人结核杆菌热休克蛋白70和卡介苗α抗原基因启动子序列测定

用T7DNA聚合酶测序系统测定了人结核杆菌热休克蛋白70（hsp70）基因的启动子序列和卡介苗（BCG）α基因的启动子和信号肽序列，并比较了它们与大肠杆菌（E.coli）和其它分枝杆菌启动子之间的异同。结果所测的hsp70启动子序列为人结核杆菌hsp70编码基因起始密码（ATG）上游150个脱氧核苷酸，其中在ATG上游—12～—8核苷酸处有核糖体结合位点（SD序列）GGAGG，在RNA聚合酶的结合位点（RNApolymerase－bindingsite，RBS）区含有与E．coli相同的三核苷酸高度保守序列TTG。这些序列与E．coli5＇端调控区同源。在hsp70基因调控序列-10区两侧有反向重复序列TGCAGT，构成5＇端的茎环结构。其它分枝杆菌hsp基因启动子调控区均有类似的结构。对BCGα基因启动子和信号肽序列的测定，发现其启动子序列与hsp基因的SD、-10和-35序列有一定的区别，其序列分别为AAAGG、TATGTT、TCGACA。在ATG后的120个核苷酸序列所编码肽链具有信号肽的特征，在碱性氨基酸后紧跟一段疏水区，含有能被信号肽酶识别的Ala－X－Ala结构。     

人结核杆菌热休克蛋白65重组卡介苗疫苗的构建、表达及鉴定

目的　构建人结核杆菌热休克蛋白 6 5 (HSP6 5 )重组卡介苗 (BCG)疫苗。方法　用PCR技术从BCG基因组中扩增出抗原 85B (Ag85B)的信号肽DNA序列 ,从 pCMV MTHSP 6 5质粒中扩增出HSP6 5全长基因。利用DNA重组技术将以上两个片段插入质粒 pBCG 2 10 0的人结核杆菌HSP70启动子下游 ,构建一个分泌型的原核穿梭表达质粒pBCG SP HSP6 5。利用电穿孔的方法将该质粒转入BCG中 ,经热诱导后 ,用SDS PAG电泳来观察其表达水平。利用Westernblot来检验HSP6 5的生物学活性。结果　酶切鉴定、PCR和测序分析结果表明 ,所克隆的信号肽DNA片段和热休克蛋白 6 5DNA片段与报道结果完全一致 ,重组体的连接方向正确 ,阅读框与预期完全一致。热诱导后 ,重组BCG表达的 6 5kD (1kD =0 992 1ku)蛋白占菌体总蛋白的 35 6 7% ,占裂解物上清总蛋白的 74 0 9% ,表明重组的HSP6 5基因能在BCG中高效表达 ,表达的蛋白大部分以可溶状态存在。通过Westernblot证实分泌的该蛋白能与结核杆菌HSP6 5的抗体特异性结合。结论　成功构建分泌型原核穿梭表达质粒pBCG SP HSP6 5 ,重组的HSP6 5基因能在BCG中高效表达 ,表达的HSP6 5具有生物学活性 ,重组BCG疫苗构建成功。     

卡介苗热休克蛋白16.3基因的克隆与原核表达

目的 克隆卡介苗(BCG)的热休克蛋白16.3基因(hsp16.3),并在大肠杆菌中表达.方法 利用PCR技术从BCG中扩增hsp16.3基因,并将其克隆到质粒pProEX HTb中,进行测序.将得到的重组表达质粒pProEX HTb-hsp16.3在大肠杆菌BL21中进行表达.结果 成功地克隆了BCG hsp16.3基因.经DNA测序证实,与Gen Bank公布的序列一致.含pProEX HTb- hsp16.3重组质粒的大肠杆菌BL21经诱导后,能够表达相对分子质量约为16KDa的融合蛋白.结论 获得了BCG hsp16.3基因,成功构建原核表达质粒pProEX HTb- hsp16.3,并在大肠杆菌得到高效表达.     

