三个牛品种Prdm9基因串联锌指序列的比较

Prdm9基因编码一种组蛋白甲基转移酶,被认为是物种形成基因.为阐明不同牛品种Prdm9基因的序列特征,试验从3个牛品种(中国荷斯坦牛26头、云南BMY牛25头和皖南黄牛16头)血液中提取基因组DNA,采用PCR方法特异扩增该基因中进化最快的串联锌指序列,并进行克隆测序和生物信息学分析.根据Prdm9基因的测序结果,推导其蛋白质序列,显示试验牛Prdm9蛋白中存在串联的C_2H_2型锌指,每个锌指由21个氨基酸组成,由于在1～4个固定位点上存在氨基酸差异,共形成了8种不同的锌指.在67头牛的Prdm9中检测到9种不同的锌指域,每种锌指域含5～7个(多数为6个)锌指,其类型存在品种间差异.研究表明,Prdm9基因的锌指序列、锌指域组成在3个牛品种间和个体间均存在差异,表现出较高的遗传多态性.     

牦牛和犏牛睾丸SAMD12基因的克隆测序及其mRNA水平比较

SAMD12是新近发现的SAM结构域家族成员.为进一步探究犏牛雄性不育的分子机制,实验从健康成年牦牛(n=10)和雄性不育犏牛(n=7)睾丸组织中提取总RNA,利用常规基因克隆技术,对牦牛SAMD12基因进行克隆测序,并采用实时荧光定量PCR技术,比较牦牛和犏牛睾丸中SAMD12基因mRNA水平.结果本实验克隆获得了牦牛SAMD12基因的3种变异体,分别命名为v715、v779和v852.v715与普通牛5号变异体完全对应;v779含SAM结构域但与普通牛序列存在一些差异,可能是SAMD12基因的新变异体类型;v852无结构域部分可能不表现活性.定量PCR结果显示:SAMD12基因在牦牛和犏牛睾丸中均有表达,但表达量差异不显著,推测其表达水平与犏牛雄性不育无直接关系.     

牦牛和犏牛睾丸SAMD12基因的克隆测序及其mRNA水平比较

SAMD12是新近发现的SAM结构域家族成员.为进一步探究犏牛雄性不育的分子机制,实验从健康成年牦牛(n=10)和雄性不育犏牛(n=7)睾丸组织中提取总RNA,利用常规基因克隆技术,对牦牛SAMD12基因进行克隆测序,并采用实时荧光定量PCR技术,比较牦牛和犏牛睾丸中SAMD12基因mRNA水平.结果本实验克隆获得了牦牛SAMD12基因的3种变异体,分别命名为v715、v779和v852.v715与普通牛5号变异体完全对应;v779含SAM结构域但与普通牛序列存在一些差异,可能是SAMD12基因的新变异体类型;v852无结构域部分可能不表现活性.定量PCR结果显示:SAMD12基因在牦牛和犏牛睾丸中均有表达,但表达量差异不显著,推测其表达水平与犏牛雄性不育无直接关系.     

牦牛,黄牛体外受精比较和分割胚的移植

采用常规方法对黄牛和牦牛卵母细胞的体外受精技术进行初步探索.实验采用相同的成熟液、受精液和培养液,并且两种卵母细胞成熟后均以黑白花冷冻精液进行受精.成熟培养时间为22～26.h.受精后48h移入颗粒单层培养滴中,第6、7、8天记录囊胚发育情况.结果表明：来自屠宰场的不同品种的卵巢在提供卵母细胞的数量上无显著差异（P＞0.05）.50个黄牛卵巢获得344枚可用卵母细胞、回收率为6.9枚／卵巢;30个牦牛卵巢获得206枚可用卵母细胞,回收率为69：16个黄牛加28个牦牛卵巢获得373枚可用卵母细胞,回收率为7.5受精后黄牛、牦牛的卵裂率（69.2％比44.1％）差异极显著（P＜0．01）而囊胚发育率（31.8％比25.0％）差异显著（P＜0.05）牦牛与黄牛卵母细胞共同培养时其卵裂率和发育率比较接近黄牛卵母细胞的发育水平（分别为61、2％和30.5％）挑选部分黄牛杂交胚胎进行分割实验,将其中的四对半胚非手术移入4头发情同步的受体牛．两个月直肠检查有3头妊娠（75％）,其中有两头受体足用分娩,其－产奶黄杂公犊－头,另－受体产一对奶黄杂双胎、－活－死（畸胎）实验表明：常规的体外受精技术用于牦牛是可行的,但其中仍有－些值得改进的地方,另外完全体外化的胚胎分割技术为提高优质良种胚胎的生产效率提供了便捷     

