实时荧光定量RT-PCR检测牛库布病毒

牛库布病毒(bovine kobuvirus,BKoV)可能是一个腹泻相关病原,目前还没有检测该病毒的实时荧光定量RT-PCR方法的报道。依据BKoV 3D核苷酸序列,采用Primer 6.0设计了一对引物,通过优化反应条件和反应体系,成功建立了检测BKoV的TB Green染料法实时荧光定量RT-PCR方法。结果显示此方法在4.86×10~8～4.86×10~2 copies·μL~(-1)病毒浓度之间具有良好的线性关系,相关系数为0.999 5,扩增效率为92.75%;此方法只特异性检测BKoV,而与其他常见的腹泻病原没有交叉反应;组内及组间的变异系数均小于2%;最低检测下限为4.86×10~2 copies·μL~(-1)。本研究所建的实时荧光定量RT-PCR方法对奶牛和牦牛腹泻粪便样本中BKoV的检出率明显高于已报道的3篇有关RT-PCR方法。对2018年5月—2019年5月采集自青藏高原地区(青海、西藏和四川藏区)的131份牦牛腹泻粪便样本进行检测,结果显示BKoV检出率为31.30%。首次成功建立了检测BKoV的实时荧光定量RT-PCR方法,具有良好的特异性和稳定性,且灵敏度高,为BKoV的检测及流行病学调查提供了一种新的技术手段;并且首次证实BKoV在牦牛中的流行,为牦牛腹泻的防控问题提供了参考。     

检测山羊嵴病毒的实时荧光定量PCR方法的建立和应用

山羊嵴病毒（caprine kobuvirus，CKoV）是国内山羊新发病毒，本试验目的是建立检测CKoV的实时荧光定量PCR方法，并对西南三省腹泻山羊粪样进行该病毒的检测。选择CKoV最保守的3D基因序列，设计3D基因引物，初步设计实时荧光定量PCR，经优化反应条件和反应体系，成功建立了检测CKoV的TB Green染料法实时荧光定量PCR方法。该方法在病毒浓度2.23×10²～2.23×10⁸copies·μL^-1范围内线性关系良好，相关系数为0.999 2，扩增效率为110%；此方法具有良好的特异性和稳定性，最低检测限为2.23×10¹copies·μL^-1。采用所建立的方法对2020年1—4月采集自四川、云南和重庆的共15个场79份山羊腹泻粪样本进行检测，结果CKoV的平均检出率为25.3%，场阳性率为53.3%。并且本试验获得了13个完整的CKoV 3D基因，遗传进化分析表明这13个3D基因具有独特的进化趋势。本研究为CKoV的分子检测提供了一种新的技术手段和基础流行病学数据。     

牛星状病毒、牛病毒性腹泻病毒1型、牛冠状病毒和牛轮状病毒四重实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

利用多重荧光定量RT-PCR （real-time RT-PCR）方法,提高对多病原检测的速度和灵敏度,促进对犊牛腹泻的快速诊断和及时治疗。分别在牛星状病毒（BAstV）ORF2基因,牛病毒性腹泻病毒1型（BVDV-1）5'端非编码区,牛冠状病毒（BCV）N pro基因和牛轮状病毒（BRV）VP6基因的保守基因序列设计、合成并试验筛选了四对有效的特异性引物和探针。进一步利用含4种病毒目的片段的重组质粒,对引物和探针的浓度以及反应条件进行了优化,建立了Real-time RT-PCR标准曲线,并对四重Real-time PCR方法的特异性、敏感性、重复性和各种临床样本的适用性进行了评价。结果显示：Real-time RT-PCR最适退火温度和时间分别为50.0℃和45 s,BAstV、BVDV-1、BCV和BRV的引物浓度分别为300、300、400和500 nmol·L^-1,探针浓度分别为250、150、100和300 nmol·L^-1。对BVDV-1、BCV和BRV的最低检测限均为10²copies·μL^-1,对BAstV的最低检测限为10³ copies·μL^-1,具有良好的特异性和重复性。该方法对临床采集的粪样的阳性检出率高于PCR方法。上述结果表明,建立的四重Real-time RT-PCR方法可以用于犊牛腹泻常见病原BAstV、BVDV-1、BCV和BRV的快速鉴别诊断。     

4种猪腹泻病毒恒温隔绝式荧光RT-PCR检测方法的建立及应用

为鉴别猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪轮状病毒(PoRV)和猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)这4种猪主要腹泻病毒，本研究分别针对PEDV M基因、TGEV M基因、PoRV NSP5基因、PDCoV M基因设计特异性引物和探针，经过方阵法优化恒温隔绝式荧光RT-PCR(iiRT-PCR)反应条件，建立了检测这4种猪腹泻病毒iiRT-PCR方法。用建立的iiRT-PCR方法分别检测PEDV、TGEV、PoRV、PDCoV、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、日本脑炎病毒(JEV),并对iiRT-PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果显示该方法特异性强，对PEDV、TGEV、PoRV、PDCoV的检测下限分别为10²、10²、10³、10³ TCID₅₀/mL,并具有良好的组内和组间重复性；而荧光定量PCR方法的检测下限分别为10¹、10²、10²、10^2<...     

