利用重组分支杆菌噬菌体快速筛选耐利福平结核分支杆菌

目的：采用基因工程技术构建的可表达荧光素酶的结核分支杆菌噬菌体进行结核分支杆菌利福平药敏试验研究,建立一种特异、灵敏、快速的利福平药敏试验方法。方法采用生物发光方法分别检测重组分支杆菌噬菌体对不同细菌在不同浓度利福平培养其中的发光水平,并与罗氏培养基进行药敏药比较。结果在不同细菌中,噬菌体均特异地对分支杆菌有发光反应,分支杆菌的养基进行药敏试验比较。结果在不同细菌中,噬菌体均特异对对分支杆菌有发光     

应用噬菌体裂解法快速鉴定结核分支杆菌

目的 研究噬菌体裂解试验对结核分支杆菌快速鉴定的意义。方法 应用结核分支杆菌噬菌斑技术快速检测结核分支杆菌、非结核分支杆菌和非分支杆菌及肺结核患者痰标本。结果 结核分支杆菌H37Rv、牛分支杆菌和非洲分支杆菌噬菌体裂解试验均为阳性,10株常见非结核分支杆菌和7株非分支杆菌均为阴性;30株结核分支杆菌临床分离株本法检测结果全部阳性;20份涂阳培阳肺结核患者痰标本,本法阳性19份（95％）;21份涂阴培阳痰标本,本法阳性15份（71％）;19份涂阴培阴痰标本,5份阳性（26％）。结论 噬菌体裂解试验可以快速鉴定结核分支杆菌,用其检测痰标本中的结核分支杆菌具有很高的特异性和较高的敏感性。     

利用噬菌体生物扩增法快速检测痰标本中结核分支杆菌

目的探讨噬菌体生物扩增（PhaB）法在快速检测痰标本结核分支杆菌（MTB）中的临床应用价值。方法应用PhaB法检测103例痰标本MTB,并与改良罗氏培养法检测结果进行比较。结果103例痰标本PhaB法与培养法检测MTB均阳性67例,均阴性25例,两法不相符11例。如以培养法结果为判断标准,则PhaB法检测痰标本MTB的敏感性、特异性、阳性预测值（PPV）、阳性预测值（NPV）及准确性分别为94.9%（67/71）、73.5%（25/34）、90.5%（67/74）、86.2%（25/29）、89.3%（92/103）。PhaB法对涂阳标本检出率为88.6/%（62/70）,对涂阳培阳标本检出率为93.9%（62/66）,对涂阴培阳标本检出率为100%（5/5）。33例涂阴痰标本PhaB法检测MTB阳性率（36.4%）高于培养法（15.2%）,差异显著（χ^2=5.14,P〈0.05）。结论PhaB法检测测痰标本MTB具有较高的敏感性和特异性,只需要2天时间,简便快速,不需要特殊仪器设备,费用低廉,可作为MTB检测快速筛选方法。     

噬菌体在结核分支杆菌研究中的应用

从 1 947年第一个分支杆菌噬菌体被分离到现在 ,陆续发现的分支杆菌噬菌体超过 2 50种。分支杆菌噬菌体是一种ＤＮＡ病毒 ,因对分支杆菌有特异性而得名。 1 947年 ,Ｇａｒｄｎｅｒ首次分离并命名了分支杆菌噬菌体。之后 ,不同种分支杆菌噬菌体陆续被分离 ,迄今为止 ,从不同来源的标本中分离的分支杆菌噬菌体已超过 2 50种。随着人类对噬菌体结构和功能的不断了解 ,噬菌体作为一种研究工具的功能正逐步被开发 ,一些相关机制正逐步被阐明。分支杆菌噬菌体Ｌ5、Ｄ2 9的全基因序列已被阐明 ,必将对噬菌体研究领域产生重要影响[1 ] 。分支杆菌噬…     

鲍曼不动杆菌噬菌体ZZ2生物学特性研究

目的研究鲍曼不动杆菌裂解性噬菌体ZZ2的生物学特性。方法电镜观察ZZ2形态,并研究其噬菌谱、生长曲线及稳定性等生物学特性。结果ZZ2可在3株鲍曼不动杆菌（AB09V,AB0901,AB0904）菌苔上形成裂解性噬菌体所具有的完全透明的滴斑区,其中AB09V是其最敏感的宿主菌。电镜观察ZZ2具典型的有尾噬菌体目肌尾病毒科病毒的形态特征;一步生长曲线显示ZZ2感染AB09V的潜伏期为12min,裂解量为（191±5）PFU／细胞。稳定性试验显示ZZ2在pH4～9及50℃和60℃环境均具良好稳定性。结论噬菌体ZZ2能杀灭鲍曼不动杆菌,可作为生物抗菌剂使用。     

