天祝白牦牛Lfcin基因克隆及生物信息学分析

利用PCR技术从天祝白牦牛基因组DNA中获得乳铁蛋白素(Lactoferricin,Lfcin)基因序列,将Lfcin基因连接于pGEM-T easy载体进行测序后,与奶牛的Lfcin基因序列进行比对;对牦牛、奶牛、人、小鼠等物种的Lfcin蛋白序列进行比对和进化树分析.结果表明:克隆获得了含天祝白牦牛乳铁蛋白第二外显子的DNA序列,共778 bp,其中Lfcin基因编码区长75 bp,编码25个氨基酸;序列分析显示,克隆获得的牦牛DNA序列与奶牛该序列存在9个碱基的变异,其中Lfcin基因编码区内有1个变异,为同义突变;牦牛和奶牛的Lfcin蛋白质序列完全相同,各物种Lfcin蛋白具有较高的同源性.     

天祝白牦牛IGF-1基因克隆、生物信息学及差异表达分析

旨在获得天祝白牦牛 IGF-1基因序列,分析其分子结构特征及在牦牛毛囊发育周期中的表达规律,为解析白牦牛毛囊发育及被毛生长提供理论依据。以天祝白牦牛体侧皮肤为试验材料,通过PCR扩增及测序技术克隆 IGF-1基因CDS区序列,并与黄牛序列比对,进行生物信息学分析;采用实时荧光定量PCR(qPCR)技术检测天祝白牦牛毛囊发育不同时期 IGF-1基因的mRNA表达水平。结果表明,天祝白牦牛 IGF-1基因的CDS区长465 bp,编码154个氨基酸; IGF-1基因编码蛋白的分子质量为17 065. 81 ku,理论等电点为9.36;蛋白质二级结构以无规卷曲(57.79%)和α-螺旋(27.27%)为主,序列分析表明,天祝白牦牛IGF-1蛋白为不稳定亲水蛋白;qPCR检测结果表明, IGF-1基因在牦牛毛囊发育的生长期、退行期和休止期均有表达,生长期和退行期表达量显著高于休止期。     

牦牛生长激素基因分子特性分析

设计特异性引物,利用RT-PCR方法从牦牛脑垂体中扩增出生长激素基因(YGH)编码区全序列,并进行分子特性分析.结果表明:牦牛生长激素基因编码区全长654 bp,包含一个完整的阅读框,编码217个氨基酸.采用生物信息学方法对分子特性进行分析表明:动物生长激素基因在进化上非常保守,牦牛生长激素基因氨基酸序列与黄牛、山羊、绵羊、马、猪、猫和犬的同源性分别为100%、99.1%、98.6%、88.9%8、8.5%、88.9%和89.4%.牦牛生长激素蛋白有2个明显的疏水区域,存在2个强跨膜区和信号肽,是一种分泌型蛋白质,二级结构主要以α-螺旋和不规则卷曲为主,三级结构包含第28-215位氨基酸残基;牦牛生长激素蛋白有较高的抗原指数和抗原表位,这与YGH编码蛋白具有良好的抗原性相一致.     

"大通牦牛"Lfcin基因克隆及生物信息学分析

[目的]克隆“大通牦牛”Lfcin基因,为将该基因应用于饲料工业和养殖业提供依据。[方法]利用PCR技术从“大通牦牛”基因组DNA中获得乳铁蛋白素（Lactoferricin,Lfcin）基因序列;将Lfcin基因连接于pGEM-T easy载体,送至生物公司测序;将“大通牦牛”与奶牛的Lfcin基因序列进行比对;同时,对牦牛、奶牛、人、小鼠等物种的Lfcin蛋白进行序列分析和进化树分析。[结果]克隆获得了含“大通牦牛”LF（Lactoferrin）第二外显子的DNA序列,共778bp,其中Lfcin基因编码区长75bp,编码25个氨基酸;序列分析显示,克隆获得的牦牛DNA序列与奶牛该序列存在11个碱基的变异;牦牛和奶牛的Lfcin蛋白质序列完全相同,各物种Lfcin蛋白具有较高的同源性;进化树分析表明Lfcin进化树符合物种进化规律。[结论]该研究为Lfcin基因在原核或真核细胞中的表达研究以及进一步研究Lfcin蛋白的生活活性奠定了基础。     

