全反式维甲酸对转化生长因子β诱导的肾小球系膜细胞Sp1及c-met表达的影响

肝细胞生长因子(HGF)是一种多效性的细胞因子,c-met是HGF现已知的唯一的受体,HGF与c-met结合后,发挥相应的生物学效应[1].Sp1蛋白是众多基因的基本转录因子,能与c-met基因启动子区域的多重GC盒结合,是调节肾脏细胞表达c-met的重要转录因子[2].全反式维甲酸(ATRA)能抑制肾脏纤维化,保护肾功能.本研究探讨ATRA对肾小球系膜细胞Sp1、c-met表达的影响,以进一步了解ATRA对肾脏的保护机制.     

转化生长因子-β1对肾小球系膜细胞TRPC6表达的影响

目的：观察转化生长因子-β1（TGF-β1）对体外培养的大鼠肾小球系膜细胞（GMC）瞬时受体势C6（TRPC6）表达的影响,并探讨糖尿病肾病（DN）的发病机制。方法：GMC予TGF—β1 10ng／ml刺激24h后,间接免疫荧光法检测GMC TRPC6的表达;免疫印迹法观察TRPC6的表达。结果：GMC存在TRPC6的表达,以细胞膜表达为主;TGF-β1刺激GMC可有TRPC6表达下调（P〈0．05）。结论：肾小球系膜细胞存在TRPC6的表达,TGF-β1刺激后TRPC6表达下调;TGF-β1可能通过下调TRPC6参与了DN的发病。     

PCI-neo-肝细胞生长因子对大鼠肾小球系膜细胞增生及转化生长因子β1表达的影响

肾小球系膜细胞(GMC)的过度增生是导致肾小球硬化及肾间质纤维化的重要机制之一[1].肝细胞生长因子(HGF)是一种多效性的细胞因子,其可通过加速细胞外基质降解,阻断小管上皮细胞转分化等实现对肾脏的保护[2-4].目前HGF对正常及增生的GMC是否有抑制作用尚不明确.本研究采用可在体内持续平稳表达的PCI-neo-HGF质粒进行研究[5],主要探讨HGF是否能抑制正常及脂多糖(LPS)刺激后的大鼠GMC的增生,以及这种作用是否与抑制转化生长因子β1(TGF-β1)的表达相关.     

转化生长因子β1对大鼠原代肾小球系膜细胞血管内皮生长因子表达的影响

目的：探讨原代培养的大鼠肾小球系膜细胞血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的表达及转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）对其表达的影响。方法：采用RT-PCR和Westernblot方法检测大鼠原代培养的肾小球系膜细胞VEGF表达及不同浓度、不同时间的TGF-β1刺激对VEGF表达的作用。结果：原代培养的大鼠肾小球系膜细胞表达VEGF164、120mRNA，TGF-β1呈时间依赖性增加其表达，在12h表达最高，分别为刺激前3．17、2．925倍，有统计学差异（P〈0．001）。在剂量反应曲线上，2ng／ml TGF-β1刺激作用最强，VEGF164、120mRNA表达分别为未刺激组的2．82、2．45倍，有统计学差异（P〈0．001）。与VEGF mRNA表达一致，大鼠原代肾小球系膜细胞仅见VEGF164蛋白表达，2ng／ml TGF-β1呈时间依赖性的增加VEGF 164蛋白表达，24h达高峰，为刺激前的2．37倍。结论：促进肾小球系膜细胞VEGF表达可能是TGF-β1介导肾脏损害发生、发展的机制之一。     

