光棘球海胆性腺氨基酸组成的研究

于2006年5、6、8月测定了光棘球海胆Strongylocentrotus nudus雌、雄个体性腺中氨基酸含量及组成。结果表明:光棘球海胆氨基酸含量为30.75%⁴8.52%(质量分数,下同),其中鲜味氨基酸含量为15.33%48.52%(质量分数,下同),其中鲜味氨基酸含量为15.33%²1.84%,必需氨基酸含量占氨基酸总量的42.67%21.84%,必需氨基酸含量占氨基酸总量的42.67%⁵2.50%,鲜味氨基酸含量占总氨基酸含量的43%以上。光棘球海胆中甘氨酸含量最高(3.76%52.50%,鲜味氨基酸含量占总氨基酸含量的43%以上。光棘球海胆中甘氨酸含量最高(3.76%⁵.02%),谷氨酸含量(2.99%5.02%),谷氨酸含量(2.99%⁴.79%)次之;雌、雄个体以及排放精、卵时其氨基酸组成变化较大;过熟及迟熟的海胆无论是氨基酸总量,还是必需氨基酸、鲜味氨基酸含量都低于早期成熟海胆;雄性海胆性腺鲜味氨基酸含量高于雌性,因此雄性更美味。研究表明,生产中采集海胆最好在海胆早期成熟阶段,在海胆成熟后期自然排放之前采收完毕。     

大连近海光棘球海胆生殖周期的初步研究

１９９０年对大连近海光棘球海胆生殖腺指数进行周年调查,并对其生殖腺发育进行了组织学观察。结果表明：该海区光棘球海胆的自然系列期为７月末至９月下旬,盛期为８月中下旬至９月上旬,这一时期的水温为２２～２３℃,处于水温自然下降季节。雄性成熟略早于雌性。全年生殖腺肥满期出现在６～８月,消瘦期为１０月至年４月,因而海胆的采捕期以６～８月初为宜。     

中间球海胆、光棘球海胆自繁和杂交后代幼体发育及对高温的反应

对中间球海胆Strongylocentrotus intermedius ( Si)和光棘球海胆S. nudus ( Sn)进行完全双列杂交,通过对自繁后代(Si♀×Si♂、 Sn♀×Sn♂)和杂交子代(Si♀×Sn♂、 Sn♀×Si♂)的幼体发育进行观察,详细描述了幼体发育各个阶段的形态特征,并在18、22、26、30℃4个温度下对自繁和杂交子代的受精率、孵化率、各幼体时期的畸形率和生长状况进行了测量和分析。结果表明：杂交海胆的受精率均显著低于自繁海胆(P<0.05), Si♀×Sn♂杂交海胆在18℃时的孵化率与自繁海胆无显著性差异(P>0.05);Si♀×Sn♂杂交海胆幼体形态融合了两种自繁幼体的特征;温度对光棘球海胆自繁和杂交海胆子代的受精率、孵化率均有显著影响(P<0.05),中间球海胆在22℃下的受精率和孵化率最高,而光棘球海胆的最适受精和孵化温度为18℃, Si♀×Sn♂杂交海胆最适受精温度为22℃,而最适孵化温度为18℃;温度对海胆幼体发育的畸形率和生长均有显著影响( P<0.05),3种海胆幼体的最适生长水温均为18℃, Si♀× Sn♂杂交海胆在四腕幼体时期的畸形率最低,体长最小,除在八腕幼体时期畸形率最高外,在六腕幼体和八腕幼体时期的畸形率和生长性状均是介于自繁幼体之间。研究表明, Si♀×Sn♂杂交海胆在胚胎发育早期具有母本的热耐受性和生长劣势,但是随着幼体的生长发育,母性效应逐渐减弱,其在生长方面逐渐体现出父本的生长优势。     