结核杆菌热休克蛋白70与绿色荧光蛋白基因真核共表达质粒的构建

目的 利用pIRES-EGFP载体构建含有人巨细胞病毒(cytomegaloviru,CMV)启动子调控表达的结核杆菌热休克蛋白70(mtHSP70)与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因双顺反子真核表达载体pCMV-hsp70-IRES-EGFP.方法 根据mtHSP70基因全长cDNA的特异引物PCR扩增获得mtHSP70基因序列.将PCR产物进行T载体克隆获得重组质粒PMD-18T-mtHSP70,测序分析选定序列正确的克隆提取质粒,用限制性内切酶Xho I和EcoR I酶切pMD 18 T-TK和pCMV-IRES-EGFP质粒.将mtHSP70基因定向亚克隆至pCMV-IRES-EGFP载体,酶切鉴定,构建获得含mtHSP70和EGFP基因的重组质粒.Lipofectamine介导下转染B16细胞,并分别在荧光显微镜下观察EGFP的表达和以Western blot检测mtHSP70蛋白表达情况. 结果 酶切见特异酶切图谱,该载体在瞬时表达时获得mtHSP70/EGFP的良好表达.结论 含mtHSP70和EGFP基因双顺反子真核表达载体pCMV-mtHSP70-IRES-EGFP构建成功,为研究基于以GFP为报告基因的mtHSP70的肿瘤DNA疫苗对肿瘤的治疗作用及机制奠定了实验基础.     

卡介苗热休克蛋白70对肿瘤细胞裂解物免疫原性的影响

的：观察卡介苗热休克蛋白70（BCGHSP70）对肿瘤细胞裂解物（TCL）免疫原性的影响,为TCL相关肿瘤疫苗的制备提供依据。方法：应用冻融法制备B16黑色素瘤细胞裂解物B16TCL,将BCGHSP70与B16TCL在体外混合制备BCGHSP70-B16TCL。将C57BL/6小鼠随机分为BCGHSP70-B16TCL组、PBS组、BCGHSP70组和B16TCL组,分别于第1和14天皮下免疫BCGHSP70-B16TCL、PBS、BCGHSP70和B16TCL。于末次免疫后第7天处死小鼠,MTT法观察不同免疫组小鼠脾淋巴细胞在B16TCL体外刺激后的增殖情况,计算刺激指数（SI）。结果：应用冻融法能够使B16细胞完全裂解,所制备的B16TCL中含有丰富的蛋白成分。与PBS组、BCGHSP70组和B16TCL组比较,BCGHSP70-B16TCL组免疫小鼠脾脏明显增大;BCGHSP70-B16TCL免疫组SI高于PBS免疫组（P=0.00）、 B16TCL免疫组（P=0.01）和BCGHSP70免疫组（P=0.00）。结论：BCGHSP70　能够增强B16TCL的免疫原性,提示BCGHSP70可能作为有效的免疫佐剂用于TCL相关肿瘤疫苗的研究。     

热休克蛋白70和热休克蛋白27在宫颈鳞癌中的表达及其意义

目的探讨热休克蛋白70(HSP70)和热休克蛋白27(HSP27)在宫颈鳞癌中的表达及其相关性。方法应用免疫组织化学方法检测HSP70、HSP27在60例宫颈鳞癌,18例宫颈上皮内瘤变(C IN),7例正常宫颈组织中的表达。结果宫颈鳞癌组织中HSP70,HSP27阳性表达率与正常宫颈组织相比差异有统计学意义(P<0.05);宫颈鳞癌中HSP70的阳性表达与病理分级、临床分期、淋巴结转移密切相关(P<0.05),HSP27的阳性表达与病理分级密切相关(P<0.05);HSP70与HSP27在宫颈鳞癌中的表达无相关关系(P>0.05)。结论HSP70、HSP27均在宫颈鳞癌发生和发展中起重要作用,HSP70可能作为判断宫颈癌预后的重要指标。     

BCG 65KD热休克蛋白的纯化

目的：研究卡介苗（ＢＣＧ）６５ＫＤ热休克蛋白的提纯方法。方法：ＢＣＧ经３７℃恒温振荡培养两周，４２℃热休克处理２ｈ，培养液经离心、抽滤、盐析沉淀、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分离、电泳洗脱等步骤纯化。结果：提纯产物经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析，其电泳区带在６５ＫＤ位置，经抑制试验表明具有较高抗原活性。结论：流程方法简单、实用，有助于对ＩＤＤＭ的诊断及其深入研究。     

人热休克蛋白70基因在大肠杆菌中的表达及纯化

目的:构建人热休克蛋白70(HSP70)的原核表达载体,诱导其表达并纯化.方法:应用PCR技术从人胆管癌组织中扩增出HSP 70基因片段,经T-A克隆连接到末端经平滑处理后的pMD18-T Simple质粒并测序.利用双酶切技术构建重组原核表达载体pGEX-4T-1-HSP 70,并转化大肠杆菌JM 109,经IPTG诱导后表达得到HSP70融合蛋白.应用Glutathione-Sepharose4B亲和层析柱提纯融合蛋白,用生物素化凝血酶分离并纯化目的蛋白,最后行Wsetern blot鉴定.结果:PCR扩增结果与预计目的基因大小一致;序列分析与GeneBank中收录完全一致;重组表达载体pGEX-4T-1-HSP 70构建成功;Western blot结果显示目的蛋白可以与兔抗人的HSP70单克隆抗体特异性结合.结论:HSP 70编码序列已经成功克隆至原核表达载体pGEX-4T-1,并在大肠杆菌JM 109中获得表达.     