天祝白牦牛饲草致病菌分析

以天祝白牦牛的饲草为对象,定量研究了天祝县石门、炭山岭、松山、西大滩、抓喜秀龙 5 个地点的白牦牛饲草(夏秋牧草、冬春牧草)中志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、病原性大肠艾希氏菌、沙门氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌、空肠弯曲菌 7 种消化道致病菌的污染情况,并分析了造成白牦牛饲草料污染的 7 种致病菌。夏秋牧草中各种消化道致病菌检出率顺序为:志贺氏菌(41.24 %)>金黄色葡萄球菌(12.19 %)>沙门氏菌(7.32 %)>病原性大肠艾希氏菌(4.88 %),而小肠结肠炎耶尔森氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌、空肠弯曲菌未检出;冬春牧草中致病菌的检出率顺序为:志贺氏菌(10.25 %)>金黄色葡萄球菌(7.69 %),而病原性大肠艾希氏菌、沙门氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌、空肠弯曲菌均未检出。5 个采样点中,夏秋牧草中 7种消化道致病菌总体污染程度为石门(100.00%)>炭山岭(62.5%)>松山(60.00%)>西大滩(14.28%)>抓喜秀龙(0);冬春牧草总体污染程度为炭山岭(33.33 %)>石门(28.57 %)、松山( 25.00 %)>西大滩(0)、抓喜秀龙(0)。致病菌污染夏秋季高于冬春季。天祝白牦牛饲草已经存在轻度致病菌污染.     

珍贵的地方牦牛良种"天祝白牦牛"

“天祝白牦牛”产于甘肃省天祝藏族自治县,以该县的西大滩、抓喜秀龙滩（汉语称永丰滩）和阿琨沿沟草原为主要产地。     

牦牛DRA基因克隆测序及生物信息学分析

为全面解析牦牛MHCⅡ类基因结构与功能,采用分子克隆测序技术对大通牦牛DRA基因编码区进行等位基因频率估算并进行生物信息学分析。结果显示：大通牦牛DRA基因编码区含有762 bp的开放阅读框,共编码253个氨基酸;共有3个SNPs(g.2376C>T、g.2851C>G、g.3016C>A),其中第2、3外显子分别存在1个C→T的同义突变和C→A的错义突变(L→M),这两个突变均降低了大通牦牛DRA基因mRNA二级结构的稳定性;g.3016C>A突变前后编码蛋白质的分子量、原子总数、脂肪系数、不稳定系数、总平均亲水性方面存在差异;生物信息学的方法分析显示,BoLA-DRA基因是MHC基因家族中高度保守的基因。该研究结果可以为大通牦牛DRA基因结构与功能的研究奠定基础。     

类乌齐牦牛乳酸脱氢酶基因克隆及组织表达

旨在克隆西藏类乌齐牦牛乳酸脱氢酶(LDHB)基因并检测其组织表达情况,为给进一步研究LDHB在高海拔地区的极端低氧适应性及能量代谢中的调控作用提供依据。结果表明,类乌齐牦牛LDHB基因CDS区全长1 004bp,编码334个氨基酸,存在2处碱基突变,导致密码子分别由AAG→GAG(赖氨酸→谷氨酸)、ATC→AGC(异亮氨酸→丝氨酸);编码蛋白分子质量为36.72ku,为疏水稳定性蛋白,功能预测在糖酵解及氧化还原等过程中发挥主要功能;系统进化树表明,西藏类乌齐牦牛与九龙牦牛、黄牛的氨基酸序列相似性最高,亲缘关系最近,其次为山羊、宽吻海豚、猪、马、羊驼和野生双峰骆驼,与鸡、乌鸦、非洲爪蟾和鲤鱼较远;定量分析显示,LDHB基因在牦牛肺脏中的表达水平显著高于心脏和肝脏,推测该基因与牦牛抗缺氧性状相关。     