180日龄高原牦牛和平原黄牛肺泡组织结构的比较研究

利用光镜、透射电镜和计算机图像分析系统对180日龄高原牦牛肺泡组织结构进行观测,并与180日龄平原黄牛的肺泡组织结构做比较。结果表明：180日龄高原牦牛肺泡组织结构与180日龄平原黄牛的基本相同,但180日龄高原牦牛肺泡表现出快速发育的结构特点。180日龄高原牦牛单位面积内肺泡面积显著大于180日龄平原黄牛相应值（P〈0.05）,但两组动物肺泡隔厚度、单个肺泡面积和单位面积内肺泡数之间差异均不显著（P〉0.05）。180日龄高原牦牛气-血屏障的算术平均厚度和调和平均厚度均显著小于180日龄平原黄牛（P〈0.05）,表现出高原牦牛气-血屏障适应高原低氧的组织学结构特点。     

藏黄牛褪黑激素合成酶AA-NAT基因cDNA克隆及序列的比较分析

哺乳动物季节性繁殖主要受褪黑激素调控, 而褪黑激素的分泌受其2个合成酶HIOMT和AA-NAT调控. 分布于青藏高原的藏黄牛和牦牛是典型的季节性繁殖动物, 普通黄牛繁殖则季节性不明显. 比较分析它们三者的AA-NAT序列, 从而进一步研究它们繁殖的季节性. 采用RT-PCR技术,从2个公藏黄牛个体的松果体组织总RNA中分别克隆到AA-NAT基因的表达序列, 并对其进行生物信息学分析. 结果表明:藏黄牛AA-NAT基因的表达序列全长为624bp, 开放阅读框(ORF)为621 bp, 编码207个氨基酸, 预测其表达蛋白分子量为52.3005kDa, 等电点为5.06, 不具有信号肽, 有两个具有较高可能性的跨膜区, 存在4个O连接糖基化位点, 而不存在N连接糖基化位点, 有3个潜在的Ser和3个Thr磷酸化位点. 藏黄牛该基因表达序列核苷酸及编码氨基酸与亲缘关系较远的牦牛一致, 而与亲缘关系较近的普通黄牛却有一定差异, 这可能与繁殖的季节性有关.     

黄犏牛与黄牛b-Boule基因编码区序列、结构、表达模式和睾丸组织表达水平的差异分析

Boule是动物精母细胞减数分裂过程中的必需蛋白,与精子发生减数分裂阻滞、雄性不育等密切相关.文中通过PCR扩增和克隆测序获得黄犏牛b-Boule基因的cDNA全序列,生物信息学分析发现黄犏牛b-Boule基因编码区全长885 bp,具有典型的RNA识别基序(RRM)和DAZ重复序列;与黄牛氨基酸序列的同源性为98.65%,仅在C-末端有4个氨基酸的差异,典型结构域的氨基酸序列和高级结构相同.RT-PCR发现b-Boule基因在黄牛和黄犏牛睾丸组织中特异表达,原位杂交显示b-Boule存在于初级精母细胞和次级精母细胞的细胞质中.荧光定量PCR发现黄牛睾丸组织中b-Boule基因表达水平显著高于黄犏牛(P<0.05),且黄犏牛精子发生减数分裂阻滞的表型与人、小鼠BDule基因表达缺失或降低引起的不育表型一致,因此推测b-Boule基因可能在精母细胞减数分裂过程中发挥重要作用,且与黄犏牛雄性不育有密切的关系.     

西藏牦牛和黄牛遗传多态性的研究

用淋巴细胞短期体外培养法,并结合染色体Ｇ、Ｃ、Ａｇ－ＮＯＲｓ 显带技术,以及聚丙烯酰胺凝胶电泳法,研究了西藏牦牛、黄牛的染色体和血液蛋白多态性．结果表明：西藏牦牛可分为山地牦牛和草地牦牛两个生态类群,但均应属于横断高山型牦牛;西藏黄牛在染色体核型、血液蛋白基因位点、以及体型外貌上与普通牛一致,为普通牛种．     