牛传染性鼻气管炎gE基因TaqMan-MGB与SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR方法的建立及应用

为建立检测牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)的荧光定量检测方法，本研究根据IBRV gE基因的序列设计了相应的探针和引物，分别建立TaqMan-MGB探针和SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法，并对2种方法进行了综合比较。结果显示，TaqMan-MGB探针和SYBR GreenⅠ定量荧光PCR方法的灵敏度分别达到1.0×10¹ copies/μL和1.0×10² copies/μL;2种荧光定量方法对除IBRV的其他牛病毒和细菌检测结果均为阴性；重复性检测中变异系数均小于2.3%;检测了130份来自西藏的牦牛样品，2种荧光定量PCR阳性检出率均为100%。以上结果表明，2种荧光定量方法都可用于检测IBRV,且TaqMan-MGB荧光定量PCR敏感性高于SYBR GreenⅠ荧光定量PCR。     

猪急性腹泻综合征冠状病毒SYBR Green荧光定量PCR检测方法的建立及应用

为建立快速、灵敏且特异的检测猪急性腹泻综合征冠状病毒（swine acute diarrhea syndrome coronavirus,SADS-CoV）检测方法,本试验扩增SADS-CoV N基因保守区域将其克隆至pMD18-T载体。所构建的重组质粒pMD18-T-SADS-qN作为阳性质粒标准品,以其为模板建立一种SYBR Green荧光定量PCR检测方法。结果显示,所建立方法在3.31×10¹~3.31×10⁷拷贝·μL^-1模板量时,呈良好的线性关系,相关系数（R²）为0.997,斜率为-3.318。该方法特异性检测SADS-CoV;而猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）、猪德尔塔冠状病毒（PDCoV）和猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）检测结果均为阴性。所构建的标准品检测灵敏度下限可以达到3.31×10¹拷贝·μL^-1,组内和组间变异系数均小于1%,表明其具有良好的灵敏性和重复性。用该方法检测SADS-CoV感染IPI-2I和IPEC-J2细胞后不同时间点和不同接毒剂量的复制情况,结果显示,SADS-CoV感染细胞后2 h病毒含量较低,在12~36 h病毒含量迅速增长,36 h后增长速度减缓且病毒含量维持在较高水平。分别用0、0.1、1 MOI SADS-CoV感染细胞结果显示病毒的mRAN转录水平呈现剂量依赖性增加,当MOI为1时,IPI-2I和IPEC-J2细胞病毒含量分别为10^6.7、10^5.3拷贝·mL^-1。进一步利用所建立的方法对经口服攻毒SADS-CoV仔猪的临床样本进行检测,结果发现病毒在空肠回肠含量较高,表明病毒主要定殖于空肠和回肠。综上表明,本研究建立SYBR Green荧光定量PCR检测方法能灵敏特异地检测SADS-CoV,为SADS-CoV的诊断和病毒相关基础研究提供可靠的检测手段。     

牦牛源正呼肠孤病毒2型的检测和分离鉴定

旨在调查川西北牦牛哺乳动物正呼肠孤病毒（MRV）的感染情况并分离病毒。采用RT-PCR方法，对采自川西北15个牧场的72份牦牛腹泻粪便样本和其中5个牧场的15份腹泻牦牛血清样本进行MRV检测，阳性样本进一步用分型PCR确定其血清型。结果显示，粪便样本中MRV检出率为20.83%（15/72），血清2型的比例为60%（9/15）；血清样本中MRV检出率为40%（6/15），血清2型的比例为83.33%（5/6）；未检测到其他血清型。成功地从腹泻粪便中分离到1株MRV血清2型毒株（TCID₅₀为4×10^-8.56·mL^-1），并获得长度为23 587 bp的分离株全基因组，该分离株与中国猪源毒株的遗传关系最近；与GenBank中所有的MRV S1基因相比，该分离株有4个独特的氨基酸突变。本研究从牦牛中检测到MRV，并分离到1株牛源MRV血清2型毒株，为进一步研究MRV血清2型生物学特性奠定了基础。     

BHK-21细胞中猪乙型脑炎病毒动态增殖的研究

为了研究猪乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus, JEV)在仓鼠肾细胞(BHK-21细胞)中的增殖情况，试验首先建立了实时荧光定量PCR方法，并检测该方法的敏感性、特异性和重复性，然后利用建立的实时荧光定量PCR方法和病毒半数组织感染量(TCID₅₀)方法测定并比较猪JEV在BHK-21细胞中的增殖规律。结果表明：建立的猪JEV实时荧光定量PCR检测方法的扩增效率为99.3%,敏感性、特异性和重复性良好，检测敏感性可以达到1.0×10¹ copies/μL;TCID₅₀方法测定的细胞悬液和细胞培养上清液中的病毒含量分别为1.0×10^5.44 TCID₅₀/0.1 mL和1.0×10^4.86 TCID₅₀/0.1 mL,实时荧光定量方法测定的病毒粒子数量分别为1.0×10^7.50 copies/μL和1.0×10^5.60 copies/μL,两种方法在细胞悬液中...     