母源因子boule在光棘球海胆性腺中的表达与定位

为鉴定光棘球海胆Mesocentrotus nudus生殖细胞标记基因,通过基因克隆、荧光定量PCR及切片原位杂交等技术分析了光棘球海胆(湿体质量为76.8 g±10.0 g)母源因子(boule)基因的分子特征及动态表达模式。结果表明:光棘球海胆boule cDNA序列全长为1788 bp,其中,3′非编码区为601 bp,5′非编码区为146 bp,开放阅读框(open reading frame,ORF)为1041 bp,共编码346个氨基酸,包含一个保守的RRM结构域;荧光定量PCR结果显示,boule为母源因子,在整个胚胎发育时期均有表达;boule基因在处于生长期(stageⅡ)光棘球海胆的肠、管足、体腔液和性腺中均有表达,其中,boule基因在精巢表达量最高(P<0.05);在卵巢中表达量随卵母细胞的成熟而逐渐升高,在成熟期(stageⅣ)卵巢中达到最高,精巢中表达量仅在生长期(stageⅡ)及成熟前期(stageⅢ)有较高表达;切片原位杂交显示,boule基因在光棘球海胆精巢的生殖细胞中特异表达,卵巢中未检测到阳性细胞信号。研究表明,光棘球海胆boule基因是雄性生殖细胞标记基因,本研究结果可为海胆雄性生殖细胞发育相关研究提供数据资料。     

中间球海胆、光棘球海胆自繁和杂交后代幼体发育及对高温的反应

对中间球海胆Strongylocentrotus intermedius(Si)和光棘球海胆S.nudus(Sn)进行完全双列杂交,通过对自繁后代(Si♀×Si♂、Sn♀×Sn♂)和杂交子代(Si♀×Sn♂、Sn♀×Si♂)的幼体发育进行观察,详细描述了幼体发育各个阶段的形态特征,并在18、22、26、30℃4个温度下对自繁和杂交子代的受精率、孵化率、各幼体时期的畸形率和生长状况进行了测量和分析。结果表明:杂交海胆的受精率均显著低于自繁海胆(P<0.05),Si♀×Sn♂杂交海胆在18℃时的孵化率与自繁海胆无显著性差异(P>0.05);Si♀×Sn♂杂交海胆幼体形态融合了两种自繁幼体的特征;温度对光棘球海胆自繁和杂交海胆子代的受精率、孵化率均有显著影响(P<0.05),中间球海胆在22℃下的受精率和孵化率最高,而光棘球海胆的最适受精和孵化温度为18℃,Si♀×Sn♂杂交海胆最适受精温度为22℃,而最适孵化温度为18℃;温度对海胆幼体发育的畸形率和生长均有显著影响(P<0.05),3种海胆幼体的最适生长水温均为18℃,Si♀×Sn♂杂交海胆在四腕幼体时期的畸形率最低,体长最小,除在八腕幼体时期畸形率最高外,在六腕幼体和八腕幼体时期的畸形率和生长性状均是介于自繁幼体之间。研究表明,Si♀×Sn♂杂交海胆在胚胎发育早期具有母本的热耐受性和生长劣势,但是随着幼体的生长发育,母性效应逐渐减弱,其在生长方面逐渐体现出父本的生长优势。     

母源因子boule在光棘球海胆性腺中的表达与定位

为鉴定光棘球海胆Mesocentrotus nudus生殖细胞标记基因,通过基因克隆、荧光定量PCR及切片原位杂交等技术分析了光棘球海胆(湿体质量为76.8 g±10.0 g)母源因子(boule)基因的分子特征及动态表达模式。结果表明:光棘球海胆boule cDNA序列全长为1 788 bp,其中,3′非编码区为601 bp, 5′非编码区为146 bp,开放阅读框(open reading frame, ORF)为1 041 bp,共编码346个氨基酸,包含一个保守的RRM结构域;荧光定量PCR结果显示,boule为母源因子,在整个胚胎发育时期均有表达;boule基因在处于生长期(stageⅡ)光棘球海胆的肠、管足、体腔液和性腺中均有表达,其中,boule基因在精巢表达量最高(P<0.05);在卵巢中表达量随卵母细胞的成熟而逐渐升高,在成熟期(stageⅣ)卵巢中达到最高,精巢中表达量仅在生长期(stageⅡ)及成熟前期(stageⅢ)有较高表达;切片原位杂交显示,boule基因在光棘球海胆精巢的生殖细胞中特异表达,卵巢中未检测到阳性细胞信号。研究表明,光棘球海胆boule基因是雄性生殖细胞标记基因,本研究结果可为海胆雄性生殖细胞发育相关研究提供数据资料。     

