假丝酵母菌药敏实验及影响药物敏感性的因素分析

目的了解深圳地区育龄妇女外阴阴道假丝酵母菌的耐药情况及药物敏感性,探讨影响其药物敏感性的因素,为外阴阴道假丝酵母菌病（vulvovaginal candidiasis,VVC）的治疗提供参考依据。方法从体检妇女人群中阴道分泌物培养念珠菌感染阳性病例中选择103例为研究对象,对样本采用氟康唑、两性霉素B、伊曲康唑、酮康唑、益康唑进行药物敏感性实验;并回顾性调查检测对象病史、用药情况等。结果研究对象平均年龄（36.16±6.72）岁,文化程度以初中、高中和大专为主,分别占14.3%、29.7%和52.0%。对5种药物都敏感的样本有55例,占53.5%,对1种以上药物不敏感的样本有48例,占46.5%。药物敏感性依次是：两性霉素B（97.0%）、酮康唑（94.2%）、伊曲康唑（92.2%）、氟康唑（80.6%）、益康唑（72.8%）。近期使用抗生素更加容易使菌株对伊曲康唑和益康唑产生不敏感。使用抗生素的对象对两性霉素B、伊曲康唑、益康唑的耐药率分别为7.1%、14.3%和35.7%;而没有使用抗生素的对象对两性霉素B、伊曲康唑、益康唑的耐药率分别为2.3%、6.7%和25.8%。反复感染者的样本对两性霉素B（100.0%）和酮康唑（100.0%）非常敏感,但是会增加对伊曲康唑（8.7%）和益康唑（30.4%）的不敏感性。结论深圳地区外阴阴道假丝酵母菌整体耐药性较少,但近期使用抗生素和反复感染者对药物的敏感性有影响。临床治疗宜首选两性霉素B和酮康唑,反复感染者建议联合用药治疗。     

热带假丝酵母菌实时荧光定量PCR检测方法的建立及临床应用初步评价

目的建立、优化快速检测临床标本中热带假丝酵母菌的实时荧光定量PCR方法 ,并对其临床应用进行初步评价。方法用自行设计的高效引物、探针检测5种临床标本中的热带假丝酵母菌,对该方法的敏感性、特异性进行评价,并与真菌培养法进行比较。结果检测临床标本中热带假丝酵母菌的灵敏度可达10 copies/ml,与人类基因组、细菌及其他真菌无交叉阳性反应。与真菌培养法的检测一致性好（Kappa值为0.916,P〈0.01）。结论实时荧光定量PCR检测热带假丝酵母菌灵敏度高、特异性强,可直接用于各种临床标本中热带假丝酵母菌的检测,而且可大大缩短报告时间,为临床诊断提供可靠依据。     

86例外阴阴道假丝酵母菌病的临床疗效分析

目的讨论氟康唑联合克霉唑治疗白假丝酵母菌性阴道炎的效果。方法随机抽取来我院就诊的白假丝酵母菌性阴道炎的女性患者86例,随机分为研究组与常规组,每组各43例。针对常规给予苏打水溶液外阴清洗后置入克霉唑栓治疗;针对研究组给予在常规组治疗的基础上口服氟康唑胶囊治疗;两组用药均1次/d,以7d为一个疗程,进行4个疗程的观察。结果研究组总有效率为95.35％明显高于常规组的74.42％。所有数据均符合统计学差异（P＜0.05）。结论氟康唑联合克霉唑对于白假丝酵母菌性阴道炎的治疗效果好,值得推广。     

