应用PCR方法检测奶牛乳房炎主要病原菌

为建立一种在分子水平快速检测乳房炎主要病原菌的方法,根据GenBank已发表的序列设计了3对特异性引物,结果可同时检测奶牛乳房炎的3种主要病原菌:金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和无乳链球菌。其特异性为100%,敏感性检测的最低浓度为:1.25×103cfu/mL。     

奶牛乳房炎4种主要病原菌PCR检测鉴定方法研究

奶牛乳房炎是危害奶牛业的一种重要疾病,它不仅影响奶牛的产奶量,而且降低牛奶的品质,影响人体健康以及延长奶牛产后发情和妊娠时间。奶牛乳房炎的发生较复杂,物理性刺激、化学性刺激及饲养管理不善等均可作为诱发因素,使乳房感染致病性或条件致病性微生物,进而发生乳房炎[1]。据有关报道[2~5]和我们调查,引起奶牛乳房炎的主要病原菌有金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、停乳链球菌、大肠杆菌、乳房链球菌以及其他细菌、真菌、病毒、霉形体等百余种微生物,其中以金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、停乳链球菌和大肠杆菌最为常见。在临床上,由于奶牛乳…     

奶牛乳房炎病原菌的PCR诊断技术研究进展

奶牛乳房炎是奶牛最常见的疾病之一,不仅给养殖者造成重大的经济损失,还影响乳的品质,危及人类的健康.目前,乳房炎病原菌的常规微生物检测方法存在时间较长、灵敏度不高、费用较高、操作繁琐等缺点.随着分子生物学技术的快速发展,分子诊断技术的应用愈发广泛.本文就普通PCR法、多重PCR法和实时荧光定量PCR法等分子生物学技术在奶牛乳房炎病原菌诊断上的应用研究作一综述,并对其发展前景进行了分析展望.     

奶牛乳房炎中大肠杆菌PCR检测方法的初步建立

大肠杆菌是引起奶牛乳房炎的一种主要细菌.为了建立PCR直接检测奶牛乳房炎致病菌的方法,本试验以大肠杆菌为主要研究对象,根据已发表的致病性大肠杆菌16-23S rRNA特异性序列设计并合成一对引物,对昆明市的某发生奶牛乳房炎的病牛的牛奶进行大肠杆菌PCR检测,并对扩增片段进行序列分析,建立一种直接从牛奶中检测大肠杆菌的PCR快速诊断方法.结果表明,该方法能够检测到乳样中的大肠杆菌,而且具有快速、准确和特异的优点.     

奶牛乳房炎主要病原菌基因检测技术研究进展

奶牛乳房炎是奶牛三大疾病之一,给奶牛业带来严重经济损失的同时,也间接影响人类的健康。奶牛乳房炎主要病原菌快速、准确的诊断对奶牛乳房炎的治疗与预防具有重要的意义。文章全面综述了PCR、real-time PCR、基因芯片和环介导等温扩增(LAMP)技术在奶牛乳房炎主要病原菌诊断中的应用,旨在为奶牛乳房炎的综合防制提供参考。     

奶牛乳房炎相关链球菌PCR检测方法的建立

利用编码3-磷酸甘油醛脱氢酶的gapC基因具有高度特异性的特点,建立PCR方法鉴定与奶牛乳房炎相关的链球菌。根据已有gapC基因序列设计1对引物,以分离自患乳房炎奶牛乳样的10株革兰阳性球菌、10株革兰阳性杆菌、10株革兰阴性杆菌作为待检菌株,进行PCR扩增。结果表明,在10株革兰阳性球菌中,有8株球菌可以扩增出约1011bp的目的条带,而其他2株革兰阳性球菌及20株杆菌均无相应PCR产物出现。通过传统的生化鉴定与16S rDNA序列分析相结合证实,能扩出gapC基因的8株革兰阳性球菌分别为乳房链球菌(Streptococcus uberis)、牛链球菌(S.bovis)与猪链球菌(S.suis)。说明基于gapC基因的PCR方法,用于鉴定奶牛乳房炎相关链球菌具有较强的特异性。     