光棘球海胆CYP17基因的SNPs标记筛选及遗传分析

采用聚合酶链式反应、单链构象多态性(PCR-SSCP)技术和基因测序方法筛选光棘球海胆Strongylocentrotus nudus细胞色素17α羟化酶/17,20裂解酶(17α-hydroxylase/17,20-lyase,CYP17)基因编码区单核苷酸多态性(SNPs),并进行了基于SNPs的遗传分析。结果表明:在CYP17基因的270、417、666 nt处均发生了碱基的点突变,即G270A、A417G和C666T,前两个突变位点位于引物对BF/BR的扩增产物中,后一个突变位点位于引物对CF/CR的扩增产物中;引物对BF/BR的扩增产物可形成3种基因型,即AA、BB和AB基因型,A和B等位基因频率分别为0.54和0.46,AA、AB和BB基因型频率分别为0.30、0.48和0.22,该座位的杂合度(He)、纯合度(Ho)、多态性信息含量(PIC)和有效等位基因数(Na)分别为0.496 8、0.503 2、0.373 4和1.987 3;引物对CF/CR的扩增产物形成了两种基因型,即CC和CD基因型,C和D等位基因频率分别为0.68和0.32,CC和CD基因型频率分别为0.84和0.16,该座位的He、Ho、PIC和Na分别为0.268 8、0.731 2、0.232 7和1.367 6。遗传变异分析结果表明:两个座位均属于低度多态性,而且群体遗传杂合度较低,这反映了该群体的遗传一致性较高。本研究筛选的3个SNPs为今后CYP17基因在光棘球海胆性腺生长发育研究上提供了前期科研基础。     

光棘球海胆壳中化学成分的分离、鉴定及其抗肿瘤活性

采用硅胶柱色谱及薄层制备色谱等手段,从光棘球海胆Strongylocentrotus nudus壳中分离纯化出2种化合物,并对所获得的化合物经过理化性质、波谱分析和文献对照的方法进行结构鉴定,同时对所获得的化合物进行体外抗肿瘤活性测试。结果表明,从光棘球海胆壳中分离得到的2种化合物分别为棕榈酸(化合物1)和单棕榈酸甘油酯(化合物2)。体外抗肿瘤细胞活性测试表明,单棕榈酸甘油酯具有显著的抑制肿瘤细胞生长的活性,其可作为潜在的抗肿瘤药物进行进一步研究。     

光棘球海胆壳中化学成分的分离、鉴定及其抗肿瘤活性

采用硅胶柱色谱及薄层制备色谱等手段,从光棘球海胆Strongylocentrotus nudus壳中分离纯化出2种化合物,并对所获得的化合物经过理化性质、波谱分析和文献对照的方法进行结构鉴定,同时对所获得的化合物进行体外抗肿瘤活性测试。结果表明,从光棘球海胆壳中分离得到的2种化合物分别为棕榈酸(化合物1)和单棕榈酸甘油酯(化合物2)。体外抗肿瘤细胞活性测试表明,单棕榈酸甘油酯具有显著的抑制肿瘤细胞生长的活性,其可作为潜在的抗肿瘤药物进行进一步研究。     