结核分支杆菌L型

结核分支杆菌属于容易发生细胞壁缺陷变异的细菌 ,其不但能够被多种因素诱导发生细胞壁缺陷变异 ,而且在其生长繁殖的过程常常可自发形成细胞壁缺陷细菌。细胞壁缺陷结核分支杆菌 (ｃｅｌｌｗａｌｌｄｅｆｉｃｉｅｎｔＭ .ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ)存在的现象早已在临床标本或人工培养基内发现 ,曾将其称为“Ｍｕｃｈ颗粒”或认为是结核分支杆菌生长繁殖周期的一个环节[1 ] 。近年来的研究证实结核分支杆菌丧失细胞壁成为Ｌ型后仍然能够生长繁殖 ,其生物学特性、致病性、药物敏感性或染色体ＤＮＡ结构等特性可发生改变。一、结核分支杆菌Ｌ…     

噬菌体生物扩增法快速测定结核分支杆菌丁胺卡那霉素耐药性的研究

目的 建立快速测定结核分支杆菌(MTB)丁胺卡那霉素耐药性的噬菌体生物扩增法,并探讨其在结核分支杆菌丁胺卡那霉素耐药性测定中的应用价值.方法 应用噬菌体生物扩增法测定112株结核分支杆菌丁胺卡那霉素耐药性,并与绝对浓度法结果进行比较,对不符合的菌株采用Baetee MGIT960测定其最低抑菌浓度(MIG).结果 以细菌接种量为10-3mg/ml,药物浓度5μg/ml、37℃作用24 h为药敏试验条件.噬菌体法测定112株结核分支杆菌临床分离株丁胺卡那霉素敏感89株、耐药23株,绝对浓度法敏感91株、耐药21株;两法测定均为敏感87株、均为耐药19株.在6株噬菌体法与绝对浓度法测定结果 不符的菌株中,4株噬菌体法与MIC测定结果 相符合.如以绝对浓度法药敏结果 为判断标准,则噬菌体法测定丁胺卡那霉素耐药性的敏感性为90.48%(19/21),特异性为95.60%(87/91),阳性预测值为82.60%(19/23),阴性预测值为97.75%(87/89),准确性为94.64%(106/112).结论 噬菌体生物扩增法测定丁胺卡那霉素耐药性简便快速,只需2 d时间.操作不需特殊仪器设备,具有很高的敏感性和特异性,可作为MTB的丁胺卡那霉素耐药性快速筛选方法,建议临床推广应用.     

血清抗结核分支杆菌抗体对结核病的诊断价值

目的研究血清抗结核分支杆菌抗体在活动性结核病诊断和病情变化的意义。方法观察血清抗结核分支杆菌抗体在各类结核患者中的敏感性和特异性，与痰涂片及ＰＰＤ皮试的一致性，以及与疾病转归的关系。结果血清抗结核分支杆菌抗体诊断结核病的敏感性为７１．９％，特异性为９１．９％，与痰涂片阳性和ＰＰＤ皮肤试验阳性的一致率分别为８０．２％和６１．６％。抗结核分支杆菌抗体水平与病情变化有一定的相关性。结论血清抗结核分支杆菌抗体可用来诊断活动性结核病及评估结核病的转归。     

血清抗结核分支杆菌抗体对肺结核的疗效监测

目的 研究血清抗结核分支杆菌抗体与肺结核病情变化的相关性,对肺结核疗效评价的实用价值。方法 观察肺结核患者在进展期、吸收好转期、稳定期的血清抗结核分支杆菌抗体水平的变化情况。结果 好转期、稳定期的抗结核分支杆菌抗体的阳性率（２７．５％、１９．５％）与进展期相比有显著差异（Ｐ〈０．０１）。结核抗体阴转率为７５．５％。结论 血清抗结核分支杆菌抗体水平对评价肺结核的疗效有较高的实用价值。     