体内外光滑假丝酵母菌氟康唑耐药机制的比较研究

目的 研究比较临床分离和体外诱导的耐氟康唑光滑假丝酵母菌的耐药机制.方法 选取临床分离的4对氟康唑敏感-耐药配对的光滑假丝酵母菌,其中4株敏感株在体外氟康唑的作用下均被诱导为耐药株.利用罗丹明6G试验比较敏感株与两种耐药株的外排泵作用,实时荧光定量RT-PCR检测外排相关基因CDR1、CDR2、SNQ2和ERG11的表达.同时,对PDR1基因进行PCR扩增和测序,对比分析临床耐药株和体外诱导耐药株的突变位点.结果 临床耐药株和体外诱导耐药株外排泵的功能均明显强于敏感株;两者CDR1表达均显著升高,而CDR2和SNQ2则无明显变化;ERG11在敏感与耐药菌株之间的表达水平也无显著差别;两种耐药株的PDR1均发现错义突变位点,其中P927S、L543P及S947L突变尚未被报道过.结论 光滑假丝酵母菌在体内外氟康唑作用下PDR1均产生突变,引起外排相关基因,尤其是CDR1的表达增加从而增强了外排泵的作用导致耐药.     

白假丝酵母菌DNA提取方法的研究

目的建立一种提取白假丝酵母菌DNA的有效方法。方法采用蜗牛酶消化破壁形成原生质体，饱和酚／氯仿抽提法提取基因组DNA，用琼脂糖凝胶电泳及PCR反应等进行鉴定。结果提取物经琼脂糖凝胶电泳检测到DNA主带，基本无DNA碎带，提取的DNA浓度为（1．18±0．36）ug／ul，纯度好（OD260／OD280〉1．7），不用RNase酶处理，无需任何纯化即可用于PCR扩增。结论本研究中提取DNA的方法简便易行．提取物可适用于各种分子生物学研究。     

雌激素影响外阴阴道假丝酵母菌病的发生发展

白假丝酵母菌是外阴阴道假丝酵母菌病的主要条件致病菌,高水平的雌激素与外阴阴道假丝酵母菌病的高发病率密切相关。雌激素对菌体和宿主均有影响。雌激素通过结合白假丝酵母菌的雌激素结合蛋白增加1型菌丝壁蛋白、分泌型天冬氨酸蛋白酶和磷脂酶的表达,促进形态转换和热休克蛋白90的表达,从而增强白假丝酵母菌对宿主组织的粘附、入侵和环境适应力。同时雌激素通过与宿主的雌激素受体结合影响阴道的pH,抑制阴道上皮细胞和吞噬细胞介导的先天性抗假丝酵母菌免疫以及T细胞和B细胞介导的获得性抗假丝酵母菌免疫。雌激素是建立外阴阴道假丝酵母菌病动物模型的关键因素。此文章总结了在外阴阴道假丝酵母菌病的发生发展中雌激素对假丝酵母菌和宿主产生的影响。     

纳米银抗菌凝胶联合氟康唑治疗外阴阴道假丝酵母菌疗效观察

目的：探讨纳米银抗菌凝胶联合氟康唑治疗外阴阴道假丝酵母菌病疗效。方法选择门诊确诊的外阴阴道假丝酵母菌患者58例随机分为治疗组和对照组,治疗组氟康唑单次口服150mg,纳米银抗菌凝胶连用6d。对照组纳米银抗菌凝胶连用6d,对比疗效。结果两组停药后7d总有效率为93.3%和82.1%,两组在下次月经干净后总有效率为93.3%和78.6%。结论纳米银抗菌凝胶联合氟康唑治疗外阴阴道假丝酵母菌具有较好的疗效。     

白假丝酵母菌基因分型技术的研究

白假丝酵母菌是假丝酵母菌性外阴阴道病最常见的致病菌种。对致病菌快速准确地分型在研究其所致的感染性疾病的发病机制及诊治措施中发挥重要作用,并且有利于致病菌的流行病学调查。因此本文就用于白假丝酵母菌研究的基因分型技术作一综述。     