天祝白牦牛KA P1.1 基因的克隆及生物信息学分析

以牦牛的角蛋白关联蛋白1.1（KAP1.1）基因为研究对象,根据GenBank收录的黄牛KAP1.1基因的mRNA序列（登录号:NM₀01105369.1）设计特异性引物,通过反转录PCR、PCR以及克隆方法首次获得牦牛的KAP1.1完整CDS区,将所得序列提交到NCBI,登录号为KJ095199,并对其进行生物信息学分析。结果表明,牦牛KAP1.1基因的CDS区全长为501bp,共编码166个氨基酸;编码的蛋白质属于亲水性蛋白质。二级结构含有α螺旋区、延伸链、β转角和无规卷曲4种。氨基酸序列与黄牛的同源性最高,具有High sulphur keratin-associated protein家族蛋白的完整结构域。     

“大通＂牦牛Lfcin基因克隆及生物信息学分析

乳铁蛋白素（Lactoferricin,Lfcin）是从乳铁蛋白（LF）上被胃蛋白酶水解下来的25个氨基酸残基的小肽,位于乳铁蛋白第二外显子,是乳铁蛋白的抗菌活性中心,其抗菌活性是LF的几百倍。Lfcin具有广谱抗菌活性,对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均有效,同时具有抗真菌、抗病毒、抑制肿瘤细胞生长、参与免疫调节等多种生物学功能和维持动物肠道菌群正常生态稳定的功能,从而起到提高动物生产性能的作用。     

高原牦牛SRY基因的克隆与原核表达

为从分子水平了解牦牛的性别形成机制,对高原牦牛SRY(Sex-determining region on the Y chromosome,SRY)基因的编码区进行了克隆表达。以雄性高原牦牛血液为材料,从基因组DNA中扩增SRY基因编码区(单外显子)序列,将其克隆至pGEM-Teasy载体并测序;将牦牛SRY基因编码区连接至pET-28a(+)载体,构建表达载体pET-28a/SRY;把表达载体pET-28a/SRY转入大肠杆菌E.coliBL21(DE3)中,在合适的条件下诱导表达;对表达产物进行Western-blot检测。结果表明:牦牛SRY基因(GenBank:EU547257)编码区长687 bp,编码229个氨基酸;成功构建了表达载体pET-28a/SRY,并且SRY蛋白得到了大量表达;Western-blot进一步验证了其表达成功。     

天祝白牦牛的毛绒生产性能

[目的]分析天祝白牦牛的毛绒生产性能,为天祝白牦牛的遗传育种和毛绒产品开发提供条件。[方法]检测1～6岁不同性别的天祝白牦牛的毛绒产量和产绒率,计算其产绒量,并对这些毛绒生产性能评价指标进行统计分析。[结果]天祝白牦牛1-2岁时毛绒产量低,被毛含绒率和产绒量较高;3～6岁时毛绒产量、被毛含绒率、产绒量均较高;7岁以后毛绒产量、被毛含绒率和产绒量均明显降低。公牦牛的毛绒产量显著（P〈0．05）或极显著（P〈0．01）高于母牦牛;5—7岁母牦牛的被毛含绒率极显著（P〈0．01）高于同龄公牦牛。[结论]1—2岁的天祝白牦牛绒用性能最好;3—6岁是生产毛绒的主要阶段;7岁后的天祝白牦牛不适于用于毛绒生产。     

天祝白牦牛超排过程中卵泡闭锁的初步研究

[目的]全面监测天祝母白牦牛超排过程中卵巢的变化情况。[方法]对12头健康成年天祝母白牦牛采用CIDR+FSH+PG的超数排卵处理,并运用超声探测技术对超排过程中卵巢的变化情况做了全程监测。[结果]在处理的12头牛中有5头监测到明显的卵泡闭锁现象。在超排处理前期,这5头的卵巢直径逐渐增大,到第10天达到最大值,平均(3.39±0.65)cm,之后又开始逐渐缩小;卵巢上最大卵泡的直径也在第10天达到最大值,平均13.6±2.6 mm;优势卵泡从第8天开始大量出现,到第10天达到最多,平均每个卵巢有6.5±2.3个;此后这些优势卵泡的直径逐渐缩小,在B超图上未看到黄体影像,说明这类卵泡没有正常排卵,而是最终走向了闭锁。[结论]该研究为评价及优化超排处理方案提供准确可靠的依据。     

