重组禽呼肠孤病毒S1133 σ3基因表达及其免疫原性研究

[目的]构建禽呼肠孤病毒(ARV)S1133 σ3基因的真核重组质粒,研究其表达蛋白的免疫原性,为研发ARV基因疫苗奠定基础.[方法]采用RT-PCR对ARV S1133毒株的σ3基因进行RT-PCR扩增,扩增产物与真核表达载体pcDNA3.1(+)连接后,转化大肠杆菌DH5α,然后提取重组质粒的DNA,经双酶切、PCR扩增鉴定和纯化.以阳性重组质粒pcDNA3.1-σ3免疫7日龄SPF雏鸡,同时设灭活S1133、表达σ3蛋白及生理盐水对照,二次加强免疫两周后,采用Western blotting检测鸡群血清抗体;并用S1133毒株进行攻毒,4 d后进行ARV检测.[结果]重组质粒pcDNA3.1-σ3的双酶切和RT-PCR扩增鉴定结果一致,均能扩增出约999 bp目的条带;免疫攻毒试验结果表明,pcDNA3.1-σ3处理、灭活S1133处理、表达σ3蛋白处理和生理盐水处理的病毒检出率分别为7.4%、3.7%、11.1%和29.6%,pcDNA-σ3处理与生理盐水处理的差异显著(P<0.05),但与灭活S1133处理、表达σ3蛋白处理的差异不显著(P>0.05);病毒检出部位最高是关节,其次是胸腺和肾脏,胸腺检出率为零.[结论]真核表达ARV S1133 σ3蛋白具有较好的免疫保护,可作为免疫抗原进行下一步的疫苗中和试验.     

禽呼肠孤病毒C-98、T-98分离株S4基因的克隆与序列分析

参考GenBank中禽呼肠孤病毒176株(ARV 176)S4基因序列设计两对引物,分别提取禽呼肠孤病毒T-98和C -98分离株病毒总RNA,应用RT - PCR技术扩增病毒的S4基因,将纯化的目的DNA与pEASY - T1载体连接、转化后测序.应用计算机软件将所测定序列与参考毒株序列进行比较,结果显示,S4基因核苷酸序列长为1 192bp,均含1个完整的开放性阅读框(24-1 127).ARV T - 98和ARV C - 98分离株S4基因的核苷酸同源性很高,为99.9％;与参考毒株ARV 1733、ARV S1133、ARV 750505、ARV 601SI、ARV 919、ARV T6、ARV OS161和DRV YJL S4基因的核苷酸同源性均较高,在99.4％ -99.9％之间;与ARV 601G、ARV 1017 -1、ARV 916、ARV 918和DRV S14S4基因的核苷酸同源性在80.1％ -83.6％之间;与NBV、BRV和MRV 3的S4基因核苷酸同源性在2.4％-53.1％之间.进化树分析显示:11株禽呼肠孤病毒分离株和ARVT - 98、C -98分离株的S4基因可分成3个不同的系谱.     

禽呼肠孤病毒分离株σ2蛋白基因克隆及序列分析

为了解禽呼肠孤病毒（ARV）广西分离株与常用疫苗株在基因水平上的差异,将从广西某鸡场分离获得的2株ARV（R1、R2）分离株的σ2蛋白基因经RT-PCR扩增后,连接pMD18-T载体并转化大肠杆菌DH5α,重组质粒经PCR、双酶切鉴定及序列分析。结果表明,2株ARV分离株的σ2蛋白基因已成功克隆到质粒载体上;经序列分析发现,2株ARV分离株与ARV标准株S1133的核苷酸同源性分别高达99.2%和99.3%,其推导的氨基酸同源性分别高达98.1%和98.4%;两分离株间的核苷酸同源性为99.7%,其推导的氨基酸同源性为98.5%,具有很高的同源性。     

