乙型肝炎病毒DNA聚合酶逆转录酶反式调节蛋白1基因的克隆化研究

目的应用抑制性消减杂交(SSH)技术及生物信息学(bioinformatics)技术筛选并克隆乙型肝炎病毒(HBV)DNA聚合酶(DNA Polymerase)逆转录酶(RT)反式调节新型靶基因,进一步阐明HBV感染相关疾病的发病机制.方法以HBV DNA聚合酶逆转录酶表达质粒pcDNA3.1(-)-RT转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为平行对照,提取mRNA并进行抑制性消减杂交分析.并应用分子生物学技术,结合生物信息学技术,克隆RT反式调节作用的新的靶基因.结果对于所获基因片段序列分析表明,其中之一为新型基因片段.从HepG2细胞提取总RNA,以逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)技术扩增获得该新基因的全长序列,并测序证实,因其可以被HBV DNA聚合酶逆转录酶反式调节,故命名为DNA多聚酶反式调节蛋白1(DNA PTP1),已在GenBank中注册,注册号AY450389.DNAPTP1基因的编码序列全长为435个核苷酸(nt),编码产物由144个氨基酸残基(aa)组成.结论逆转录酶反式调节新靶基因DNAPTPl的发现,为进一步研究RT蛋白的分子生物学机制和探索新型治疗技术奠定基础.     

乙型肝炎病毒DNA聚合酶中核糖核酸酶RNase H反式调节基因DNAPTP4的克隆化研究

目的应用抑制性消减杂交(SSH)技术筛选乙型肝炎病毒(HBV)核糖核酸酶RNaseH蛋白反式激活基因差异表达的cDNA,克隆RNaseH反式激活相关靶基因。方法以RNaseH表达质粒pcDNA31(-)RNaseH转染HepG2细胞,以空载体pcDNA31(-)为对照;制备转染后的细胞裂解液,提取mRNA并逆转录为cDNA,经RsaⅠ酶切后,将实验组cDNA分成两组,分别与两种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性PCR,将产物与T/A载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析,其未知基因片段通过Kozak规则和多聚腺苷酸信号序列,初步确定。以逆转录聚合酶链反应(RTPCR)技术扩增获得该新基因的全长序列,并测序加以证实。结果该新基因被命名为DNAPTP4,在GenBank中注册,注册号为AY450392。DNAPTP4基因的编码序列全长为828个核苷酸(nt),编码产物由276个氨基酸残基(aa)组成。结论应用SSH技术成功筛选与克隆RNaseH反式激活新型靶基因DNAPTP4,为进一步阐明RNaseH反式调节作用及其在HBV感染中的分子生物学机制提供理论依据和研究方法。     

HBV X蛋白反式调节基因XTP11的克隆化研究

目的:应用寡核苷酸基因芯片技术及生物信息学分析,筛选并克隆乙肝病毒X蛋白(HBxAg)反式激活新型靶基因.方法:以HBxAg表达质粒pcDNA 3.1(-)-X转染HepG2细胞,以空载体pcDNA 3.1(-)为平行对照,提取mRNA并进行寡核苷酸基因芯片分析.对于所获基因片段序列分析表明,其中之一为新型基因片段,与GenBank中注册的已知功能基因序列没有同源性.通过序列同源性搜索和比对和电子拼接,根据基因起始密码子的Kozak规则和终止密码子下游保守的多聚腺苷酸信号序列,确定新型基因序列.从转染了pcDNA 3.1(-)-X的HepG2细胞提取总RNA,以逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术,扩增获得该新基因的全长序列,并测序证实.结果:该新基因命名为XTP11,在GenBank中注册,注册号为AY740520.该基因的编码序列全长为1 344个核苷酸(nt),编码产物由448个氨基酸残基(aa)组成.结论:HBxAg反式激活新型靶基因XTP11的筛选与克隆,为进一步研究HBxAg反式激活作用的分子生物学机制奠定基础.     