己酮可可碱对高糖诱导肾小球系膜细胞结缔组织生长因子表达信号通路的影响

目的 探讨高糖诱导大鼠肾小球系膜细胞结缔组织生长因子（CTGF）表达的变化及其作用通路,并且研究己酮可可碱（PTX）对CTGF表达的影响。 方法 体外培养大鼠系膜细胞,观察不同浓度的高糖在不同时间对系膜细胞转化生长因子β（TGF-β）、CTGF、 p-Smad2/3、Smad7及纤连蛋白（FN）表达的影响;并在高糖培养液中加入TGF-β中和抗体及不同浓度的PTX观察其对上述各指标表达的影响。 结果 高糖可以诱导系膜细胞TGF-β、CTGF mRNA及蛋白表达增加（均P < 0.05）,且呈时间、剂量依赖性,同时伴有p-Smad2/3蛋白表达的增加及Smad7蛋白表达的减少。阻断TGF-β可使高糖诱导的CTGF mRNA及蛋白表达分别下降86.4%及91.8%（均P < 0.05）。PTX可以抑制高糖诱导的系膜细胞CTGF mRNA及蛋白表达,随着PTX浓度的增加其抑制作用更为显著（P < 0.05）,但对于TGF-β的表达没有影响。结论 高糖可通过TGF-β-Smads通路使CTGF mRNA表达增加进而影响其蛋白表达。PTX可以有效的抑制CTGF的表达而对于TGF-β的表达没有直接的抑制作用。     

细胞外信号调节激酶信号通路与醛糖还原酶对转化生长因子β1诱导人系膜细胞纤连蛋白表达的影响

目的　探讨细胞外信号调节激酶（ERK）信号通路与醛糖还原酶（AR）在非高糖条件下对转化生长因子（TGF）β1诱导人系膜细胞（HMC）细胞外基质成分纤连蛋白（FN）表达的影响。 方法　应用醛糖还原酶抑制剂（ARI）、ERK信号通路抑制剂U0126、转染pCDNA3-AR及AR-siRNA分别作用于HMC后,再用TGF-β1刺激,观察刺激前后HMC表达FN的情况。Western印迹检测HMC内FN和AR的变化,实时定量PCR鉴定转染和干扰效果。 结果 HMC在TGF-β1作用后,AR、FN 和磷酸化ERK（p-ERK）蛋白表达升高,与对照组比较,分别升高了1.8、1.9倍（均P < 0.05）和5.1倍（P < 0.01）。使用ARI孵育后,再用TGF-β1刺激,与单独使用TGF-β1刺激组比较,FN蛋白表达量约为对照组的30%（P < 0.01）;用ERK信号通路抑制剂后,再用TGF-β1刺激,FN蛋白表达量约为对照组的10%（P < 0.01）;转染pCDNA3-AR后,HMC中AR mRNA表达增多,为对照组10倍以上（P < 0.01）,FN蛋白表达增加到对照组的2.5倍（P < 0.05）,再用TGF-β1刺激,FN蛋白表达增加到对照组的3.6倍（P < 0.05）;转染AR-siRNA后,HMC中AR mRNA表达减少,干扰效率大于80%（P < 0.01）,AR、FN及p-ERK蛋白表达减少,分别约为对照组的20%、24%、7%（均P < 0.01）,再用TGF-β1刺激,FN蛋白表达仍然减少,为对照组的25%（P < 0.01）。 结论　AR基因参与TGF-β1诱导的HMC细胞外基质表达过程的调控,在肾小球硬化过程中起一定作用,且这一过程与ERK信号通路的活化有关。     

转化生长因子-β对人肾小球系膜细胞结缔组织生长因子及细胞外基质成分表达的影响

目的:探讨转化生长因子-β(TGF-β)对人肾小球系膜细胞(HMCs)结缔组织生长因子(CTGF)及细胞外基质(ECM)成分表达的影响.方法:应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白印迹技术,观察不同时间TGF-β1对HMCs CTGF mRNA及其蛋白质表达的影响,同时观察对Ⅰ型胶原、Ⅳ型胶原和纤维结合蛋白(FN)mRNA表达的影响.结果:在正常培养情况下,HMCs有CTGF mRNA及其蛋白质的表达.HMCs在TGF-β1刺激后,CTGFmRNA表达明显增加,6 h达到高峰,可持续增高到24 h;CTGF蛋白表达12 h达到高峰,可持续增高至24 h.Ⅰ型胶原、Ⅳ型胶原mRNA表达逐渐增加,24 h明显增加并达到高峰.FN mRNA12 h达到高峰,24 h后开始回落.结论:HMCs可表达CTGF.TGF-β可诱导体外培养的HMCsCTGF及ECM成分高表达.     