一种鉴别尼帕病毒和高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒二重荧光RT-PCR检测方法的建立

为建立一种快速、敏感和特异地鉴别尼帕病毒(NiV)和高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)的检测方法,本试验以NiV M基因和HP-PRRSV nsp2基因为靶序列,通过优化反应条件建立了一种二重荧光RT-PCR检测方法,并对该方法的特异性、定量线性范围、敏感性和重复性进行了评价及初步应用.结果显示,用该方法检测NiV M基因和HP-PRRSV nsp2基因的RNA标准对照(NiV-M-RNA和HP-PRRSV-nsp2-RNA),线性范围分别为4.6×10¹~4.6×10⁷和4.1×10¹~4.1×10⁸拷贝/μL;最低检出限分别为46和4.1拷贝;该方法组内试验和组间试验的变异系数均小于2.0%,显示出良好的可重复性;该方法仅对NiV和HP-PRRSV呈现特异性扩增曲线,不与猪瘟病毒(CSFV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪流感病毒(SIV)、猪细小病毒(PPV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)和猪圆环病毒2型(PCV2)发生交叉反应.用该方法对236份猪实际样品进行NiV和HP-PRRSV核酸检测,所有样本的NiV检测结果均为阴性,8份样本的HP-PRRSV检测结果为阳性.本研究建立的方法为猪实际样本中NiV和HP-PRRSV的鉴别检测提供了一种快速、敏感和特异的技术手段.     

牛诺如病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

牛诺如病毒（BNoV）是国内新发的犊牛腹泻病原,笔者拟建立检测BNoV的Real-time PCR方法。根据BNoV流行株的RNA聚合酶（RdRp）基因序列设计引物,通过优化反应条件和体系,成功建立基于EvaGreen检测BNoV的Real-time PCR方法。该检测方法的Ct值与标准品模板在2.24×10²~2.24×10⁸拷贝·μL^-1线性关系良好,相关系数R²=0.997,扩增效率为98.44%;该方法可特异性检出BNoV,对其他犊牛腹泻相关病原呈阴性;最低检测限为22.4拷贝·μL^-1;批间和批内的变异系数均小于2%,重复性好。对2017年9月-2019年5月采自河南省的221份犊牛腹泻样本中BNoV的检出率为11.31%（25/221）,采样场阳性率为92.86%（13/14）。本试验所建方法灵敏度高、特异性强、稳定性好,为BNoV的检测和流行病学调查提供了有力手段。     

鉴别非洲猪瘟病毒和猪瘟病毒野毒株二重TaqMan MGB实时荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

旨在建立特异、敏感的实时荧光定量PCR（FQ-PCR）方法,用于非洲猪瘟病毒（ASFV）和猪瘟病毒（CSFV）野毒株的快速鉴别检测。针对ASFV的P72基因和CSFV野毒株的5'UTR非编码区序列的保守区域分别设计1对特异性引物和1条探针,经优化反应条件,建立一种基于TaqMan MGB探针技术的FQ-PCR方法,验证方法的敏感性、特异性和稳定性,对50份临床样品进行检测,并与猪瘟国标方法及OIE推荐的非洲猪瘟检测方法进行比较分析。结果显示：建立的鉴别ASFV和CSFV野毒株二重FQ-PCR检测方法在10⁰~10⁶拷贝·μL^-1模板范围内有良好的线性关系;对ASFV和CSFV基因出现阳性扩增信号,但对猪瘟病毒疫苗株、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型、猪细小病毒、猪乙型脑炎病毒、副猪嗜血杆菌等病原对照未出现扩增;批内、批间试验变异系数在1.18%~2.08%,重复性良好;对ASFV和CSFV的最低检测模板浓度均为10拷贝·μL^-1;利用建立的二重FQ-PCR方法对50份临床样品进行检测,检测结果与猪瘟国标方法及OIE推荐的非洲猪瘟检测方法结果完全一致。本研究成功建立了鉴别ASFV和CSFV野毒株二重TaqMan MGB FQ-PCR方法,为ASFV和CSFV野毒株的鉴别诊断提供了快速、敏感、特异且能满足临床检测需求的检测方法。     

检测牛5种腹泻病毒的多重RT-PCR方法的建立及应用

牛A群轮状病毒(BRVA)、牛冠状病毒(BCoV)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、牛诺瓦病毒(BNoV)和牛纽布病毒(BNeV)是引起犊牛腹泻的常见病毒,且临床上多存在混合感染的情况.本试验的目的 是建立可以同时检测上述5种病毒的多重PCR方法.通过设计引物,优化反应体系和条件,成功建立了可同时检测BRVA、BCoV、...     