乙型肝炎病毒前-S1蛋白反式激活蛋白l基因的克隆化研究

目的　应用抑制性消减杂交 (SSH)技术及生物信息学 (bioinformatics)技术筛选并克隆乙型肝炎病毒 (HBV)前 S1蛋白(pre S1)反式激活新型靶基因 ,进一步阐明HBV感染相关性疾病的发病机制。方法　以HBV前 S1蛋白表达质粒pcDNA3 .1(-) PreSl转染HepG2细胞 ,以空载体pcDNA3 .1(-)为平行对照 ,提取mRNA并进行抑制性消减杂交分析。并应用分子生物学技术 ,结合生物信息学技术 ,克隆HBV前 Sl反式激活作用的新的靶基因。结果　对于所获基因片段序列分析表明 ,其中之一为新型基因片段。从HepG2细胞提取总RNA ,以逆转录多聚酶链反应 (RT PCR)技术扩增获得该新基因的全长序列 ,并测序证实 ,因其可以被前 S1蛋白反式激活 ,故命名为前Sl反式激活蛋白 1(PSlTPl) ,已在GenBank中注册 ,注册号 :AY42 6672。PSlTPl基因的编码序列全长为64 2个核苷酸 (nt) ,编码产物由 2 13个氨基酸残基 (aa)组成。结论　HBV前 Sl蛋白在HBV进入宿主细胞的过程中起着重要的作用 ,最近的研究表明前 Sl蛋白还具有反式激活的作用 ,上调宿主细胞某些基因的表达 ,从而改变宿主正常的应答水平 ,引起病变。HBV前 Sl反式激活新靶基因的发现 ,为进一步研究HBV前 Sl蛋白的分子生物学机制和探索新型治疗技术奠定基础     

乙型肝炎病毒前-S1蛋白反式激活蛋白3基因的克隆化研究

目的应用抑制性消减杂交技术(SSH)及生物信息学技术(bioinformatics)筛选并克隆乙型肝炎病毒(HBV)前-S1蛋白(Pre-S1)反式激活新型靶基因，进一步阐明HBV感染相关疾病的发病机制。方法以HBV前-S1蛋白表达质粒pcDNA3．1(-)-PreS1转染HepG2细胞，以空载体pcDNA3．1(-)为平行对照，提取mRNA并进行抑制性消减杂交分析。并应用分子生物学技术，结合生物信息学技术，克隆HBV前-S1反式激活作用的新的靶基因。结果对于所获基因片段序列分析表明，其中之一为新型基因片段。从HepG2细胞提取总RNA，以逆转录多聚酶链反应(RT—PCR)技术扩增获得该新基因的全长序列，并测序证实，因其可以被前-S1蛋白反式激活，故命名为前-S1反式激活蛋白3(PSITP3)，已在GenBank中注册，注册号：AY446274。PSITP3基因的编码序列全长为1173个核苷酸(nt)，编码产物由390个氨基酸残基(aa)组成。结论HBV前-S1蛋白在HBV进入宿主细胞的过程中起着重要的作用，最近的研究表明前-S1蛋白还具有反式激活的作用，上调宿主细胞某些基因的表达，从而改变宿主正常的免疫应答水平，引起病变。HBV前-S1反式激活新靶基因的发现，为进一步研究HBV前-S1蛋白的分子生物学机制和探索新型治疗技术奠定基础。     

丙型肝炎病毒F蛋白反式激活基因2的克隆化研究

目的:应用抑制性消减杂交(SSH)技术及生物信息学(bioinformatics)技术筛选并克隆丙型肝炎病毒(HCV)F蛋白反式激活新型靶基因,进一步阐明HCV感染相关疾病的发病机制.方法:以HCV F蛋白表达质粒pcDNA3.1(-)-F转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为平行对照,提取mRNA并进行抑制性消减杂交分析.应用分子生物学技术,结合生物信息学技术,克隆HCV F蛋白反式激活作用的新的靶基因.结果:对于所获基因片段序列分析表明,其中之一为新型基因片段.从HepG2细胞提取总RNA,以逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)技术扩增获得该新基因的全长序列,并测序证实,因其可以被F蛋白反式激活,故命名为F蛋白反式激活蛋白2(HCV FTP2),已在GenBank中注册,注册号:AY740522.HCV FTP2基因的编码序列全长为177个核苷酸(nt),编码产物由58个氨基酸残基(aa)组成.结论:HCV F蛋白在病毒的自然感染过程中有明显的表达,最近的研究表明蛋白还具有反式激活的作用,上调宿主细胞某些基因的表达,可能参与HCV致癌.HCV F反式激活新靶基因的发现,为进一步研究HCV F蛋白的分子生物学机制和探索新型治疗技术奠定了基础.     