热休克蛋白70和缺血性脑损伤

热休克蛋白 (ｈｅａｔｓｈｏｃｋｐｒｏｔｅｉｎ ,Ｈｓｐ)是一类在进化上高度保守 ,广泛存在于原核和真核细胞内 ,因受热和其他应激因素(如缺血、缺氧、重金属离子、病毒感染、过氧化氢、氧自由基、氨基酸类似物、理化有害刺激等 )作用后 ,发生热休克反应而产生的一类新的蛋白质。目前证实约有二百余种因素能刺激热休克蛋白的产生 ,故又称应激蛋白。Ｈｓｐ70家族 ,包括ｇｒｐ75 ,78,80 ,ｂｉｐ ,Ｈｓｐ 6 8,72 ,73,Ｈｓｃ70等。它是Ｈｓｐ家族中结构组保守和主要的一类 ,在大多数生物细胞受应激后生成最为显著[1 ] 。Ｈｓｐ的主要生物功能是…     

热休克蛋白70的研究

本系统地介绍了热休克蛋白的理论基础、相关研究和进展，为进行有关研究提供线索。     

人肝癌组织热休克蛋白70的表达

为探讨人肝癌组织热休克蛋白 70 (HSP70 )的表达及意义 ,采用SABC法检测人肝癌组织HSP70的表达 ,图像分析HSP70在癌组织中的表达特点。结果显示 :2 5例肝癌组织中均存在HSP70的表达 ,不同癌组织存在胞质、胞膜和胞核表达强度及部位的差异。证实人肝癌组织存在HSP70的表达异质性 ,呈现了胞质、胞膜和胞核的表达差异 ,HSP70在人肝癌组织的表达特点为今后肿瘤抗原肽瘤苗的提取和实验研究作了铺垫。     

热休克蛋白70与脑缺血

热休克(heatshock,HS)现象是Ritossa(1962)在观察果蝇幼虫唾液腺细胞染色体在过热环境中发生形态变化时首先发现的。当环境温度高于正常生理体温(4～6)℃时,染色体上会出现特殊的膨突。Tissiers(1974)等发现这一现象与细胞中一类特殊蛋白质合成有关,他们称这种蛋白质为热休克蛋白(heatshockprotein,HSP),这种现象广泛存在于原核生物和真核生物中,在细菌到哺乳动物体内均可见HSP表达[1]。现已证明除热外,其它如缺血缺氧、重金属离子、乙醇、H2O2 、氨基酸类似物、病毒感染等许多应激因素均可造成热休克反应,诱导细胞合成HSP。HSPs的主要生物功能是提高细胞对应激因素的耐受,维持细胞蛋白自稳,使细胞维持正常生理功能。根据HSP的同源性和分子量大小,Morimoto将其大致分为4个家族:HSP90家族(83-90kD)、HSP70家族(66 -78kD)、HSP60家族和小HSP家族。其中HSP70与心脑缺血、癫痫、多发性硬化、感染、肿瘤等关系密切,被认为其主要作用是促进新生多肽键的正确折叠,维持解聚蛋白恰当构型,分子重排以及新生多肽链在细胞内、跨膜转运有重要的辅助作用,...     

宫颈癌放疗前后热休克蛋白70、90α的表达

目的 探讨热休胸蛋白70、90α在宫颈癌放疗前后的表达及意义。方法 采用免疫组织化学法分别检测50例宫颈癌患者放疗前后热休克蛋白70、90α的表达。结果 放疗后热休克蛋白70、的表达与放疗前相比明显降低,热休克蛋白90α与放疗前相比无显著差异;放疗前热休克蛋白70、的表达与病理分级正相关,而放疗后其表达与病理分级负相关。结论 热休克蛋白70、的表达水平测定可以做为宫颈癌细胞的增殖、分化及放射敏感性的一个重要指标。     