番鸭呼肠孤病毒分子流行病学研究

选取1998～2009年福建省不同地区番鸭中分离到番鸭呼肠孤病毒分离株中具有代表性的10株,用RT-PCR技术扩增其S1和S4基因的功能区片段,进行序列测定.序列分析表明所扩增的S1基因的目的片段为819bp,S4基因目的片段为992 bp.参照国内外已发表的部分毒株S1和S4基因序列,构建番鸭呼肠孤病毒的遗传进化树,分析遗传进化关系.国内各分离株S1基因同源性为92.2％～96.7％,与国外89026株同源性为88.5％～92.8％,与禽呼肠孤病毒S1133株同源性为76％～78％.国内各分离株S4基因同源性为95.2％～99.3％,与国外89026株同源性为92.3％～94.5％,与禽呼肠孤病毒S1133株同源性为21.2％～21.5％.通过遗传进化树可以看到MDRV与同属的ARV序列形成了2个大分支,而MDRV序列分为2个小分支:一支为10株分离株和国内分离株,说明国内分离株没有明显差异;一支为国外分离株89026株,这说明国内分离株与国外毒株存在地域差异.     

禽呼肠孤病毒σ3基因在烟草中的表达与鉴定

【目的】研究禽呼肠孤病毒S1基因编码的σ3基因在烟草中的表达及其表达产物的反应原性。【方法】根据Gen Bank中公布的禽呼肠孤毒株S1133的基因序列,设计特异引物扩增σ3基因,构建重组植物表达载体p BI121-σ3,热激法转化农杆菌EHA105感受态细胞,筛选含有重组质粒的p BI121-σ3的阳性工程菌株EHA105。采用农杆菌介导的叶盘法转化野生型烟草,卡那霉素筛选获得抗性植株。随后通过σ3基因的特异引物,PCR方法初步筛选获得转σ3基因的烟草植株。进一步对阳性植株通过实时荧光定量PCR方法检测σ3基因在转基因烟草中的拷贝数,以烟草自身单拷贝的内源基因核糖核酸还原酶-RNR2作为内参基因,通过梯度稀释分别构建RNR2及σ3基因的起始模板量和对应CT值的标准曲线,通过检测样品中σ3基因和RNR2基因模板量对数值的比值估算出σ3基因在转基因烟草中的拷贝数。并通过Western-blotting方法对转基因烟草中表达的σ3融合蛋白的反应原性进行分析。【结果】1通过双酶切和测序验证表明σ3基因插入位置、大小和读码框均正确,表明σ3基因已经成功的构建于植物表达载体p BI121的花椰菜花叶病毒(Ca MV)35S启动子的下游,以NOS为终止子,含有卡那霉素抗性标记(NPT II)。其表达的蛋白与下游的绿色荧光蛋白形成融合蛋白,其大小约为61.6 ku;2在转化筛选抗性植株的过程中采用350 mg·L-1的头孢霉素可以很好地抑制农杆菌的污染,100 mg·L-1的硫酸卡那霉素筛选压力能够很好地抑制非转化细胞的生长;3随机选取10株转化烟草进行PCR检测发现8株转化烟草可以扩增到清晰的目的条带约994 bp;4内参基因RNR2的标准曲线为y=-3.5352x+15.143,σ3基因的标准曲线为y=-3.5366x+1.8265,两个标准曲线的相关系数均接近于1。在检测的5株转化烟草中σ3基因的拷贝数均为4,阴性对照没有扩增。5Western-blotting显示σ3融合蛋白在转化烟草中可以正确表达,目的条带大小约为61.6 k D,与预计大小一致;σ3融合蛋白能够与禽呼肠孤病毒的阳性血清发生特异反应,表明该融合蛋白具有良好的反应原性。【结论】成功地构建了植物表达载体p BI121-σ3,筛选获得低拷贝的转σ3基因的烟草,σ3融合蛋白能够在烟草中表达且具有相应的反应原性,为进一步研究σ3基因的功能和利用植物作为生物反应器生产σ3蛋白口服疫苗的研发奠定了基础。     