转化生长因子β1及Smad信号转导通路在肾小球硬化中的作用

目的探讨转化生长因子β1(TGF—β1)及其信号转导分子Smad2、Smad3、细胞外基质(ECM)在肾小球硬化过程中的表达及其意义。方法以20例正常肾组织为对照组,对38例各种不同组织学类型的肾活检标本,用免疫组织化学染色方法观察TGF—β1、Smad2、Smad3、纤连蛋白(FN)在肾小球中的染色强度,并对检测结果作图像分析处理。以体外培养的人系膜细胞为对象,观察TGF-β1对系膜细胞表达Smad2、Smad3、FN的影响。Smad2、Smad3、FN的基因表达采用RT—PCR检测;Smad2、Smad3、FN的蛋白表达采用Western印迹检测。结果所有增生、硬化病理类型肾小球肾炎中病变肾小球TGF—β1、Smad2、Smad3、FN蛋白表达均显著高于对照组(P<0.05),且TGF—β1、Smad2、Smad3在肾小球中的表达与FN在肾小球中的蓄积呈显著正相关(P<0.05)。外源性TGF—β1刺激人肾系膜细胞后,系膜细胞Smad3mRNA和蛋白表达显著增高(P<0.05);Smad2mRNA和蛋白表达无明显改变(P>0.05);FNmRNA和蛋白表达显著增高(P<0.05)。结论TGF—β1及其信号转导分子Smad蛋白可能参与了ECM在病变肾小球中的过量蓄积,从而在肾小球硬化过程中起重要作用。     

螺内酯对大鼠肾小球系膜细胞氧化应激及转化生长因子β1表达的影响

螺内酯(SPI)是非选择性醛固酮(ALD)受体拮抗剂,一直作为保钾利尿剂应用于临床.研究发现螺内酯尚具有抗炎、抗纤维化及减少尿白蛋白等降压外作用[1],但确切机制尚不十分明确.肾小球系膜细胞(MC)产生的活性氧(ROS)及分泌的转化生长因子β1(TGF-β1)在糖尿病肾小球硬化的发生、发展中起着重要作用[2].本实验探讨SPI的肾保护作用及机制,为临床应用SPI治疗DN提供依据.     

全反式维甲酸对环孢素诱导的肾小球系膜细胞增殖与凋亡的影响及其机制

目的  探讨全反式维甲酸（ATRA）对环孢素（CsA）诱导的大鼠肾小球系膜细胞增殖及凋亡的影响及机制。方法  采用不同剂量ATRA作用于不同剂量CsA诱导下的肾小球系膜细胞。采用MTT比色法检测细胞增殖,Hoechst 33258荧光染色观察细胞凋亡形态,后用流式细胞仪检测细胞凋亡率,免疫荧光法检测线粒体促凋亡的Smac蛋白的表达。结果  与对照组比较,CsA剂量为0.5 μg/mL及以上可抑制细胞増殖,CsA剂量为1.0 μg/mL及以上可诱导细胞凋亡,且Smac蛋白的表达随CsA剂量的增加而增加,具有剂量和时间依赖的特征（均为P＜0.05）。而与CsA组比较,CsA+ATRA处理组对细胞增殖的抑制作用更为明显,而加入ATRA可呈剂量依赖性抑制CsA诱导的肾小球系膜细胞凋亡及Smac蛋白的表达（均为P＜0.05）。结论  CsA可抑制肾小球系膜细胞增殖,诱导其凋亡并刺激Smac蛋白的表达。ATRA可以抑制CsA诱导的肾小球系膜细胞凋亡,且可能是通过Smac信号通路介导的。     

内皮素对肾小球系膜细胞转化生长因子基因表达的影响

观察肾小球系膜细胞（ＭＣ）的转化生长因子（ＴＧＦ－β）的基因表达，以及内皮素（ＥＴ）对ＴＧＦ－β基因表达的影响。方法应用逆转录聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）及半定量ＲＴ－ＰＣＲ方法对体外培养的大鼠ＭＣ进行了ＴＧＦ－β基因表达的定量检测。结果ＭＣ有ＴＧＦ－β的基因表达，并且ＥＴ对ＴＧＦ－β的基因表达有上调作用。结论ＴＧＦ－β是ＭＣ的又一个自分泌因子，ＥＴ和ＴＧＦ－β可能有协同作用而引起ＭＣ增生和系膜基质（ＭＭ）的增多，在肾小球肾炎和肾小球硬化的病理过程中，具有一定意义     