药物流出泵抑制剂联合咪康唑清除白假丝酵母菌生物被膜的研究

目的 观察咪康唑分别与两种药物流出泵抑制剂联用清除耐药株(persister)的效果.方法 白假丝酵母菌参考株YEM30,在96孔板中形成生物被膜(biofilm),CDR1抑制剂Enniatin B、CDR1/CDR2抑制剂Milbemycins α25单独或联合与咪康唑作用后,采用菌落形成单位(CFU)计数的方法统计耐药株的数量.采用SAS8.0统计软件包对数据进行q检验.结果 咪康唑分别联合两种药物流出泵抑制剂清除生物被膜耐药株的效果明显优于咪康唑单独使用(P<0.001),其中咪康唑与Enniatin B联用效果更佳.结论 咪康唑与药物流出泵抑制剂联合应用具有清除生物被膜中表现型耐药株的作用,这为提高抗真菌治疗的效果提供了一条新途径和新思路.     

流式细胞术检测淋巴细胞增殖方法的建立

目的 :建立一种用流式细胞仪同时测定T淋巴细胞增殖与细胞因子分泌的方法。方法 :用非特异性刺激剂PMA、PHA刺激 1 0例正常人外周血单个核细胞 ,体外培养 2、4、6、8、1 0h ,流式细胞术在单细胞水平检测T淋巴细胞的功能性激活、表面活化标志性抗原 (CD69)的表达、DNA合成 (BrdU掺入法 )及胞内细胞因子 (IL 4、IFN γ)分泌。选择合适的刺激剂、调整细胞浓度、优化实验方法 ,确定最佳实验条件。结果 :BrdU掺入法测定T淋巴细胞增殖 ,最佳的反应细胞浓度为 1× 1 0 6ml-1 ,比较不同刺激剂和体外培养时间 :PMA(2 0ng ml)刺激后 8hT细胞中CD69+、BrdU+双阳性细胞比例最高 (82 3 %± 7 2 % ) ,IFN γ+、IL 4+细胞百分率分别为 2 5 2 %± 3 7%和 3 4%± 1 6 % ,均显著高于未刺激组 (P <0 0 1 )。结论 :应用流式细胞术进行单个核细胞的增殖分析可以同时检测细胞表面活化抗原的表达、DNA合成及胞内细胞因子的分泌。此方法能够分析不同亚群细胞对于不同刺激原的反应和激活表型。敏感性高、重复性好 ,可在单细胞水平检测单个核细胞的增殖和功能性激活     

流式细胞术检测细胞毒方法的建立

目的：建立一种用流式细胞仪测定细胞介导细胞毒活性的方法。方法：用羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯(CFSE)标记靶细胞，再用碘化丙碇(PI)标记DNA筛选细胞膜已破坏的靶细胞。效靶比为100：1—6．25：1，共孵育时间为1-6小时，流式细胞仪收集1000个靶细胞并测定被杀细胞的百分率。结果：CFSE是合适的标记靶细胞的荧光染料，18小时后也能很好地区分效靶细胞；靶细胞的自然死亡率低于5％；杀伤百分率随着效靶比和共孵育时间的增加而增加。最佳效靶比为50：1—25：1，共孵育时间为2—4小时。结论：CFSE／PI双荧光染料标记的流式细胞分析检测细胞毒具有多个优点：避免放射性试剂的应用，敏感性增强，单细胞水平的分析。     

臭氧治疗外阴阴道假丝酵母菌病的临床观察

目的观察臭氧对外阴阴道假丝酵母菌病（VVC）的治疗效果。方法将102例VVC患者随机分为观察组（51例）和对照组（51例）,观察组接受臭氧治疗,对照组接受达克宁硝酸咪康唑栓治疗。两组于治疗后第3天进行临床和真菌学疗效分析。结果治疗结束后第3天,观察组治愈42例（82．3％）、显效6例（11．8％）、有效3例（5．3％）,总有效率为100％;对照组治愈28例（55．0％）、显效12例（23．5％）、有效6例（11．8％）、总有效率为90．3％。两组治愈率差异有统计学意义（P〈0．01）。结论臭氧治疗外阴阴道假丝酵母菌病效果显著,不良反应发生率低。     