乙型肝炎病毒前-S1蛋白反式激活蛋白2基因的克隆化研究

目的：应用抑制性消减杂交(SSH)技术及生物信息学(bioinformatics)技术筛选并克隆乙型肝炎病毒(HBV)前-S1蛋白(pre-S1)反式激活新型靶基因,进一步阐明HBV感染相关疾病的发病机制。方法：以HBV前-S1蛋白表达质粒pcDNA3．1(-)-pre-S1转染HepG2细胞．以空载体pcDNA3．1(-)为平行对照,提取mRNA并进行抑制性消减杂交分析。并应用分子生物学技术,结合生物信息学技术,克隆HBV前-S1反式激活作用的新的靶基因。结果：对于所获基因片段序列分析表明,其中之一为新型基因片段。从HepG2细胞提取总RNA,以逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)技术扩增获得该新基因的全长序列,并测序证实,因其可以被前-S1蛋白反式激活,故命名为前-S1反式激活蛋白2(PS1TP2),已在GenBank中注册,注册号：AY426673。PS1TP2基因的编码序列全长为573个核苷酸(nt),编码产物由190个氨基酸残基(aa)组成。结论：HBV前-S1蛋白在HBV进入宿主细胞的过程中起着重要作用,最近的研究表明前-S1蛋白还具有反式激活的作用,上调宿主细胞某些基因的表达,从而改变宿主正常的免疫应答水平,引起病变。HBV前-S1反式激活新靶基因的发现,为进一步研究HBV前-S1蛋白的分子生物学机制和探索新型治疗技术奠定基础。     

乙型肝炎病毒E抗原反式激活靶基因的克隆化研究

目的 应用抑制性消减杂交(SSH)技术及生物信息学技术(bioinfonnatics)筛选并克隆乙型肝炎病毒(HBV)e抗原(HBeAg)反式激活新型靶基因。方法 以HBeAg表达质粒pcDNA3．1(-)-HBeAg转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3．1(-)为平行对照,提取mRNA并进行抑制性消减杂交(SSH)分析。对于所获基因片段序列分析表明,其中之一为新型基因片段,与GenBank中注册的已知功能基因序列没有同源性,利表达序列标签(EST)序列的搜索和比对,进行电子拼接,根据基因起始密码子的KozaK规则和终止密码子下游保守的多聚腺苷酸信号序列,确定新型基因序列。从HepG2细胞提取总RNA,以逆转录多聚酶链反应(RTPCR)技术扩增获得该新基因的全长序列,并测序证实,命名为HBeAgTP,在GenBank中注册,注册号为AY423624。结果 HBeAg TP基因的编码序列全长为324个核苷酸(nt),编码产物由107个氨基酸残基(aa)组成。结论 HBeAg反式激活新型靶基因HBeAg TP的筛选与克隆,为进一步研究。HBeAg在体内激活作用的分子生物学机制和探索新型治疗技术奠定基础。     

乙型肝炎病毒X蛋白反式激活基因XTP3的克隆化研究

目的 应用抑制性消减杂交(SSH)技术筛选乙型肝炎病毒(HBV)x蛋白(HBxAg)反式激活基因，克隆HBxAg反式激活相关靶基因。方法以HBxAg表达质粒PcDNA3．1(-)-x转染HepG2细胞，以空载体PcDNA3．1(-)为对照；制备转染后的细胞裂解液，提取mRNA并逆转录为cDNA，经RsaI酶切后，将实验组cDNA分成两组，分别与两种不同的接头衔接，再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性PCR，将产物与PGEM-Teasy载体连接，构建cDNA消减文库，并转染大肠杆菌进行文库扩增，随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析，发现其中之一为未知基因片段，与GenBank中注册的已知功能基因序列没有同源性。通过序列同源性搜索比对，电子拼接成功，根据基因起始密码子的Kozak规则和终止密码子下游保守的多聚腺苷信号序列，初步确定新型基因序列。从转染了pcDNA3．1(-)-x的HePG2细胞提取总RNA，以RT-PCR技术扩增获得该新基因的全长序列，并测序加以证实。结果 发现的新基因命名为XTP3，在GenBank中注册，注册号为AF490252。xTP3基因的编码序列全长为1020个核苷酸(nt)，编码产物由340个氨基酸残基(aa)组成。结论 应用抑制性消减杂交技术成功筛选与克隆HBxAg反式激活新型靶基因XTP3，为进一步阐明HBxAg反式调节作用及其在HBV感染中的分子生物学机制提供理论依据和研究方法。     