血管紧张素Ⅱ通过JNK-c-Jun/AP-1信号通路调控系膜细胞转化生长因子β1表达

目的 探讨c-Jun氨基末端激酶(JNK)-c—Jun／活化蛋白(AP)-1信号转导通路在血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导的肾小球系膜(MC)细胞转化生长因子β1(TGF—β1)表达中的调控作用。方法 应用核酸酶保护法检测系膜细胞TGF—β1mRNA表达。应用凝胶电泳迁移率(EMSA)、超迁移实验和非放射性激酶活性检测法检测系膜细胞内AP—1活化、AP-1的组成及JNK活性。应用ELISA法检测培养上清中纤连蛋白(FN)。结果 AngⅡ可诱导MC内JNK活化，刺激30min后，JNK活性达到高峰，1h后几乎恢复至正常水平。AngⅡ刺激后MC内AP-1活性显著增强，活化的AP-1主要含有c-Jun和c—Fos亚基。AngⅡ可促进MC表达TGF—βl及分泌FN，抗TGF—β1抗体显著抑制AngⅡ促进的FN分泌。JNK特异性抑制剂SP600125显著抑制AngⅡ诱导AP-1活化、TGF—β1表达及FN分泌。结论 AngⅡ-JNK—c-Jun／AP-1-TGF—β1-FN信号转导通路在肾小球硬化中发挥一定作用，SP600125能部分抑制AngⅡ诱导的AP-1活化、TGF—β1表达及FN的合成，可能具有一定的治疗作用。     

HB-EGF对系膜细胞增殖及转化生长因子-β1表达的影响

目的：观察肝素结合性表皮生长因子样生长因子（HB-EGF）对肾小球系膜细胞（GMC）增殖及转化生长因子-β1（TGF-β1）表达的作用。方法：以原代培养大鼠肾小球系膜细胞为细胞模型,采用MTT、ELISA、RT-PCR等方法观察外源性HB-EGF对系膜细胞增殖及TGF-β1表达的影响。结果：（1）不同浓度HB-EGF对系膜细胞增殖有不同影响,10ng/ml时无刺激GMC增殖作用（P〉0.05）,100、1000ng/ml均能刺激GMC增殖（P〈0.01）,100ng/ml作用最明显。（2）HB-EGF（10ng/ml、100ng/ml、1000ng/ml）能刺激系膜细胞TGF-β1的表达（P〈0.01）,100ng/ml时作用最强。（3）100ng/mlHB-EGF刺激GMC24h、36h、48h,系膜细胞TGF-β1的表达均增加,随作用时间而变化,刺激36h和48h比24h作用更明显（P〈0.05）。结论：一定浓度范围内HB-EGF刺激GMC增殖,促进系膜细胞TGF-β1的表达,且具有一定的时间及浓度依赖性。     

肾小球系膜细胞金属蛋白酶1组织抑制剂对血管内皮生长因子及转化生长因子β1表达的影响

目的:探讨高糖(葡萄糖25mmol/L)条件下大鼠肾小球系膜细胞(RMC)金属蛋白酶1组织抑制剂(TIMP-1)对血管内皮生长因子(VEGF)及转化生长因子β1(TGF-β1)表达的影响。方法:用高糖培养基体外培养未转染及分别用pcDNA3空载体、人反义TIMP-1基因重组真核表达载体转染的RMC24h,将细胞分为未转染组、空载体组及反义组,并设正常培养条件下的RMC作为正常对照组。RT-PCR检测各组RMC TIMP-1、VEGF及TGF-β1mRNA的表达。Western印迹检测胞质中TIMP-1、VEGF及TGF-β1蛋白的表达。免疫荧光检测各组RMC胞质中VEGF的表达。结果:高糖培养条件下未转染组及空载体组RMC大鼠TIMP-1、VEGF及TGF-β1mRNA表达均较对照组明显增加(P<0.01),而此两组间相应指标表达差异无统计学意义;反义组大鼠TIMP-1、VEGF mRNA表达较未转染组显著降低(P<0.01),而TGF-β1 mRNA表达则无变化。Western印迹也得到相同的结果。免疫荧光检测发现,未转染组及空载体组VEGF荧光表达较对照组显著增强,反义组荧光则较未转染组明显减弱。结论:高糖可促进RMC TIMP-1、VEGF及TGF-β1表达增加。在高糖条件下,TIMP-1可能位于VEGF上游,促进其表达;而TGF-β1表达并不受TIMP-1调控,高糖可能通过其他途径上调其表达。     