基于纳米材料电化学免疫传感器检测禽呼肠孤病毒研究

【目的】构建一种用于检测禽呼肠孤病毒(ARV)的新型电化学免疫传感器。【方法】将石墨烯(G)和甲壳胺(Chi)分散在乙酸溶液中得到均匀的混合物后,加入HAuCl4溶液于80℃还原成金纳米粒子（AuNPs）,得到石墨烯-甲壳胺-金纳米粒子(G-Chi-AuNPs)纳米复合物。将石墨烯(G)和甲壳胺(Chi)分散在乙酸溶液中得到均匀的混合物后,先加入AgNO3溶液于80℃还原成银纳米粒子（AgNPs）,再加入禽呼肠孤病毒单克隆抗体(ARV-MAb),得到石墨烯-甲壳胺-银纳米粒子-禽呼肠孤病毒单克隆抗体（G-Chi-AgNPs-ARV-MAb）纳米复合物。将G-Chi- AuNPs纳米复合物修饰金电极作为传感器平台,固定待检测样品,然后加入G-Chi-AgNPs-ARV-MAb纳米复合物,并对G-Chi-AgNPs-ARV-MAb纳米复合物的孵育时间进行优化,构建了ARV电化学免疫传感器。使用构建的ARV电化学免疫传感器,对禽流感（H5N1、H3N6和H9N2亚型）、新城疫病毒（NDV）、喉气管炎病毒（LTV）、传染性支气管炎病毒（IBV）和传染性法氏囊病毒(IBDV)进行检测,以确定ARV电化学免疫传感器的特异性。使用构建的ARV电化学免疫传感器,对106.5-100.5 TCID50/mL的病毒进行检测,以确定ARV电化学免疫传感器的敏感性试验。使用构建的ARV电化学免疫传感器,对临床样品进行检测,其确定ARV电化学免疫传感器的实用性。【结果】所建立的ARV电化学免疫传感器,G-Chi-AgNPs-ARV-MAb纳米复合物的最佳孵育时间为40 min。当检测的样品为阳性时,ARV与ARV-MAb特异结合,G-Chi-AgNPs-ARV-MAb纳米复合物被固定到电极的表面使其线性伏安曲线出现AgNPs的氧化峰;当检测样品为阴性时,其线性伏安曲线不出现AgNPs的氧化峰。特异性结果表明,所建立的方法仅对ARV的检测为阳性（出现AgNPs的氧化峰）,而对非目标禽流感（H5N1、H3N6和H9N2亚型）、NDV、LTV、IBV和 IBDV的检测为阴性（不出现AgNPs的氧化峰）。敏感性结果表明,所构建的ARV电化学免疫传感器,具有很高的敏感性,对ARV检测的敏感性达101.5 TCID50/mL。使用建立的ARV电化学免疫传感器对22份临床样品进行检测,结果与病毒分离方法相符。【结论】所建立的ARV电化学免疫传感器,具有特异性强、敏感度高及快速的特点,为有效检测诊断禽呼肠孤病毒提供了一种新的快速检测诊断技术。     

呼肠孤病毒3型S1基因在Sf9昆虫细胞中的表达

利用杆状病毒表达系统对呼肠孤病毒3型S1在Sf9昆虫细胞中进行表达,为研究Reo-3σ1蛋白功能及建立呼肠孤病毒3型血清学诊断方法奠定基础。采用PCR方法扩增全长为1 416bp的Reo-3S1基因,将其插入杆状病毒转座载体pFastBacHTA,构建的重组质粒pFastBacHTA-S1再转化到DH10Bac感受态细胞中,经三重抗性与蓝白斑筛选,获得杆状病毒重组质粒Bacmid-S1,用脂质体介导法转染昆虫细胞获得重组病毒rBS。免疫荧光法（IFA）和western-blotting检测结果表明,S1基因在Sf9昆虫细胞中表达出约为50 kD的重组蛋白,且具有免疫原性。这是国内首次通过Bac-to-Bac杆状病毒表达系统成功表达出了具有免疫原性的Reo-3σ1蛋白,为进一步研究单克隆抗体的制备和血清学抗体水平检测研究奠定了基础。     