牦牛、犏牛和黄牛生产性能比较及肉中风味物质测定

随机选取青海省1．5岁左右牦牛（♂）、犏牛（♂）和黄牛（♂）各3头,利用高效液相色谱法对其肉中的肌苷、肌苷酸和硫胺素进行测定,采用高氯酸滴定法测定其肉中谷氨酸钠的含量,并对牦牛、犏牛和黄牛的生产性能进行比较分析。结果表明：①犏牛的体重和体高明显优于同龄牦牛（P〈0．05）,而且犏牛的体长与牦牛具有极显著差异（P〈0．01）,犏牛和黄牛的胸围都与同龄牦牛具有显著差异（P〈0．05）。②犏牛的头重明显高于同龄牦牛（P〈0．01）;犏牛的皮重、前二蹄重、后二蹄重、胴体重和胴体肉重明显优于同龄牦牛（P〈0．05）;犏牛和黄牛的胴体骨重都与同龄牦牛具有显著差异（P〈0．05）;三个品种的屠宰率、净肉率和胴体产肉率无显著差异（P〉0．05）;黄牛的骨肉比明显高于同龄犏牛（P〈0．05）。③牦牛肉中肌苷含量最高,其含量明显高于同龄黄牛（P〈0．05）;肌苷酸的含量在三品种间无显著差异（P〉0．05）;犏牛肉硫胺素的含量明显高于同龄黄牛（P〈0．05）;黄牛和犏牛肉谷氨酸钠的含量显著高于同龄牦牛（P〈0．05）。     

利用双向电泳-质谱技术鉴定牦牛和犏牛睾丸中的差异表达蛋白质

比较了牦牛和犏牛睾丸组织中蛋白质的表达差异;应用双向电泳-质谱技术,对牦牛和犏牛的睾丸组织中差异蛋白质进行分离和鉴定;对获得的22个差异表达点进行质谱鉴定和数据库搜索,获得了19个蛋白质,其中有3种分子伴侣可能与犏牛雄性不育有关;研究结果表明,牦牛和犏牛睾丸组织中存在差异表达蛋白,并可利用双向凝胶电泳进行分离,为进一步分析犏牛雄性不育的原因提供了线索.     

利用双向电泳-质谱技术鉴定牦牛和犏牛睾丸中 的差异表达蛋白质

比较了牦牛和犏牛睾丸组织中蛋白质的表达差异; 应用双向电泳-质谱技术, 对牦牛和犏牛的睾丸组织中差异蛋白质进行分离和鉴定; 对获得的22个差异表达点进行质谱鉴定和数据库搜索, 获得了19个蛋白质, 其中有3种分子伴侣可能与犏牛雄性不育有关; 研究结果表明, 牦牛和犏牛睾丸组织中存在差异表达蛋白, 并可利用双向凝胶电泳进行分离, 为进一步分析犏牛雄性不育的原因提供了线索.     

三个牛品种Prdm9基因串联锌指序列的比较

Prdm9基因编码一种组蛋白甲基转移酶,被认为是物种形成基因.为阐明不同牛品种Prdm9基因的序列特征,试验从3个牛品种(中国荷斯坦牛26头、云南BMY牛25头和皖南黄牛16头)血液中提取基因组DNA,采用PCR方法特异扩增该基因中进化最快的串联锌指序列,并进行克隆测序和生物信息学分析.根据Prdm9基因的测序结果,推导其蛋白质序列,显示试验牛Prdm9蛋白中存在串联的C_2H_2型锌指,每个锌指由21个氨基酸组成,由于在1～4个固定位点上存在氨基酸差异,共形成了8种不同的锌指.在67头牛的Prdm9中检测到9种不同的锌指域,每种锌指域含5～7个(多数为6个)锌指,其类型存在品种间差异.研究表明,Prdm9基因的锌指序列、锌指域组成在3个牛品种间和个体间均存在差异,表现出较高的遗传多态性.     

牦牛INHBA基因的克隆及序列分析

根据GenBank检索到的普通牛的INHBA基因序列设计一对特异性引物,以牦牛卵巢组织总RNA为模板,通过RT-PCR技术对牦牛INHBA cDNA进行克隆测序和序列分析.结果表明:扩增片段1360bp,包含1277bp的编码区,编码426个氨基酸.与普通牛相比,牦牛INHBA基因编码区存在2处碱基转化.牦牛与普通牛、绵羊、人、鼠和猪的核苷酸序列同源性分别为99.84%、97.97%、91.41%、87.79%、91.94%,氨基酸序列同源性分别为99.53%、98.82%、95.77%、93.88%、93.88%.蛋白质结构分析显示,INHBA蛋白不易形成α螺旋和跨膜结构,是相对保守的疏水性蛋白.     