光棘球海胆CYP17基因的SNPs标记筛选及遗传分析

采用聚合酶链式反应、单链构象多态性(PCR-SSCP)技术和基因测序方法筛选光棘球海胆Strongylocentrotus nudus细胞色素17α羟化酶/17,20裂解酶(17α-hydroxylase/17,20-lyase,CYP17)基因编码区单核苷酸多态性(SNPs),并进行了基于SNPs的遗传分析。结果表明:在CYP17基因的270、417、666 nt处均发生了碱基的点突变,即G270A、A417G和C666T,前两个突变位点位于引物对BF/BR的扩增产物中,后一个突变位点位于引物对CF/CR的扩增产物中;引物对BF/BR的扩增产物可形成3种基因型,即AA、BB和AB基因型,A和B等位基因频率分别为0.54和0.46,AA、AB和BB基因型频率分别为0.30、0.48和0.22,该座位的杂合度(He)、纯合度(Ho)、多态性信息含量(PIC)和有效等位基因数(Na)分别为0.496 8、0.503 2、0.373 4和1.987 3;引物对CF/CR的扩增产物形成了两种基因型,即CC和CD基因型,C和D等位基因频率分别为0.68和0.32,CC和CD基因型频率分别为0.84和0.16,该座位的He、Ho、PIC和Na分别为0.268 8、0.731 2、0.232 7和1.367 6。遗传变异分析结果表明:两个座位均属于低度多态性,而且群体遗传杂合度较低,这反映了该群体的遗传一致性较高。本研究筛选的3个SNPs为今后CYP17基因在光棘球海胆性腺生长发育研究上提供了前期科研基础。     

不同饵料模式与投喂方式对中间球海胆性腺营养成分的影响

在实验室条件下,进行了不同饵料模式与投喂方式对中间球海胆Strongylocentrotus intermedius性腺营养成分的影响研究。试验设置4种饵料模式( M1组投喂海带, M2组投喂海带+贻贝, M3组投喂南瓜, M4组投喂胡萝卜)和3种投喂方式(对照组投喂海带150 d, RM1组投喂南瓜75 d后投喂海带75 d, RM2组投喂胡萝卜75 d后投喂海带75 d),试验结束后,对海胆性腺中氨基酸、β-胡萝卜素和脂肪酸含量进行测定。结果表明：不同饵料模式条件下, M2组海胆性腺中氨基酸总量( TAA)、必需氨基酸总量( EAA)和EAA/TAA均最高; M4组鲜味氨基酸总量占氨基酸总量的百分比最高; M1与M2组雌、雄海胆的β-胡萝卜素含量及个体平均β-胡萝卜素含量均无差异性差异(P>0·05),二者显著高于其他2组(P<0·05);M3组雌海胆性腺中多不饱和脂肪酸(PUFA)含量显著高于其他3组(P<0·05),雄海胆中PUFA含量4组间无显著性差异(P>0·05)。不同投喂方式条件下, RM2组海胆性腺中TAA、 EAA和EAA/TAA含量均最高;对照组雄海胆性腺中β-胡萝卜素含量及个体平均β-胡萝卜素含量均显著高于RM1和RM2组( P<0·05),而雌海胆性腺中二者的含量与RM1组无显著性差异(P>0·05),但均显著高于RM2组(P<0·05);RM1组雌、雄海胆性腺中PUFA含量均最高。研究表明： M2组饵料模式和RM2组投喂方式均可提高海胆性腺中氨基酸含量,且M2组饵料模式对海胆个体平均β-胡萝卜素含量的提高有促进作用, M3组饵料模式和RM1组投喂方式可明显提高海胆性腺中PUFA的含量。     

镉对中间球海胆精子发生的影响

研究了不同浓度镉离子(0.005、0.1、0.5、1.0 mg/L)对中间球海胆Strongylocentrotus interm edius精子发生的影响。结果显示:在光镜下观察,染毒第6、18 d后,各浓度组中间球海胆滤泡结构完好,生殖细胞发育情况同对照组基本一样;染毒第42 d后,0.5、1.0 mg/L Cd2 浓度组生精细胞排列混乱,滤泡膜破损;染毒第54 d后,各浓度组海胆性腺均出现滤泡解体现象。对染Cd2 54 d的0.5、1.0 mg/L组海胆精巢进行超薄切片观察,可见各级生精细胞亚显微结构变化明显,主要表现为核染色质异常凝集,核膜结构损伤,线粒体空泡化,精子形态畸形等。说明镉能影响中间球海胆的精子发生,导致精子质量下降。     