转化生长因子β1反义RNA对肾小球系膜细胞基质合成及分泌的影响

目的：观察转化生长因子beta1(TGF-β1）反义RNA对系膜细胞基质合成的影响。方法：构建含TGF－β1反义RNA的重组腺病毒，将重组腺病毒转染系膜细胞，用Northern blot检测转染系膜细胞TGF－β1及ColIV mRNA的含量，用免疫组化半定量分析转染的系膜细胞中TGF－β1，纤连蛋白（FN）及胶原（Col)IV蛋白水平，并与无转染的系膜细胞对照组比较其表达的变化。结果：构建了含TGF－β1反义RNA的重组腺病，重组反义TGF－β1腺病毒转染系膜细胞后，与对照组相比，在第24hTGF-β1及Col IV的mRNA无明显抑制，在48hTGF－β1及Col IV mRNA抑制率分别为22．5％，18．2％，72h TGF-β1及Col IV mRNA抑制率分别为29．5％，27．3％，免疫组织化学半定时结果显示；与对照组相比，在48h始转系膜细胞TGF－β1，FN及ColIV蛋白含量开始下降，48h TGF-β1，FN及Col IV蛋白抑制率分别为16．5％，18．2％及14．6％，72h TGF－β1，FN及ColⅣ蛋白抑制率分别为23．5％，27．3％，26．8％。结论：重组反义TGF－β1可抑制系膜细胞合成细胞外基质，在肾小球肾炎及肾小球硬化的研究及治疗中有潜在的应用价值。     

转化生长因子β1对系膜细胞纤溶酶原激活物抑制物1表达的影响

目的观察转化生长因子(TGF)β1对肾小球系膜细胞(GMC)纤溶酶原激活物抑制物(PAI)-1表达的影响,并探讨反应性氧基(ROS)在TGF-β1诱导的PAI-1表达中的作用。方法体外培养大鼠GMC,分别用TGF-β1(2ng/ml)和葡萄糖氧化酶(GO)(10mU/ml)刺激,并用BSO和抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)进行干预处理。采用Western印迹检测PAI-1蛋白表达;RT-PCR和Northern杂交检测PAI-1mRNA表达;合成的荧光素纤溶酶底物测定纤溶酶活性。结果外源性TGF-β1和GO可显著上调大鼠系膜细胞PAI-1蛋白和mRNA的表达并降低纤溶酶活性。BSO可显著增强TGF-β1和GO诱导的系膜细胞PAI-1mRNA的表达;而NAC可显著地逆转由TGF-β1和GO诱导的PAI-1mRNA表达的上调作用。结论TGF-β1可显著上调系膜细胞PAI-1的表达并抑制纤溶酶活性。ROS在TGF-β1诱导的系膜细胞PAI-1表达上调的信号传递途径中可能起了信号传递分子的作用。     