可宝净栓联合伊曲康唑治疗复发性外阴阴道假丝酵母菌病的临床观察

目的观察可宝净栓及伊曲康唑联合治疗复发性外阴阴道假丝酵母菌病的疗效及复发情况。方法选择2003～2004年我院妇科门诊确诊为复发性外阴阴道假丝酵母菌病的患者110例,随机分成3组,A组40例给予可宝净栓阴道上药,日一次,每次1片,连用18d,月经期不间断。B组40例给予可宝净栓阴道上药,用法同A组,同时口服抗真菌药物斯皮仁诺200mg,口服,每日一次,共三次。C组,30例,单纯给予斯皮仁诺200mg口服,每日一次,共3次。用药后1个月复诊,以后随访达半年,观察治疗效果,及有无复发。结果联合用药组疗效最好,且复发率最低。结论可宝净栓联合伊曲康唑治疗RVVC疗效显著,且可明显降低VVC复发率。     

外阴阴道假丝酵母菌病与阴道局部免疫的研究进展

阴道假丝酵母菌病感染后,阴道上皮局部介导的先天免疫在抗假丝酵母菌病中开始发挥重要作用,局部Th1与Th2细胞及其细胞因子形成局部免疫网络相互调控、彼此抑制,调节免疫应答引起阴道上皮局部免疫改变,决定了机体对致病菌的易感性。本文就VVC与Th1/Th2介导的阴道局部免疫相关研究进行阐述。     

抗真菌药联合转移因子治疗复发性外阴阴道假丝酵母菌病的疗效观察

目的 观察抗真菌药联合转移因子治疗复发性外阴阴道假丝酵母菌病的疗效.方法 将160例确诊为复发性外阴阴道假丝酵母菌病的患者随机分为两组,治疗组80例,给予抗真菌药联合转移因子治疗,对照组80例,单纯给予抗真菌药物治疗.观察两组停药后1w、1个月、3个月、6个月的情况.结果 治疗6个月后停药,两组治愈率无明显差异(P＞005);停药1个月、3个月、6个月后治疗组的复发率明显低于对照组(P＜0.05).结论 抗真菌药联合转移因子治疗复发性外阴阴道假丝酵母菌病,疗效显著,复发率低,值得推广使用.     

蛋白激酶C-δ在Dectin-1-Src-Syk介导的巨噬细胞杀灭白假丝酵母菌中的作用研究

目的:研究蛋白激酶C-δ在Dectin-1-Src-Syk介导的巨噬细胞杀灭白假丝酵母菌中的作用,探讨固有免疫抗真菌的分子机制。方法:用流式细胞术检测细胞表面受体;用蛋白酶抑制剂预处理体外培养的小鼠巨噬细胞,通过Western blot分析相关蛋白的表达及磷酸化水平,并利用luminol法、荧光标记法和培养法检测巨噬细胞在白假丝酵母菌的刺激下释放活性氧分子、吞噬并杀灭真菌细胞的能力。结果:Dectin-1封闭剂与Src或Syk抑制剂均能抑制白假丝酵母菌诱导的PKC-δ磷酸化;蛋白激酶C-δ抑制剂Rottlerin对巨噬细胞吞噬白假丝酵母菌无显著影响;Rottlerin抑制白假丝酵母菌诱导的巨噬细胞p40phox磷酸化、活性氧分子的产生和对白假丝酵母菌的杀灭作用。结论:蛋白激酶C-δ抑制剂Rottlerin通过抑制巨噬细胞NADPH氧化酶复合物的活化和活性氧分子的释放降低对真菌细胞的杀灭作用,提示PKC-δ在固有免疫抗真菌中发挥重要的作用。     