应用抑制性消减杂交技术筛选乙型肝炎病毒DNA聚合酶末端蛋白的反式激活基因

目的 应用抑制性消减杂交(SSH)技术构建乙型肝炎病毒(HBV)DNA聚合酶末端蛋白(TP)反式激活基因的差异表达的cDNA消减文库，克隆TP反式激活相关基因。方法 以TP表达质粒pcDNA3．1(-)-TP转染HepG2细胞，以空载休peDNA3，1(-)为对照；制备转染后的细胞裂解液，提取mRNA并逆转录为cDNA，经Rsal酶切后，将实验组cDNA分成两组，分别与两种不同的接头衔接，再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性PCR，将产物与T／A载体连接，构建cDNA消减文库，并转染大肠杆菌进行文库扩增，随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析。结果 文库扩增后得到35个阳性克隆，经菌落聚合酶链反应(PCR)分析，得到34个200-1000bp插入片段。对所得片段测序，并进行同源性分析，显示14种己知基因编码蛋白和1种未加功能基因序列，可能是TP反式激活靶基因。结论 成功构建乙型肝炎病毒TP反式激活基因差异发达的cDNA消减文库，为今后进一步分析、研究病毒蛋白的致病机制奠定基础。     

乙型肝炎病毒X蛋白反式激活基因XTP13的克隆

目的克隆乙型肝炎病毒（HBV）x蛋白反式激活新型靶基因。方法以HBVX蛋白表达质粒pcDNA3、1（－）-X转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3．1（－）为平行对照,提取总RNA进行逆转录,对产物行基因表达谱芯片分析,确定新基因编码序列后,以逆转录多聚酶链反应（RT—PCR）技术扩增新基因序列。结果获得新基因的全长序列,并测序证实,命名为X蛋白反式激活蛋白13（XTP13）。结论成功克隆XTP13,为进一步阐明HBxAg在HBV感染中的分子生物学机制奠定基础。     

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS3反式激活基因1的克隆化研究

目的 应用抑制性消减杂交技术(SSH)及生物信息学技术(bioinformatics)筛选并克隆丙型肝炎病毒非结构蛋白3(NS3)反式激活新型靶基因，进一步阐明HCV感染相关疾病的发病机制。方法 以HCVNS3蛋白表达质粒pcDNA3．1(-)-NS3转染HepG2细胞，以空载体pcDNA3．1(-)为平行对照，提取mRNA并进行抑制性消减杂交分析。并应用分子生物学技术，结合生物信息学技术，克隆HCVNS3反式激活作用的新的靶基因。结果 对于所获基因片段序列分析表明，其中之一为新型基因片段。从HepG2细胞提取总RNA，以逆转录多聚酶链反应(RT—PCR)技术扩增获得该新基因的全长序列，并测序证实，因其可以被NS3蛋白反式激活，故命名为NS3TP1，已在GenBank中注册，注册号为AYll6969。NS3评1基因的编码序列全长为1932个核昔酸(nt)，编码产物由眺个氨基酸残基(aa)组成。结论 HCVNS3是一种典型的病毒基因组编码的具有反式激活作用的蛋白，HCVNS3反式激活作用的新靶基因的发现，为进一步研究HCVNS3蛋白反式激活作用的分子生物学机制和探索新型治疗技术奠定基础。     

乙型肝炎病毒X蛋白反式激活基因克隆化的研究

目的 应用抑制性消减杂交（SSH）技术构建乙型肝炎病毒X蛋白（HBX）反式激活基因差异表达的cDNA消减文库，克隆HBX反式激活相关基因。方法 以HBX表达质粒pcDNA3.1(-)-X转染HepG2细胞，以空载体pcDNA3.1(-)转染的HepG2细胞为对照。制备转染后的细胞裂解液，提取mRNA并逆转录为cDNA，经RsaⅠ酶切后，将实验组cDNA分成两组。分别与两组不同的接头衔接，再对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制聚合酶链反应（PCR），将产物与T/A载体连接，构建cDNA消减文库，并转染大肠杆菌进行文库扩增，随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析。结果 成功构建人HBX反式激活基因差异表达的cDNA消减文库；文库扩增后得到85个白色克隆，进行菌落PCR分析。均得以200-1000bp插入片段，挑取含有插入片段的65个克隆进行测序，并通过生物信息学分析获得19种已知基因序列。和15个未知基因。结论 应用SSH技术成功构建了HBX反式激活基因差异表达的cDNA消减文库，该文库的建立为进一步阐明HBX反式调节的靶基因及致肝细胞癌发生的分子生物学机制提供理论依据。     