噬菌体Chy5的生物学和基因组学特征

目的 筛选能感染结核分枝杆菌的溶源性噬菌体,了解其生物学及遗传学信息。方法 从土壤中分离纯化噬菌体;电镜观察噬菌体形态;单斑法测定宿主谱;提取噬菌体DNA,鸟枪法随机测序。采用DNAStar软件包分析基因组成分,Glimmer3.0、GeneMark软件预测基因功能,同时做共线性分析。分离溶源菌,通过紫外线诱导试验、超免反应验证噬菌体溶源性。结果 分离到一株新的噬菌体Chy5,其头部直径(61.5±1.4) nm,尾部长度(114.1±2.1) nm,为长尾噬菌体,可感染敏感及耐药结核菌株。Chy5基因组全长51 214 bp,G+C含量63.60%,与噬菌体D29基因组最相似,有88个推定基因,含有编码整合酶和阻遏蛋白的基因以及attP位点。经紫外线诱导Chy5溶源菌可形成噬菌斑,Chy5与其溶源菌共培养会发生超免反应。结论 分离到一株新的能感染敏感及耐药结核菌的溶源性噬菌体Chy5,其基因组与噬菌体D29相似,有望应用于构建荧光报告噬菌体。     

结核分枝杆菌利福平依赖性的初步研究

目的 从耐利福平（RFP）结核分枝杆菌临床分离株中筛选RFP依赖的菌株,并在小鼠模型中验证RFP依赖现象,同时分析RFP依赖菌株的特征。 方法 采用7H11培养基绝对浓度法对46例临床分离菌株进行RFP依赖菌株筛选。以筛选得到的体外具有典型的RFP依赖现象的05116菌株建立气溶胶感染的小鼠模型,小鼠按照给药的种类和给药单位剂量分成对照组0.5%羧甲基纤维素钠（carboxymethyl cellulose sodium,CMC）、10 mg/kg Rfb（Rfb₁₀）组、10 mg/kg RFP（RFP₁₀）组、20 mg/kgRFP（RFP₂₀）组,每组各10只,观察给药4、8周的体质量、肺荷菌量及组织病理学改变在各组之间差异,以验证小鼠体内是否存在RFP依赖现象。比较RFP耐药株和依赖株的rpoB基因突变位点,以鉴定RFP依赖株的特征。数据以(x±s)表示,采用SPSS 11.0软件,组间比较采用单因素方差分析,以 P<0.01为差异有统计学意义。 结果 从46例RFP耐药的结核分枝杆菌临床分离株中筛选到18例RFP耐药伴依赖的菌株和28例RFP耐药非依赖的菌株。感染小鼠模型给药8周,各组小鼠的活菌计数从高到低依次为：RFP₂₀组（lgCFU为6.60±0.82）、RFP₁₀组（lgCFU为6.44±0.36）、Rfb₁₀组（lgCFU为6.32±0.55）、对照组(lgCFU为6.20±0.28),接近于最初感染的菌量（lgCFU为5.93±0.14）,但与对照组相比差异无统计学意义（F值分别为0.68、2.21、2.45,各组P值均大于0.05）。RFP耐药株8例和依赖株11例,分别有3/8和4/11的菌株在rpoB基因526位发生突变,2/8和6/11的菌株在rpoB基因531位发生突变。 结论 RFP临床耐药株中RFP依赖菌的检出率高,其RFP依赖现象在小鼠体内得到初步验证。RFP耐药株和依赖株的rpoB基因突变位点基本相同,因此RFP依赖的原因是表型变异还是其他因素尚有待进一步的实验证实。     

结核分枝杆菌和牛分枝杆菌TaqMan荧光PCR检测的建立

目的对结核分枝杆菌和牛分枝杆菌分别建立荧光PCR快速检测方法。结核分枝杆菌荧光PCR对H37Rv标准菌株、结核分枝杆菌临床分离株的检测结果呈典型阳性反应，牛分枝杆菌荧光PCR对牛分枝杆菌标准菌株、BCG菌株的检测结果呈典型阳性反应，对其它分枝杆菌菌株以及常见微生物样品为阴性反应。两种荧光PCR对对应阳性重组质粒模板的检测灵敏度可达单个基因拷贝，对结核分枝杆菌或BCG标准菌株的检测灵敏度可达单个菌细胞。对临床样品的检测结果显示，荧光PCR对模拟感染奶样、血样的检测灵敏度可达单个菌细胞。所建立的方法，全过程包括血样、奶样、痰液等临床样品的前处理、核酸提取和荧光PCR检测，可在5～6h内完成。采用上述荧光PCR方法从临床采集的疑似病人痰液中检出多份结核分枝杆菌阳性样品。     

