10和1.00nmol·L^-1)LDM处理48h,作为0.01、0.10和1.00nmol·L^-1LDM组,不加药物的正常细胞为对照组。台盼蓝染色观察各组K562细胞生长抑制率,MTT法检测细胞存活率,吖啶橙/溴化乙锭(AO/EB)双荧光染色法观察凋亡细胞的形态表现,AnnexinⅤ-FITC/PI双染结合流式细胞术检测细胞凋亡率,Western blotting法检测细胞中caspase-3和caspase-8蛋白相对表达量。结果: 台盼蓝染色,LDM对K562细胞增殖有一定的抑制作用,各浓度LDM组细胞生长抑制率均高于对照组(P<0.05);MTT法检测,随LDM作用浓度的升高,细胞存活率下降,LDM对K562细胞作用的半数抑制浓度(IC₅₀)为(0.1±3.2)nmol·L^-1。AO/EB染色,荧光显微镜下观察到LDM能够引起细胞发生凋亡(胞质呈芽状突起,胞核碎裂成点状)。流式细胞术检测,各浓度LDM组K562细胞凋亡率均高于对照组(P<0.05)。Western blotting法检测,0.10和1.00nmol·L^-1LDM组K562细胞中caspase-8和caspase-3蛋白相对表达量明显高于对照组(P<0.01)。0.01nmol·L^-1LDM组K562细胞中caspase-8和caspase-3蛋白表达量与对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。结论: LDM能够有效抑制K562细胞增殖,低浓度LDM可能通过上调细胞中caspase-8和caspase-3表达诱导K562细胞发生凋亡。     

瑞芬太尼对大鼠肠缺血再灌注损伤时肝细胞凋亡及caspase-3的影响

目的 探讨瑞芬太尼对大鼠肠缺血再灌注损伤时肝细胞凋亡及caspase-3的影响. 方法 成年健康Wistar大鼠42只,随机分为3组:对照组(C组,n=6)、肠缺血再灌注组(IR组,n=18)、瑞芬太尼干预组(R组,n=18).各组根据再灌注时间分为1,3,6 h三个时相.通过夹闭肠系膜上动脉制作肠缺血再灌注损伤模型,实验结束后即刻取肝左叶做标本.用免疫组化法检测caspase-3蛋白表达量,TUNEL法检测肝细胞凋亡指数(AI). 结果与C组比较,IR组和R组肝组织caspase-3蛋白含量、AI均增加(P<0.05);与IR组比较,R组caspase-3蛋白表达和AI减少(P<0.05). 结论 瑞芬太尼可以下调大鼠肠缺血再灌注时caspase-3蛋白表达,使肝细胞凋亡减轻,从而对肝损伤有一定的保护作用.     

20(s)-原人参二醇对体外培养Siha细胞caspase-3表达激活的影响

目的：观察20(s)-原人参二醇（PPD）对体外培养人宫颈癌Siha细胞中caspase-9和caspase-3转录表达的影响,以及caspase-3的活化形式cleaved caspase-3含量的变化,阐明其诱导Siha细胞凋亡的机制。方法：体外培养人宫颈癌Siha细胞,将其分为阴性对照组（乙醇）和实验组（20　 μgL^-1 PPD）,分别用乙醇和PPD处理体外培养的宫颈癌Siha细胞,48　h后流式细胞仪检测细胞的凋亡峰,半定量RT-PCR、Western blotting和免疫细胞化学染色方法检测PPD处理后Siha细胞中caspase-9和caspase-3基因的转录与表达水平。结果：与阴性对照组比较,20　 μg?L-1 PPD处理48 h后,Siha细胞凋亡率增加(P<0.05),Siha细胞中caspase-9与caspase-3转录水平升高(P<0.01),表达上调(P<0.01),caspase-3的活化形式cleaved caspase-3含量增加(P<0.01)。细胞免疫化学检测可见实验组细胞出现棕色颗粒。 结论：PPD可促进人宫颈癌Siha细胞凋亡,其机制与激活caspase家族级联反应有关。     

永生化人肝星状细胞株WM07的建立

目的 以慢病毒载体介导猿猴病毒40（simian virus 40,SV40）大肿瘤抗原（large tumor antigen,TAg）转染原代人肝星状细胞（hepatic stellate cell,HSC）获得永生化HSC株。方法 以含SV40 TAg cDNA序列的SV40 tsA58质粒为模板,PCR获取全长SV40 TAg序列,经TOPO克隆进入pENTR^TMTOPO^®;载体,PCR鉴定获得pENTR-SV40 TAg Entrez质粒,再经LR重组反应将SV40 TAg cDNA克隆到目标慢病毒载体pLenti4/V5-DEST,PCR鉴定pLenti4/V5-GW/SV40 TAg质粒,进一步用该质粒转染工程细胞293FT进行假病毒包装,用含包装病毒的细胞培养上清液转染原代人HSC,经博来霉素筛选获得稳定表达SV40 TAg的人HSC株（命名为WM07）,并对细胞进行SV40 TAg及α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin,α-SMA）表达的检测和鉴定。结果 对pENTR-SV40 TAg Entrez质粒及pLenti4/V5-GW/SV40 TAg慢病毒表达质粒进行PCR测序,结果证实所构建的质粒含ATG转录起始位点及SV40 TAg cDNA序列。对经过转染、筛选获得的WM07行免疫荧光染色,结果显示SV40 TAg在细胞核表达和定位,细胞质内均表达活化的HSC标志物α-SMA。结论 pLenti4/V5-GW/SV40 TAg质粒构建成功。经质粒转染,获得永生化HSC株WM07,可稳定传代并用于肝纤维化研究。     

原花青素对宫颈癌Hela细胞livin和caspase-3基因表达的影响

目的探讨原花青素对宫颈癌Hela细胞livin和cospose-3基因表达的影响。方法用不同终浓度原花青素（0～600μmol／L）处理宫颈癌Hela细胞24h，采用MTT比色法分析细胞存活率，Hoechst 33258-PI荧光染色法检测凋亡，RT—PCR检测livin、cospose-3 mRNA表达变化，Western blot检测livin、cospose-3 P17蛋白表达的变化，用比色法检测caspose-3相对活性。结果随着原花青剂量的增加，宫颈癌Hela细胞存活率降低，凋亡明显增加，livin mRNA表达和蛋白表达水平逐渐减少，而cospose-3逐渐增加；随原花青素浓度从75—600μmol／L增加，caspase-3相对活性增加（P〈0．05），在600μmol／L原花青素时caspose-3相对活性达最大值。结论原花青素可剂量依赖性的减少livin mRNA和蛋白表达；原花青素可剂量依赖性的增加caspose-3 mRNA、蛋白表达和增加cospose-3活性。