利用σ 3和σ 2重组蛋白检测禽呼肠孤病毒抗体ELISA的建立

将纯化好的两个ARV结构蛋白σ3和σ2作为包被用抗原,分别进行间接ELISA,并确定它们的最佳抗原包被浓度分别为9．5、12．0μg／mL;一抗血清的稀释度为1：200;HRP酶标羊抗鸡IgG稀释度为1：5000,初步建立了能检测ARV抗体的σ3-ELISA、σ2-ELISA以及σ3、σ2两个蛋白同时包被的σ3-σ2-ELISA检测方法。分别用上述3种方法对制备的ARVSPF鸡阳性血清进行检测,结果阳性检出率分别为90．91％、69．70％和100％。表明σ3-σ2-ELISA方法在ARV抗体检测方面具有较高的敏感性。     

禽传染性支气管炎病毒S1基因植物表达载体的构建

以含传染性支气管炎病毒（ZJ971毒株）S1基因的质粒PBS为模板,根据其序列设计引物进行PCR扩增,得到1.7kb左右的S1基因产物；用XbalI和BamHI酶切纯化，并在T4DNA连接酶的作用下，定向克隆到植物表达载体PBI121中,PCR及酶切鉴定表明，质粒经三亲交配已导入根癌农杆菌中。     

鸡传染性支气管炎病毒H52毒株S基因的克隆及序列分析

将含有鸡传染性支气管炎病毒(IBV)H52毒株的尿囊液浓缩,用TRIzol 试剂抽提病毒RNA作为反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)的模板,参照已发表的IBV-Beaudette 株S基因序列,设计并合成一对特异性引物,扩增得到长度约3.6 kb 的S基因片段,利用引物设计中EcoR I和BamH I 酶切位点插入到克隆载体pBlueScript SK 的多克隆位点中,转化感受态E.coli DH5α.经酶切分析和PCR等方法鉴定,筛选出阳性克隆,进行核苷酸序列测定,证实获得了S 基因的全长序列.利用DNAstar等分析软件与GenBank中其它IBV毒株的核苷酸及其推导的氨基酸进行序列同源性比较分析,结果表明,H52毒株与已报道的核苷酸的同源性在83.45%～99.71%之间,氨基酸的同源性在82.10%～99.26%之间.     

11株禽多杀性巴氏杆菌OmpA基因克隆测序及其序列分析

为了解国内禽多杀性巴氏杆菌流行株（Pasteurella multocida,Pm）OmpA基因的变异情况,参考GenBank中已发表的多杀性巴氏杆菌序列设计一对特异性引物,采用PCR方法对11个禽Pm菌株和3个荚膜型参考株（A,B,D）的OmpA基因进行扩增,将各菌株纯化回收的扩增产物与pMD18-T载体连接,筛选阳性克隆进行测序。结果表明：14个菌株的OmpA基因开放阅读框在1 047～1 077 bp之间,其中长度为1 062 bp的有9个菌株;Signal IP 4.0预测表明,信号肽均为N端21个氨基酸残基,成熟蛋白氨基酸残基数量在327～332之间,推测的分子量为35.19～36.35 kD。与GenBank中12个菌株OmpA基因核苷酸序列比对及遗传进化分析发现,核苷酸同源性为85.3%～100%;氨基酸同源性为83.1%～100%;其中C48-1,1010,9003,890920,921012,xj等6个国内禽Pm分离株OmpA序列同源性为100%。由此可见国内禽Pm菌株OmpA基因非常保守。     