多重PCR快速检测奶牛乳房炎3种主要病原体

奶牛乳房炎是引起奶牛业经济损失的一种重要疫病,目前还没有快速、特异检测奶牛乳房炎主要致病原的方法。本试验根据金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、大肠杆菌各自保守的16S或23S rRNA基因序列,合成了3对特异性引物,建立了三重PCR检测方法。特异性试验表明,该方法对所有参与测试的金黄色葡萄球菌、无乳链球菌和大肠杆菌都能扩增出各自的阳性条带,而对所有参与测试的对照菌株则不能扩增出任何条带。敏感性试验表明该方法能检测到4个菌的金黄色葡萄球菌、无乳链球菌和2个菌的大肠杆菌。对送检的乳房炎奶样36份直接进行PCR检测,金黄色葡萄球菌阳性7份,无乳链球菌阳性2份,大肠杆菌阳性6份。     

奶牛乳房炎病原菌耐药性分析

从八五一一农场采集有临床型乳房炎的奶牛的奶样10个，应用纸片平板法，对奶样中的病原菌做17种药物的耐药性试验。药敏试验结果表明：红霉素、庆大霉素等抑菌效果最好，应作为临床治疗奶牛乳房炎的首选药物；其次是沙星类药物的抑菌效果也较好；而病料中病原菌对青霉素、链霉素等的耐药性极强，已不宜再反复应用。     

奶牛隐性乳房炎的主要病原菌的PCR鉴定

基于细菌16SrRNA和（或）23SrRNA序列设计引物，利用PCR的方法鉴定出了奶牛隐性乳房炎的主要病原菌，包括金色葡萄球菌、大肠杆菌和无乳链球菌，避免了繁琐的培养过程，表明PCR技术是细菌鉴定非常有效、特异性高而又快速的方法，对隐乳的诊断很有价值。     

不同血清型牛源巴氏杆菌多重PCR检测方法的建立

巴氏杆菌是引起牛出血性败血症的主要病原之一,其致病血清型主要有荚膜A、B和E型。本试验选择、合成了针对3种不同血清型菌株的引物,建立了检测不同血清型菌株的多重PCR鉴别诊断方法。试验用2.5ngDNA模板即可扩增出目的基因,通过对引进的参考菌株进行检测表明,用该方法进行牛源巴氏杆菌的诊断和菌株分型特异性好,敏感性高。     

多重PCR对禽分枝杆菌亚种鉴定的初步应用

为了建立禽分枝杆菌多重PCR方法,给禽分枝杆菌亚种鉴定及禽结核病的诊断提供参考。本实验根据国外报道的诊断方法设计4对特异性引物,选用我国禽结核参考菌株（CVCC 68201）基因组DNA为模板,优化了退火温度,测定了DNA最小检测量,并进行了特异性检验。采用优化好的多重PCR体系,对国家兽医微生物菌种保藏中心保存的禽分枝杆菌标准菌株进行检测和分类。实验结果表明,禽结核参考菌株（CVCC 68201）能很好的扩增出577 bp（IS901基因片段）、385 bp（IS1245基因片段）和140 bp（dnaJ基因片段）三条目的条带,基因组DNA的最小检测量为0.38 ng/μL,目的条带在退火温度50 ℃～62 ℃之间均能得到有效扩增。对23株禽分枝杆菌菌株检测,并设立牛分枝杆菌作为阴性对照,最终将禽分枝杆菌菌株分为三大类：禽亚种/森林土壤亚种、副结核亚种、人猪亚种,与国家兽医微生物菌种保藏中心的分类结果相比不仅一致且更加详尽而有临床意义。因此,基于分子生物学方法建立的多重PCR方法可以对禽分枝杆菌亚型进行快速鉴定并对禽结核病的诊断提供参考。     