AmpliSensor-聚合酶链反应技术检测结核分支杆菌及临床应用

目的探讨Ａｍｐｌｉｓｅｎｓｏｒ－聚合酶链反应（ＡｍｐｌｉＳｅｎｓｏｒ－ＰＣＲ）在结核病诊断中的价值。方法采用ＡｍｐｌｉＳｅｎｓｏｒ－ＰＣＲ对７８４例结核病患者及１６０例肺癌患者的标本进行检测，并与ＰＣＲ（凝胶电泳后，经溴化乙锭染色）、涂片、培养等法比较。结果ＡｍｐｌｉＳｅｎｓｏｒ－ＰＣＲ的敏感性显著高于涂片及培养（Ｐ＜０．０１）。特异性较ＰＣＲ法高。结论ＡｍｐｌｉＳｅｎｓｏｒ－ＰＣＲ可以通过标准曲线划定检出下限，并可换算出标本中原始的靶ＤＮＡ值，同时具有较高的特异性和敏感性，对肺结核尤其是肺外结核的诊断有一定的临床意义。     

结核分枝杆菌黏附素HBHA在结核病免疫学诊断中的应用

目的 探讨结核分枝杆菌肝素结合血凝黏附素(Heparin-binding haemagglutinin adhesin,HBHA)在结核病免疫诊断方面的应用价值.方法 将在苏通培养基中培养至稳定期的卡介苗菌株(BCG)菌体超声裂解,离心后取上清并通过CL-6B层析柱,利用含0～500 mmol/L氯化钠的磷酸盐缓冲溶液(PBS)进行梯度洗脱后获得天然HBHA.以BCG基因组为模板PCR扩增结核分枝杆菌hbha基因片段,质粒pET-32a为载体,大肠杆菌作为宿主菌制备原核表达的HBHA重组蛋白.以纯化的天然HBHA蛋白和原核表达的HBHA蛋白为包被抗原,分别对肺结核组、肺外结核组、PPD阳性和PPD阴性健康对照组各47例血清通过ELISA方法检测抗HBHA的抗体水平.应用SPSS 11.5统计软件对各研究组数据进行方差齐性检验,然后进行t检验,并计算各研究组的敏感度和特异度.结果 含有375 mmol/L氯化钠的PBS洗脱液可以洗脱获得较纯的天然HBHA蛋白.利用重组HBHA所带的组氨酸标签进行特异分离、纯化.ELISA检测结果表明天然HBHA蛋白和重组HBHA蛋白、PPD阳性和PPD阴性健康对照组之间血清抗体水平差异不明显.肺结核组与肺外结核组的血清抗体ELISA检测的吸光度值在散点图中分布有明显差异,肺结核组吸光度值集中分布在0.30～0.40之间,肺外结核组吸光度值分布在0.35～0.45之间,经统计学检验结果差异具有统计学意义(t=12.224,P＜0.05).结核组(肺结核和肺外结核)与对照组(PPD阴性,PPD阳性)吸光度值分布具有显著不同,对照组全部小于0.30,结核组吸光度值则集中分布于0.30～0.45之间.经统计学检验(t=25.909,P＜0.05)血清抗体水平具有显著性差异.结论 结核分枝杆菌黏附素HBHA在结核病免疫学诊断的应用中具有较好的特异度和敏感度,有望用于结核病、尤其是肺外结核病的实验室辅助诊断.     

结核分枝杆菌相关毒力基因的研究进展

在结核病的发生过程中,毒力起着重要的作用,因为只有毒力菌株才可致病.结核菌的毒力可以理解为其引起结核病的能力,而致病性与毒力因子总是联系在一起的.结核菌是典型的胞内寄生菌,但只有有毒株才能在细胞内存活和繁殖.毒力因子在毒力株的巨噬细胞复制中起关键作用,目前对毒力相关基因及毒力因子作用机制知之甚少.本文将对几个研究较多的毒力相关基因作一综述.     

中国异烟肼耐药结核分枝杆菌基因突变特征分析

目的: 明确中国异烟肼(INH)耐药结核分枝杆菌基因突变的分子特征。方法: 在PubMed、中国知网、万方、维普数据库中检索有关中国结核分枝杆菌耐INH基因突变的研究文献,对纳入文献的突变基因的突变位点、突变类型,以及氨基酸改变数量等信息进行整合分析。结果: 共纳入69篇中英文文献,共6393株INH耐药结核分枝杆菌。95.71%(6119/6393)检测到基因突变或缺失,其中katG、inhA、aphC突变数量最多,分别占77.57%(4959/6393)、15.20%(972/6393)、3.69%(236/6393)。单基因单位点突变占87.80%(5613/6393),联合突变占12.20%(780/6393)。katG315突变占INH耐药菌株总数的56.22%(3594/6393),katG463突变占10.03%(641/6393),inhA15突变占10.10%(646/6393)。突变形式最常见的是C→T,占10.03%(641/6393)。结论:中国INH耐药结核分枝杆菌突变基因最多的是katG、inhA、ahpC,突变密码子最多的是katG315、katG463、inhA15。     

结核分枝杆菌L型细菌的研究进展

结核分枝杆菌L型由于其细胞壁缺陷,其形态表现为多形性特点,并可以逃避机体免疫而长存于患者体内,由于其在普通培养基内不容易生长,而导致误诊、漏诊、复发.L型菌感染有可能与某些疾病的发生有关.本文对结核分枝杆菌L型的形成、生物学特点、检测、诊断技术、遗传学、致病性等方面进行阐述.     