牦牛肥胖基因和肿瘤坏死因子α基因的序列分析

肥胖基因(ob gene)是近年来刚被克隆的新基因，该基因的表达产物瘦蛋白(Leptin)具有调节体重、影响动物生长和繁殖率等一系列生物学功能．肿瘤坏死因子-α(Tumor Necrosis Factor-α，TNF-α)是一种主要由活化单核巨噬细胞和T淋巴细胞产生的多效性细胞因子，时TNF-α基因的基础及应用研究已成为近年来动物抗病育种的研究热点之一，本文克隆及测序分析了牦牛上述两个基因的部分片段。结果表明：ob基因大小为1773bp，TNF-α基因为1160bp，通过genebank中的blastn比较分析牦牛ob基因和TNF—α基因与普通牛种的相应基因同源性都高达98％。     

麦洼牦牛和九龙牦牛FSHβ基因的PCR-SSCP分析

运用一对特异性引物对麦洼牦牛、九龙牦牛的FSHβ基因的5,端侧翼区进行了扩增,应用PCR-SSCP方法对其进行了多态性分析.结果表明:在麦洼牦牛的FSHβ基因的5,端侧翼区有AA型、AB型和BB型三种基因型,九龙牦牛的FSHβ基因的5,端侧翼区只检测到了AA型、AB型两种基因型.在两种牦牛品系中,AA基因型频率最高,A等位基因频率均明显高于B等位基因频率.麦洼牦牛和九龙牦牛群体中多态信息含量分别为0.3431、0.1411,麦洼牦牛多态性能高,遗传变异大.     

牦牛肌红蛋白的cDNA序列测定及其氧化特性的研究

通过对牦牛肌红蛋白的含量和cDNA序列的测定及心肌肌红蛋白氧化和脂类氧化相关性的研究，初步探讨了牦牛适应高原低氧环境的机理. 牦牛与黄牛的肌红蛋白cDNA序列比较，二者只有2个碱基的差异（89位氨基酸由cac变为cat，91位氨基酸由gcc变为gct），但由于氨基酸密码子简并性，两者的氨基酸序列没有差异.牦牛的骨骼肌的肌红蛋白含量为488.3 nmol/g，与黄牛相比没有显著差异，但牦牛心肌的肌红蛋白含量为823.4 nmol/g，比黄牛高61.2％（P＜0.05）.在4 ℃贮存下，牦牛心肌中肌红蛋白的氧     

青海牦牛与云南牦牛乳球蛋白基因5''''调控区核苷酸序列同源性比较

利用一对PCR引物，寡聚核苷酸序列的上游引物为5’-gCg，AAT，TCA，TCC，CAC，gTg，CCT，gC-3’；下游引物为5’-gAg，AAT，TCC，Tgg，ggA，ggg，ACC，TT-3’。经68℃退火及30轮循环的PCR程序后，分别克隆来自我国青海和云南地区牦牛的乳球蛋白基因的5’调控区1447bp的DNA片段。将该片段从琼脂糖凝胶中回收，克隆在pMD1S-T Vector后进行序列测定。序列分析结果表明，青海牦牛该序列的核苷酸序列与文献报道的奶牛该基因的同源性为97．65％，云南牦牛该序列的核苷酸序列与奶牛该基因的同源性为96．8％，青海牦牛与云南牦牛该基因片段的核苷酸序列同源性为99．4％。     

青海牦牛与云南牦牛乳球蛋白基因5′调控区核苷酸序列同源性比较

利用一对PCR引物,寡聚核苷酸序列的上游引物为5-′gCg,AAT,TCA,TCC,CAC,gTg,CCT,gC-3;′下游引物为5-′gAg,AAT,TCC,Tgg,ggA,ggg,ACC,TT-3′。经68℃退火及30轮循环的PCR程序后,分别克隆来自我国青海和云南地区牦牛的乳球蛋白基因的5′调控区1 447 bp的DNA片段。将该片段从琼脂糖凝胶中回收,克隆在pMD18-T Vector后进行序列测定。序列分析结果表明,青海牦牛该序列的核苷酸序列与文献报道的奶牛该基因的同源性为97.65%,云南牦牛该序列的核苷酸序列与奶牛该基因的同源性为96.8%,青海牦牛与云南牦牛该基因片段的核苷酸序列同源性为99.4%。     

牦牛催乳素受体基因部分片段的克隆与序列分析

扩增出牦牛催乳素受体（尸碰尺）基因部分保守序列,为研究牦牛乳腺组织中朋三尺基因表达水平奠定基础．提取牦牛乳腺组织总RNA,根据NCB1的奶牛Jp月￡只基因cDNA序列的保守区设计特异性引物,采用RT-PCR技术扩增牦牛尸胜尺基N,结果获得577bp的片段,将该片段连接于pMD18-Simple质粒中,转化大肠杆菌,菌液PCR鉴定阳性克隆子,测序并分析氨基酸序列．分析序列与氨基酸与其他物种同源性,结果表明该序列与水牛、奶牛、绵羊、人、小鼠的尸RLR基因mRNA的对应序列的同源性分别为97．40％、99．13％、93．41％、71．07％、60．20％,编码的氨基酸同源性分别为97．40％、100％、95．83％、82-38％、72-22％．