白鹭源禽I型副粘病毒L基因的克隆与序列分析

根据GenBank中已发表的鹅副粘病毒GPV—SF02株全基因组序列设计5对引物,采用RT—PCR扩增出白鹭源禽I型副粘病毒（W13株）L基因的IJA（1121bp）、LB（1481bp）、LC（1439bp）、LD（1476bp）、LE（1608bp）5个片段,用DNAStar软件比较分析后进行拼接,获得长约6760bp包含有L基因全长的核苷酸序列,而W13株L基因的mRNA全长为6704bp、开放阅读框（ORF）为6615个碱基、编码2204个氨基酸。氨基酸同源性分析表明：W13株I基因与鹅源SF02、ZJI、NA-1株及鸡源Guangxi7株的同源性均超过97．0％;而核苷酸同源性分析表明：W13株L基因与鹅源SF02、ZJI、NA-1株及鸡源Guangxi7株的同源性均超过93．0％。可见,W13株与鹅源SF02、ZJI、NA-1株及鸡源Guangxi7株的亲缘关系较近。     

鸡传染性支气管炎病毒S1,M和N基因遗传变异相关性

对山东省1992—2005年分离的鸡传染性支气管炎病毒(IBV)毒株的纤突蛋白(S1)、膜蛋白(M)和核衣壳蛋白(N)分别进行克隆测序,结合在GenBank中发表的其他具有S1,N和M基因的IBV参考序列,利用DNAStar软件和统计学软件SPSS8.0,对不同毒株的S1,N和M基因分别进行遗传变异和同源性相关分析。结果表明:不同毒株间S1基因与M基因核苷酸遗传变异的相关系数为0.483,S1基因与N基因核苷酸遗传变异的相关系数为0.570,M基因与N基因核苷酸遗传变异的相关系数为0.620,说明S1,M和N基因三者之间的遗传变异既有同步性又有独立性。通过S1,N基因推导的氨基酸系统进化树表明,9株山东野毒株具有较近的亲缘关系,变异方向一致,且与疫苗株的亲缘关系较远,但从M基因推导的氨基酸系统进化树分析,只有3株山东野毒株与部分疫苗株有一定的亲缘关系。由此表明,IBV存在基因重组现象。     

5株H9N2亚型禽流感病毒HA、NA基因的序列分析

为了从分子生物学角度了解H9N2亚型禽流感病毒（AIV）在广西的遗传变异情况,对5株不同年代的广西H9N2亚型AIV的HA和NA基因进行克隆测序及同源性、遗传进化分析。结果表明,5株分离株均为低致病性AIV（LPAIV）,HA、NA基因均属于欧亚谱系中的DK/HK/Y280/97（第I亚群）,与我国代表株CK/BJ/1/94HA基因核苷酸、氨基酸同源性为93.5%～95.9%,NA基因核苷酸、氨基酸同源性为93.8%～95.8%。分离株DK/GX/51/05、CK/GX/55/05HA基因第226位氨基酸由谷氨酰胺（Gln）突变为亮氨酸（Leu）,具备人类流感病毒的受体特征,而在糖基化位点方面,除了CK/GX/6/00HA基因的第218位发生变异以外,5株分离株HA基因上其余各糖基化位点均未发生变异;分离株DK/GX/51/05、CK/GX/55/05、QA/GX/B1/06NA基因均缺失第63、64、65位3个氨基酸,导致1个糖基化位点缺失,而CK/GX/6/00、WB/GX/A1/06NA基因则未发生缺失。     

鸡肾型IBV地方分离株N基因的克隆及分子遗传变异分析

用RT-PCR方法对分离于陕西省不同地区的8个鸡肾型IBV毒株的Ⅳ基因分别进行了扩增,将各扩增产物与T载体连接后,转化感受态细胞筛选阳性克隆质粒并进行基因测序,用DNAstar软件将这8个毒株与GenBank收录的7个IBV代表毒株的Ⅳ基因进行了比较分析,研究了其变异情况。结果表明,B01,YL,WH和 YX株与7株代表毒株的同源性较高,而G,BJ,WG,FF株与7个代表毒株的同源性相对较低。氨基酸推导序列比对结果表明,N蛋白突变以散在的点突变形式为主,其中46,48,50,75,78,189,232,236,237,299,301,350,366等位点容易发生突变,突变位点无明显规律性。