黄牛、牦牛和犏牛b-Sycp2基因的克隆 与睾丸组织mRNA的表达水平

【目的】克隆黄牛、牦牛和犏牛Sycp2基因序列,了解牛Sycp2基因序列特征和组织表达特征,分析睾丸组织中Sycp2基因的表达水平。【方法】采用电子克隆和克隆测序技术获得黄牛、牦牛和犏牛Sycp2基因序列,利用生物信息学方法分析其序列特征;采用RT-PCR分析牛Sycp2基因的组织表达特征;采用real-time PCR技术检测黄牛、牦牛和犏牛睾丸组织Sycp2基因的表达水平。【结果】①黄牛、牦牛和犏牛Sycp2基因编码区序列全长均为4 365 bp,命名为b-Sycp2,编码蛋白含有1 454个氨基酸残基,并包含卷曲螺旋结构域等典型结构域;②b-Sycp2基因在睾丸组织中特异表达,黄牛和牦牛睾丸组织中b-Sycp2基因的表达水平显著高于犏牛（P＜0.05）。【结论】成功克隆了b-Sycp2基因,b-Sycp2基因为睾丸组织的特异表达基因,且黄牛和牦牛睾丸组织b-Sycp2基因表达水平显著高于犏牛。     

天祝白牦牛牛奶重金属污染分析

在天祝县达隆、东大滩、石门、炭山岭4个试验区采样,分析了天祝白牦牛鲜奶及消毒奶重金属污染程度.结果表明:鲜奶综合污染程度从大到小的顺序为炭山岭(1.270)、东大滩(0.840)、达隆(0.740)、石门(0.730);消毒奶综合污染程度从大到小的顺序为炭山岭(1.930)、石门(1.890)、达隆(1.880)、东大滩(0.980).消毒奶重金属相关分析表明,Pb-Cd存在显著相关(R＜0.5),Pb-As、As-Cd存在极显著相关(R＞0.5).     

甘肃天祝白牦牛乳中超氧化物歧化酶活性分析

[目的]分析天祝白牦牛乳中超氧化物歧化酶(SOD)活性。[方法]对采自天祝白牦牛3个牧区共9头份牦牛乳SOD活性进行分析。[结果]天祝白牦牛乳中SOD活性约为202 U/mL。3个牧区的天祝白牦牛乳中SOD活性有所不同,但是差异不显著;SOD活性随着胎次的变化无显著差异,即胎次对牦牛乳SOD活性影响不大。[结论]研究可为白牦牛乳的进一步开发利用奠定理论基础。     

牦牛铜锌超氧化物歧化酶原核表达载体的构建及其表达研究

【目的】为解决医用超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)来源的限制,利用基因工程方法构建牦牛Cu,Zn-SOD原核表达系统,为重组牦牛Cu,Zn-SOD作为注射用药奠定基础。【方法】RT-PCR扩增牦牛Cu,Zn-SOD编码基因,构建Cu,Zn-SOD/pET22b(+)重组表达载体,并转化到E.coli BL21(DE3)宿主菌,经IPTG进行诱导表达。表达产物经SDS-PAGE、活性染色及邻苯三酚法进行检测,采用BradFord方法测定融合蛋白浓度。【结果】本试验成功获得了牦牛Cu,Zn-SOD cDNA,长456bp,编码152个氨基酸。与普通牛SOD编码基因序列cDNA一致率为99.6%,氨基酸序列一致率为98.7%,表达产物分子质量约为32kD。酶粗提取液比活约为35U·mg-1。重组蛋白浓度0.2772(mg·mL-1)。【结论】本研究成功构建了牦牛Cu,Zn-SOD/pET22b(+)原核表达载体,表达量较高、稳定性强,重组表达产物具有较高生物学活性。