流式细胞术检测全血白细胞吞噬白念珠菌方法的建立和应用

目的建立全血白细胞吞噬白念珠菌的流式细胞术检测方法。方法绘制白念珠菌生长曲线后,取生长对数中期的白念珠菌,以活体细胞示踪荧光探针二乙酰羧基荧光黄琥珀酰亚胺酯(CFDA-SE)标记,与以PC5标记的CD45单克隆抗体预标记的全血白细胞,在37℃分别反应10、30、60min(MOI≈10∶1),以流式细胞术观察CD45阳性细胞对白念珠菌的吞噬情况。结果白念珠菌在液体酵母浸出粉胨葡萄糖培养基(YPD)中37℃、50mL/LCO2培养,第5~11h为对数生长期。10mmol/LCFDA-SE染色30min,可使白念珠菌均匀着色;CD45阳性细胞和标记的白念珠菌作用10、30、60min,CD45阳性细胞中中性粒细胞的吞噬率分别为(80.1±6.1)%、(83.8±7.7)%和(92.3±11.2)%;单核细胞的吞噬率为(11.2±3.6)%、(15.8±4.4)%和(27.7±6.8)%,淋巴细胞作为无明显吞噬作用内参,其吞噬率为(0.9±0.3)%、(0.8±0.4)%和(5.2±1.6)%。结论成功建立流式细胞术检测全血白细胞吞噬白念珠菌的方法,全血白细胞与白念珠菌共孵育30min是较为合适的作用时间。     

三色法流式细胞术检测胞内细胞因子的建立

运用荧光标记的抗细胞表面抗原单抗及抗细胞因子单抗, 结合固定、破膜处理技术, 建立了三荧光染色法流式细胞术检测细胞内细胞因子的方法, 探讨了不同刺激剂及细胞培养时间的选择, 并对５ 例正常人产生ＩＦＮ γ、ＩＬ ４ 的ＣＤ４ 及ＣＤ８ 细胞进行测定。结果表明： 产生ＩＦＮ γ的ＣＤ４ 及ＣＤ８ 细胞明显多于产生ＩＬ ４ 的细胞, 并且产生ＩＦＮ γ的ＣＤ８ 细胞百分数比较ＣＤ４ 细胞相对增多; 同时产生ＩＦＮ γ／ＩＬ ４ 的ＣＤ４ 、ＣＤ８ 细胞较少。此方法可从单个细胞水平直接用于Ｔ细胞亚群及其细胞因子的检测。     

克霉唑栓联合乳酸菌阴道胶囊在治疗复发性外阴阴道假丝酵母菌病中的应用与疗效

目的：分析研究临床在面对复发性外阴阴道假丝酵母菌病患者时,给予其实施克霉唑栓、乳酸菌阴道胶囊联合治疗后的临床效果。方法择取我院妇科在近期内接诊的103例复发性外阴阴道假丝酵母菌病患者,并按照治疗方式的不同将患者分为A组(51例单一实施克霉唑栓治疗)、B组(52例实施克霉唑栓、乳酸菌阴道胶囊)。结果经过治疗后,B组患者的治疗有效率为94.23%,明显高于A组患者(P<0.05);治疗后随访结果显示,B组患者的复发率明显低于A组患者(P<0.05)。结论临床在面对复发性外阴阴道假丝酵母菌病患者时,给予其实施克霉唑栓、乳酸菌阴道胶囊联合治疗后临床效果佳,值得临床推广应用。     

流式细胞术检测体内细胞毒效应方法的研究

目的 建立一种用流式细胞仪检测体内细胞毒效应的方法.方法 用不同浓度的羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯(CFSE)标记靶细胞和非靶细胞,以1:1的比例混合靶细胞和非靶细胞,尾静脉回输小鼠,16h后取小鼠脾脏淋巴细胞,流式细胞仪检测CFSE标记靶细胞和非靶细胞的比例,测定体内被杀伤靶细胞的百分率.结果 荧光染料CFSE能有效标记靶细胞,16h后流式细胞仪能很好地检测到体内被杀伤靶细胞的百分率.结论 CFSE荧光染料标记靶细胞并结合流式细胞仪分析的方法能有效地检测到体内细胞毒效应,该技术有望在肿瘤免疫和移植排斥的体内监测中得到广泛应用.