热休克蛋白70与脑缺血

随着分子生物学研究手段的应用 ,人们已逐渐认识到在脑中存在着完善的适应机制 ,通过迅速诱导基因表达和蛋白质合成来阻止导致脑细胞死亡的病理生理变化。众多的研究表明脑缺血可诱导许多基因的表达 ,其中大多数参与脑的自我修复 [1 ]。热休克蛋白 (HSP)是机体在遭受各种应激刺激后诱导产生的一种应激蛋白 ,对细胞具有保护作用 ,与缺血型脑损伤等多种神经系统疾患关系密切。其中热休克蛋白 70(heat shock protein70 ,HSP70 )作为脑缺血所诱导的一种神经元保护性物质可阻止蛋白质在压力下发生聚集或错误折叠而日益受到医学界的广泛关注 ,…     

65 kD热休克蛋白抗原的制备

目的：在分析经典制备工艺及培养基配方的基础上，设计出简便，有效的改良法制备65kD热休克蛋白。方法：将BCG（卡介苗）在罗氏培养基上培养，然后转至苏通氏培养基内培养，42℃水浴休克55min，过滤除 ，浓缩测蛋白质量浓度。结果 经浓缩后的滤液用SDS－PAGE电泳分析显示为一条蛋白带，相对分子质量为65kD。结论：表明方法可行。     

热休克蛋白70心肌保护研究进展

热休克蛋白(heat shock protein,HSP)是所有原核细胞和真核细胞在高温或应激情况下由热休克基因编码产生的一组序列高度保守的细胞蛋白,又称应激蛋白。参与细胞的损伤与修复。因R itossa[1]首先从果蝇在热应激环境中诱导合成而命名,随后的研究发现除高温外,缺血、低氧、重金属盐及大多数病理状态下都能诱导细胞产生HSP。根据分子量大小和同源程度可分为HSP110、HSP90、HSP70、HSP60、小分子量HSP等几个家族,每个家族又有多个成员。HSP70是HSP中最保守、最主要、含量最丰富的一类。近年来国内外许多学者一直在探索HSP70的特性及…     

热休克蛋白70与心肌保护

热休克蛋白（heat shock proteins，HSPs），也称应激蛋白，是生物体或离体培养细胞在应激状态下产生的一类内源性保护蛋白，因Ritossall^[1]首先从果蝇在热应激环境中诱导合成而命名。     

宫颈癌放疗前后热休克蛋白70、90α的表达

目的　探讨热休克蛋白 70、90α在宫颈癌放疗前后的表达及意义。方法　采用免疫组织化学法分别检测 5 0例宫颈癌患者放疗前后热休克蛋白 70、90α的表达。结果　放疗后热休克蛋白 70、的表达与放疗前相比明显降低 ,热休克蛋白 90α与放疗前相比无显著差异 ;放疗前热休克蛋白 70、的表达与病理分级正相关 ,而放疗后其表达与病理分级负相关。结论　热休克蛋白 70、的表达水平测定可以做为宫颈癌细胞的增殖、分化及放射敏感性的一个重要指标     

热休克蛋白70基因 rs1008438多态性与高原肺水肿的相关性

目的：探讨热休克蛋白（HSP）70基因启动子区 rs1008438位点单核苷酸多态性（SNP）与高原肺水肿（HAPE）之间的关系。方法采用PCR‐DNA直接测序法检测100例HAPE组、200例健康对照组个体基因组rs1008438位点的基因分布,分析不同基因型与HAPE的关系;运用ELISA法检测不同基因型HAPE组和健康对照组白细胞细胞质和细胞核HSP70蛋白含量变化;应用蛋白质芯片技术和 EVIDENCE180全自动芯片仪分析 TNF‐α、IL‐1β、IL‐6表达水平。结果 HAPE组,健康对照组rs1008438的TT、GT、GG的基因型频率分别是76．0％、20．0％、4．0％,93．0％、6．5％、0．5％。统计处理显示,HAPE组TT基因型频率明显低于健康对照组（P＜0．05）;GT、GG基因型患 HAPE的危险性是 TT基因型的4．195倍,G等位基因相对 T等位基因也能明显增加 HAPE的发病风险（OR＝4．178）;ELISA检测结果显示,不同基因型 HAPE组 HSP70含量均高于健康对照组,且HSP70细胞核／细胞质比值TT基因型高于GT／GG基因型;蛋白质芯片检测表明,HAPE组血清中的TNF‐α、IL‐1β、IL‐6表达水平均明显高于健康对照组。结论 rs1008438位点多态性与 HAPE易感性相关,这种相关性可能是由于突变型在基因转录水平通过影响启动子活性而增强HSP70表达,从而导致HAPE的发生。