转化生长因子β1诱导的系膜细胞纤维蛋白溶酶系统变化及其机制

目的研究转化生长因子(TGF)-β1对大鼠系膜细胞纤维蛋白溶酶(纤溶酶)系统的影响,并探讨反应性氧基(ROS)的作用。方法以体外培养的大鼠系膜细胞为对象,采用TGF-β1刺激12h,部分实验中培养的细胞在刺激前应用DL-buthionine-(S,R)-sulfoximine(BSO)预处理24h,或应用抗氧化剂N-acetylcysteine(NAC)预处理1h。应用荧光素法测定细胞ROS含量。系膜细胞tPA、uPA和PAI-1mRNA的表达采用RT-PCR测定。PAI-1蛋白表达应用ELISA检测。应用合成的荧光素酶底物及荧光扫描法分别测定纤溶酶、uPA、tPA活性。结果TGF-β1可显著增加细胞ROS含量。2ng/mlTGF-β1可显著上调PAI-1mRNA和蛋白的表达,分别为1.9倍(P<0.01)和1.5倍(P<0.05)。tPAmRNA的表达不受影响但uPAmRNA的表达较对照组下调52%(P<0.01)。TGF-β1可抑制纤溶酶和uPA活性,分别为30%(P<0.01)和23%(P<0.05),但对tPA的活性无显著影响。在BSO预处理组,TGF-β1对uPA、PAI-1mRNA表达和蛋白释放的影响得到显著增强;而NAC预处理可明显逆转由TGF-β1诱导的uPA、PAI-1mRNA表达的上调和蛋白表达增加以及活性的改变。结论TGF-β1可促使细胞ROS产生增加。ROS介导了由TGF-β1诱导的系膜细胞PAI-1mRNA和蛋白表达的上调以及uPAmRNA表达的下调和uPA、纤溶酶活性的下降。TGF-β1对系膜细     

高糖状态下JAK2-STAT3通路的活化对系膜细胞转化生长因子β1、纤连蛋白表达的影响

JAK-STAT通路是近年发现的一组信号转导通路,能介导多种细胞因子和生长因子的细胞内信号转导过程.有研究提示JAK2-STAT3通路可能与系膜细胞的增殖、肥大及细胞外基质分泌有关[1].本研究旨在探讨高糖培养下大鼠肾小球系膜细胞JAK2-STAT3信号转导通路的活性变化及用AG-490(tyrphostin B42,JAK-STAT通路特异性阻断剂)抑制此通路活化对大鼠肾小球系膜细胞转化生长因子β1(TGF-β1)、纤连蛋白(FN)表达的影响,为进一步探讨JAK-STAT信号转导通路与糖尿病肾病发病机制的关系提供新的思路.     

醛固酮通过Smad2依赖的转化生长因子-β1途径刺激大鼠系膜细胞纤连蛋白合成

目的探讨醛固酮是否能够诱导纤连蛋白(FN)的合成,及可能的信号通路是否通过其核受体由Smad2依赖的TGF-β1途径介导。方法大鼠系膜细胞体外培养。Smad2的反义质粒由Smad2MH2功能区片段与表达绿色荧光蛋白的pEGF-C1真核质粒构建而成,运用脂质体的方法转染系膜细胞,由荧光显微镜观察细胞是否转染成功。分别用醛固酮(10-7mol/L)伴或不伴安体舒通(10-9mol/L)刺激系膜细胞,48h后收集培养上清液和各组细胞蛋白。FN、TGF-β1和Smad2的表达分别用ELISA和Western印迹的方法检测。结果醛固酮可以刺激大鼠系膜细胞TGF-β1表达升高[(134.2±13.9)%比对照组100%,P<0.05],FN合成增加[(74.2+15.0)比对照组(12.6+1.8)ng/ml,P<0.01]。先用安体舒通干预3h再加用醛固酮,则TGF-β1及FN的水平无显著变化。转染了Smad2的反义质村,醛固酮对FN的合成无显著影响,培养液中FN的浓度明显低于醛固酮刺激的未转染质粒组[(36.1±19.8)比未转染质粒组(72.3+16.6)ng/ml,P<0.05]。转染Smad2反义质粒的系膜细胞,其Smad2蛋白表达明显低于基础值[(69.1±8.6)%比基础值100%,P<0.01];而空载体pEGF-C1并不影响Smad2的表达。结论醛固酮通过核受体由Smad2依赖的TGF-β1途径诱导大鼠系膜细胞FN合成。该实验结果为临床上于预慢性肾脏病进展开辟了新的     

基因干扰对人肾小球系膜细胞megsin基因表达及α平滑肌肌动蛋白和转化生长因子β1生成的影响

megsin,即SERPINB7,是丝氨酸蛋白酶抑制剂进化单位B的第7位成员[1],为近年发现的特异性表达于肾脏的基因.