中间球海胆性别性状的微卫星分析

针对中间球海胆Strongylocentrotus interm edius育苗生产中很难进行活体性别鉴定这一特点,采用组织切片法和微卫星标记分析法对海胆进行观察分析。试验用样品由大连太平洋海珍品有限公司提供,共31只。采用组织切片法鉴别雌、雄个体,发现17只个体为雌性,14只个体为雄性。同时,将31只个体分为雌、雄两个群体,提取性腺组织基因组DNA,利用已经筛选好的11对引物对雌、雄两个群体进行微卫星分析。结果表明,两个群体的遗传多样性没有显著差异;发现INST09-A,INST10-A,INST10-B三个等位基因的频率在两个群体间存在极显著差异(P<0.01),位点INST10在雌、雄两个群体中的基因型频率存在极显著差异(P<0.01)。初步说明这些位点及相应等位基因可能与性别决定位点存在一定的连锁关系。     

中间球海胆精子超低温冷冻损伤的研究

应用透射电镜技术研究了超低温冷冻保存对中间球海胆Strongylocentrotus intermedius精子超微结构的影响。结果表明：不加抗冻剂的情况下,精子线粒体和顶体结构不完整,质膜、鞭毛破损。加入保护剂后,多数精子结构完好,部分精子细胞器受损,表现为质膜褶皱或膨胀举起,与核膜的间隙明显增大;顶体肿胀、破裂或脱落;线粒体嵴间隙增大,内部出现空泡,甚至线粒体内膜破损,内嵴减少,呈弥散状;鞭毛被膜肿胀,呈波浪状,＂9＋2＂型结构模糊;细胞核结构没有明显变化。应用单细胞凝胶电泳技术研究了精子冷冻保存前后DNA的损伤。结果表明,不加抗冻剂的冷冻组及添加抗冻剂的试验组精子DNA损伤情况与鲜精相比均无显著差异（P〉0.05）,冷冻对精子结构的损伤是造成精子活力及受精率下降的主要原因。     

中间球海胆精子超低温冷冻保存方法的研究

对中间球海胆Strongylocentrotus intermedius精子的超低温保存技术进行了研究。以煮沸消毒海水为基础液,添加体积分数为10%的DMSO、体积分数为6%的甘油以及25 mmol/L海藻糖配制成冷冻保护液,与鲜精液按体积比以1∶1混合,在4℃下平衡15 min,于液氮面上方15、3 cm处分别停留3 min和5 min,然后浸入液氮保存。结果表明：用此方法保存的精子解冻后其存活率可达58.2%,受精率达24.7%;解冻后精子受精时,在受精海水中分别添加0、28、56、112、280 mmol/L的葡萄糖,56 mmol/L组的受精率高于其他组,受精率达26%;精子解冻后受精时,在受精海水中添加适量葡萄糖有助于提高受精率。本试验表明,冷冻过程中降温方式、冷冻保护液、平衡时间对精子的冷冻保存效果均有较大影响,各个因素通过优化组合可以大大提高解冻后精子的存活率和受精率。     

中间球海胆雌核发育单倍体胚胎的初步研究

采用不同剂量(30～330mJ／cm^2)的紫外线对中间球海胆Strongylocentrotus intermedius精子进行照射失活,获得了雌核发育的单倍体胚胎。测定了照射组与对照组的受精率、单倍体诱导率、2～4细胞期的畸形率和破膜囊胚成活率,探明了精子灭活的紫外线适宜剂量为270mJ／cm^2;并进行了早期胚胎地衣红压片观察和早期囊胚染色体数分析,观察到照射组早期胚胎的精核具有DCB小体,对照组早期囊胚的染色体数为2n=42,照射组雌核发育单倍体胚胎的染色体数为n=21。