张家口地区奶牛临床型乳腺炎病原菌的分离鉴定

采集具有临床型乳腺炎奶牛的奶样,经细菌的分离培养、纯培养和生化试验,以确定奶牛临床型乳腺炎的致病菌种类。结果发现患临床型乳腺炎奶牛的致病菌和占分离菌株的百分率为:腐生葡萄球菌19.7%、金黄色葡萄球菌16.5%、兽疫链球菌17.3%、停乳链球菌9.4%、乳房链球菌3.9%、无乳链球菌1.6%、产气肠杆菌17.3%、聚团肠杆菌4.7%、奇异变形杆菌3.0%、大肠杆菌3.0%、蜡样芽胞杆菌3.0%,样品中单纯感染与混合感染的百分率分别为66.0%和27.8%。     

犊牛腹泻主要病原菌多重PCR方法的建立

产毒性大肠埃希菌、A/E大肠埃希菌和沙门菌是造成犊牛腹泻的主要病原菌。选取产毒性大肠埃希菌的st和lt基因、A/E大肠埃希菌的eae基因和沙门菌的invA基因作为扩增靶基因序列,通过优化反应条件建立了四重PCR检测体系。对PCR产物回收、测序,验证PCR。通过特异性试验和敏感性试验证明该PCR体系特异性强、敏感性高,可有效地检测犊牛腹泻病原菌。使用该四重PCR检测22份临床样品,发现其中9份携带相关基因,并分离得到了相关致病菌。     

菌落多重PCR鉴定不同荚膜血清型的多杀性巴氏杆菌

参照文献报道的多杀性巴氏杆菌KMT1基因和荚膜生物合成位点hyaD-hyaC、bcbD、dcbF、ecbJf、cbD基因的序列合成了6对特异性引物,建立了多杀性巴氏杆菌种和型的菌落多重PCR方法。结果表明,本所保藏的A、B、D、E、F各型多杀性巴氏杆菌均扩增出了相应的预期片段,PCR结果与Biolog鉴定结果和Carter氏间接血球凝集试验结果相一致;而支气管败血波氏杆菌、胸膜肺炎放线杆菌、大肠埃希菌、猪链球菌和粪肠球菌的扩增均为阴性。     

转基因牛多重PCR检测方法的建立

为建立一种快速检测转基因牛的多重PCR方法,针对牛线粒体16 S rRNA基因(BOS mtD-NA16 S rRNA,BOS)、转基因动物常用标记基因新霉素磷酸转移酶基因(NPT Ⅱ)、人乳铁蛋白编码基因(human laetoferrin gene,hLF)、人-α-乳清蛋白编码基因(human α-lactalb...     

利用菌落多重PCR对传染性胸膜肺炎放线杆菌进行血清分型

参照文献报道的传染性胸膜肺炎放线杆菌的特异基因合成5对特异引物,建立传染性胸膜肺炎放线杆菌血清型分型的菌落多重PCR方法,结果为10株传染性胸膜肺炎放线杆菌血清型参考菌株均扩增出了相应的预期片段,而支气管败血波氏杆菌、多杀性巴氏杆菌、大肠埃希菌的扩增均为阴性。利用此多重PCR方法对41株传染性胸膜肺炎放线杆菌分离菌株进行血清型分型,结果所有菌株均扩增出了相应的特异片段,其中6株为1型,5株为7型,1株为5型,29株为9型。     

应用多重PCR同时检测牛、羊源性成分

我们选择了3对引物A,B,C.A可扩增大多数脊椎动物(哺乳类、鸟类、爬行类、两栖类和鱼类)细胞色素b基因上一个371 bp的区段,B可扩增位于牛mtDNAD-loop区段内的一个274 bp的区段,C可扩增羊mtDNA基因上一个199bp的区段.由于3对引物扩增的产物分别相差约100 bp左右,可通过琼脂糖凝胶电泳分离来并观察结果,建立了基于内对照的同时检测牛、羊源性成分的三重PCR方法.