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS3反式激活基因2的克隆化研究

目的 应用抑制性消减杂交技术(SSH)及生物信息学技术(bioinformcs)筛选并克隆丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白3(NS3)反式激活新型靶基因，进一步阐明HCV感染相关疾病的发病机制。方法 以HCVNS3蛋白表达质粒pcDNA3．1(-)-NS3转染HepG2细胞，以空载体pcDNA3．1(-)为平行对照，提取mRNA并进行抑制性消减杂交分析。并应用分子生物学技术，结合生物信息学技术，克隆HCvNS3反式激活作用的新的靶基因。结果 对于所获基因片段序列分析表明，其中之一为新型基因片段，从HepG2细胞提取总RNA，以逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)技术扩增获得该新基因的全长序列，并测序证实，因其可以被NS3蛋白反式激活，故命名为NS3TP2，在GenBank中注册，注册号为AYll6970。NS3TP2基因的编码序列全长为1299个核苷酸(nt)，编码产物由432个氨基酸残基(aa)组成。结论 HCVNS3是一种典型的病毒基因组编码的具有反式激活作用的蛋白，而抑制性消减杂交(SSH)是一种鉴定、分离组织细胞中选择性表达基因的技术。通过这种技术，发现了HCVNS3反式激活作用的新的靶基因，这一发现，为进一步研究HCVNS3蛋白反式激活作用的分子生物学机制和探索新型治疗技术奠定基础。     

应用基因芯片技术对乙型肝炎病毒DNA聚合酶反式调节基因的研究

目的应用基因表达谱芯片(基因芯片)技术检测乙型肝炎病毒DNA聚合酶(HBVDNAP)三个功能域[(N末端蛋白(TP),逆转录酶DNA多聚酶(PR),核糖核酸酶H(RNaseH)]的表达对肝母细胞瘤细胞HepG2基因表达谱的影响,进一步阐明HBVDNAP对肝细胞基因表达的调节机制及其生物学功能。方法以常规分子生物学技术分别构建真核表达载体pcDNA3.1()TP,pcDNA3.1()PR和pcDNA3.1()RNaseH,以脂质体转染肝母细胞瘤细胞系HepG2,提取mRNA,逆转录为cDNA,与转染空白表达载体pcDNA3.1()的HepG2细胞进行DNA芯片分析。结果TP有111条基因表达水平上调,88条基因表达水平下调。PR有79条基因表达水平上调,90条基因表达水平下调。RNaseH有113条基因表达水平上调,109条基因表达水平下调。结论应用基因芯片成功筛选HBVDNAP三个功能域蛋白转染细胞后的差异表达基因,为进一步研究HBVDNAP的反式激活作用及免疫调节机制提供了新的依据。     

乙型肝炎病毒前-S1蛋白反式激活蛋白1基因的克隆化研究

目的 应用抑制性消减杂交(SSH)技术及生物信息学(bioinformatics)技术筛选并克隆乙型肝炎病毒(HBV)前-S1蛋白(pre-S1)反式激活新型靶基因,进一步阐明HBV感染相关性疾病的发病机制。方法 以HBV前-S1蛋白表达质粒pcDNA3．1(-)-PreSl转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为平行对照,提取mRNA并进行抑制性消减杂交分析。并应用分子生物学技术,结合生物信息学技术,克隆HBV前-S1反式激活作用的新的靶基因。结果 对于所获基因片段序列分析表明,其中之一为新型基因片段。从HepG2细胞提取总RNA,以逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)技术扩增获得该新基因的全长序列,并测序证实,因其可以被前-S1蛋白反式激活,故命名为前S1反式激活蛋白1(PSITP1),已在GenBank中注册,注册号：AY426672。PSITP1基因的编码序列全长为642个核苷酸(nt),编码产物由213个氨基酸残基(aa)组成。结论 HBV前-S1蛋白在HBV进入宿主细胞的过程中起着重要的作用,最近的研究表明前-S1蛋白还具有反式激活的作用,上调宿主细胞某些基因的表达,从而改变宿主正常的应答水平,引起病变。HBV前-S1反式激活新靶基因的发现,为进一步研究HBV前-S1蛋白的分子生物学机制和探索新型治疗技术奠定基础。