柱花草叶肉原生质体提取与瞬时表达体系构建

柱花草(Stylosanthes guianensis)是一种重要的热区豆科牧草,为利用原生质体瞬时表达体系开展柱花草基因功能研究,以20 d龄期‘热研5号’柱花草子叶为试验材料,通过正交试验考察不同因素对原生质体分离及转化效率的影响。结果表明：采用1.5%纤维素酶、1.25%离析酶、0.5 mol·L^-1甘露醇和4 mmol·L^-1MES酶解液组合,酶解时间为16 h时,原生质体的产量和活性均达到最佳,分别为(4.567×10⁶)个·g^-1和92.271%;原生质体浓度为(6×10⁵)个·mL^-1、质粒浓度为0.6μg·μL^-1,PEG-4000浓度为50%、转化时间为5 min时,转化效率最高,可达52.524%。构建了目标蛋白SgRKL1表达载体pA7-BIUTNT::SgRKL1-GFP,利用PEG介导法将其转入柱花草原生质体,激光扫描共聚焦显微镜检测结果显示SgRKL1蛋白定位于细胞膜上,说明所建立的柱花草叶肉原生质体瞬时表...     

猪星状病毒4型SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR检测方法的建立

为建立一种快速检测猪星状病毒4型(PAstV4)的SYBR GreenⅠ荧光定量RT-PCR检测方法,根据已知的猪星状病毒4型序列的ORF1a基因设计了特异性引物,并将扩增片段克隆到pMD19-T载体上;将构建的重组质粒作为标准品建立SYBR GreenⅠ荧光定量RT-PCR检测方法,并对建立方法的灵敏性、特异性及重复性进行验证。结果显示,建立的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法最低检测量为50.3拷贝·μL-1,其灵敏度是普通PCR的100倍;与CSFV、PRRSV、PRV、PEDV、PDCoV无交叉反应,特异性较好;建立的标准曲线呈良好的线性关系,相关系数R2=1.00。应用该方法检测了2018-2019年收集的43份临床样品,阳性率为18.6%。本研究为猪星状病毒4型的临床检测建立了一种快速、灵敏、特异性强的方法。     

基于恒温隔绝式荧光RT-PCR技术现场检测牛纽布病毒方法的建立及应用

纽布病毒(nebovirus,NeV)是引起犊牛腹泻的新发病原,本试验旨在建立基于恒温隔绝式RT-PCR(insu-lated isothermal RT-PCR,iiRT-PCR)技术现场检测NeV的方法.根据NeV的RdRp基因的保守区域,设计并合成引物和探针,优化检测体系和检测试剂预混方法,建立检测NeV的iiR...     

Establishment of a Duplex Real-time RT-PCR Assay for the Differential Detection of Nipha Virus and Highly Pathogenic Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus

To establish a rapid,sensitive and specific assay for the differential detection of Nipah virus (NiV) and highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus (HP-PRRSV),a duplex Real-time RT-PCR was developed with specific primers and probes targeting to the special sequences of NiV M gene and HP-PRRSV nsp2 gene by optimization of reaction conditions.The performance of the assay was linear ranging from 4.6×10¹ to 4.6×10⁷ copies/μL for RNA standard control of NiV M (NiV-M-RNA) and from 4.1×10¹ to 4.1×10⁸ copies/μL for RNA standard control of HP-PRRSV nsp2 (HP-PRRSV-nsp2-RNA),and detection limits of the assay was 46 copies for the NiV-M-RNA and 4.1 copies for the HP-PRRSV-nsp2-RNA,respectively.The coefficients of variation (CVs) of both inter-assay and intra-assay repeatability were less than 2.0%,showing good repeatability.The assay was able to specifically detect NiV and HP-PRRSV simultaneously without cross-reaction with classical swine fever virus (CSFV),porcine epidemic diarrhea virus (PEDV),swine influenza virus (SIV),porcine parvovirus (PPV),pseudorabies virus (PRV) and porcine circovirus type 2 (PCV2).Of the 236 samples from pigs for both NiV and HP-PRRSV detection by the established assay,all the samples were negative for NiV,8 samples were HP-PRRSV positive.In conclusion,this assay offers a useful approach for the differential detection of NiV and HP-PRRSV in clinical specimens from the pigs.