中国东部农村地区结核分枝杆菌北京基因型菌株的成簇性及耐药特征研究

目的 探讨MTB北京基因型在人群中的分布及其耐药类型和相关分子特征.方法 江苏省灌云县和浙江省德清县1年内登记确诊的结核病患者399例,分离出MTB菌株者351例,其中男237例,女114例;年龄18～82岁,平均(46±35)岁.采用比例法确定分离株对一线抗结核药物的耐药类型,用直接基因测序识别耐药相关的基因突变,用间隔区寡核苷酸分型技术识别MTB北京基因型,以IS6110限制性内切酶片段长度的多态性(IS6110 IS6110-RFLP)技术确定MTB基因型及其成簇性和惟一性.结果 在分离得到的351株MTB菌株中北京基因型243株,北京基因型患者中耐多药、耐异烟肼和耐利福平分别占18.5%(45/243)、43.2%(105/243)和22.2%(54/243),明显高于非北京基因型[7.4%(8/108)、24.1%(26/108)和12.0%(13/108)];北京基因型菌株中rpoB和katG基因的联合突变率较高,分别为13.2%(32/243)和 4.6%(5/108),OR=2.553,95%CI为1.031～6.324;北京基因型菌株的成簇率[41.2%(100/243)]明显高于非北京基因型[11.1%(12/108)],OR=5.503,95%CI为2.851～10.622.结论 在我国东部农村地区,感染北京基因型菌株的结核病患者发生耐异烟肼、耐利福平和耐多药结核病的危险性较大,其发病有可能由于近期传播所致.

Abstract：

Objective To investigate the distribution of Mycobacterium tuberculosis (MTB) Beijing genotype, which was isolated from tuberculosis (TB) patients registered in local TB dispensaries in Deqing and Guanyun county respectively within 1 year, as well as its drug-resistant phenotypic and genotypic profiles and genotyping features. Methods A total of 399 TB patients were enrolled from 2 counties. Of the 351 TB patients with MTB isolates available, 237 were male, and 114 were female; aged from 18-82 (46±35) years . The proportion method and DNA sequencing were used to define the susceptibility of the isolates to 4 first line anti-TB drugs and the related mutation. Beijing genotype MTB strains were identified by Spoligotyping, while the "cluster" strains and the "unique" strains were defined by IS6110 restriction fragment length polymorphism (RFLP). Results Beijing genotype MTB strains were identified in 243 of the 351 strains isolated, and the proportion of multi-drug resistance, mono-resistance to rifampin and isoniazid among Beijing genotype MTB was 18.5% (45/243), 43.2% (105/243) and 22.2% (54/243) respectively, all being significantly higher than the non-Beijing genotype MTB, 7.4% (8/108), 24.1% (26/108) and 12.0% (13/108) respectively. katG and rpoB mutations were observed more common among Beijing genotype MTB than among non-Beijing genotype MTB, 13.2% (32/243) and 4.6% (5/108) respectively, OR=2.553, 95%CI: 1.031-6.324. The Beijing genotype MTB was more likely to be clustered than non-Beijing genotype MTB, 41.2% (100/243) and 11.1% (12/108) respectively, OR=5.503, 95%CI: 2.851-10.622. Conclusions In eastern rural China, TB patients infected with the Beijing genotype MTB may have a higher risk to develop isoniazid-or rifampin-resistance and multi-drug resistance. The disease is more likely due to recent transmission.     

结核分枝杆菌肝素结合血凝黏附素与结核病

结核分枝杆菌肝素结合血凝黏附素是一种表面蛋白,有3个功能结构域,其C末端在翻译后进行甲基化修饰,与其免疫特性相关.可结合硫酸化糖,可通过补体C3介导与巨噬细胞的结合,与上皮细胞结合在肺外结核发病中有重要作用.通过对其细胞免疫及体液免疫作用的研究发现,其在诊断中有较好的作用,在免疫预防及免疫治疗中有广阔的应用前景.