Fas配体基因逆转录病毒途径转染骨髓CD_(34)~+细胞

目的　借助逆转录病毒途径 ,FasL基因转染骨髓CD34+3 4 细胞。方法　将人FasLcDNA顺向插入逆转录病毒载体质粒PLXSN ;PLXSN -hFasL质粒脂质体转染PA317包装细胞 ;G418筛选抗生克隆 ;PCR鉴定整合细胞 ;扩增 ;制毒 :病毒滴度测定。试剂盒分选骨髓CD34+3 4 细胞 ;流式细胞仪分析其纯度 ;体外扩增培养 (IL -3+IL -6 +SCF) ;病毒上清转染CD34+3 4 细胞 ;流式细胞仪检测FasL阳性细胞率。结果　成功构建PLXSN -hFasL质粒 ;PA317细胞进行包装后所获假性病毒上清滴度为 1.7× 10 5CFU/ml ;对 11份正常人或良性贫血患者髓血进行CD34+3 4 细胞分选 ,所得CD34+3 4 细胞数为 1.35± 0 .45× 10 5,纯度为 85 %～ 97% ;体外扩增培养 10～ 12d ,细胞数达到 2 .5± 0 .7× 10 6(扩增约 18.5倍 ) ;病毒上清转染后 48～ 72h ,流式细胞仪检测 2 4.2± 2 .4%CD34+3 4 细胞表达FasL(P <0 .0 1) (未转染的CD34+3 4 细胞FasL阳性率为 7.6± 1.1% )。结论　通过逆转录病毒途径 ,FasL基因可有效转染骨髓CD34+3 4 细胞     

脐血细胞生物学特性的研究

目的 :研究单份脐血造血干 /祖细胞 (HSC/ HPC)的质和量 ,脐血中的干细胞、免疫细胞的表型特征。方法 :收集 2 0份脐血 ,采用 6 %的羟乙基淀粉沉淀去除红细胞 (RBC) ,利用甲基纤维素半固体培养法培养和观察 HSC/ HPC的集落生成情况 ,以了解增殖能力 ,用流式细胞仪检测脐血 CD34 + CD38- 、CD34 + 、CD34 + CD38+ 细胞量及免疫细胞的表型特性。结果 :2 0份脐血采集量在 4 0 m L～ 16 5 m L 之间 ,均数为 (78± 2 3) m L。每次收集的有核细胞 (NC)数在 4 .8×10 8～ 4 .6× 10 9之间 ,均数为 (1.4 3± 0 .96 )× 10 9,NC的回收率为 86 .6 %。脐血中 CD34 + CD35-细胞数占 NC总数的 (0 .10 2± 0 .0 70 ) % ,平均为 (0 .12 0± 0 .0 90 )× 10 7/份 ,CD34 + 细胞占 NC总数的 (1.2 9± 0 .31) % ,平均为 (1.4 2± 0 .92 )×10 7个 /份 ,CFU- GM为 (2 .5 4± 2 .0 2 )× 10 6个 ,BFU- E为 (1.4 1± 1.39)× 10 6个 ,CFU- GEMM(1.6 0± 2 .30 )× 10 5个 ,CD4 + T细胞表达 CD4 5RA为 (89.95± 7.86 ) % ,CD8+ T细胞表达 CD4 5RA为 (99.5 8± 3.4 6 ) % ,均显著高于成人外周血 T淋巴细胞 (P<0 .0 1) ,结论 :单份脐血的 HSC/ HPC含量可以满足体重较轻的 (<5 0 kg成人和儿童患者移植的需要 ,体重 ) ,5 0 kg以上的     

骨髓间充质干细胞对造血干细胞"干性"的保持作用

目的 探讨骨髓间充质干细胞(MSCs)对造血干细胞(HSCs)"干性"的保持作用及其机制.方法 免疫磁珠分离纯化脐血HSCs-CD34+细胞,并分组培养:A组,CD34+细胞单独培养;B组,加细胞因子;C组,加细胞因子和MSCs(直接接触);D组,加细胞因子和MSCs(不接触);E组,加MSCs(直接接触);F组,加Mscs(不接触).0、7、14 d分别计扩增倍数、单位细胞数形成集落能力、CD34+比率,计数7 d时各组CD34+、CD34+CD38-比率.结果 随着时间延长扩增倍数增加(尤其B组),形成集落的能力和CD34+细胞比率渐下降,但E、F组下降不明显.结论 以MSCs为滋养层,对HSCs扩增作用不明显,但可更好地保持HSCs的"干性";这种保持"干性"的作用依赖于细胞与细胞间的相互黏附作用.     

多抗甲素对脐血树突状细胞体外扩增、成熟的影响

目的观察多抗甲素(polyactin A,PA)对脐血树突状细胞(dendritic cell,DC)体外扩增、成熟的影响。方法分别用加有PA、GM-CSF+TNF-α+IL-4(GTI)及GTI+PA(GTIP)的RPMI-1640培养液体外诱导培养脐血单核细胞,培养d7,Elivision免疫组化方法检测各组细胞CD1a、CD83、HLA-DR、CD34抗原表达情况,透射电镜观察细胞形态。结果PA组、GTI组及GTIP组均有一定数量的典型DC,电镜观察该细胞表面有大量粗细不等的树枝状突起;PA组CD1a+、CD83+细胞比例分别达19·63%±3·61%、14·52%±5·79%,高于对照组(即单纯培养液组);GTIP组CD1a+细胞比例升高最明显,高于GTI组。结论PA不仅能促进脐血DC体外扩增、成熟,还能协同GM-CSF、TNF-α、IL-4促进DC生成,PA是一种实用的DC活化剂。     

转HOXB4基因人骨髓MSC促进脐血CD34~+细胞体外扩增

目的 研究转HOXB4基因的人骨髓间充质干细胞(MSC)对脐血CD34~+细胞体外扩增的支持作用.方法 用病毒载体质粒转染包装细胞293T,收获病毒上清(VCM)感染MSC后,用潮霉素筛选获得转HOXB4的MSC(MSC-HOX).分别将MSC(对照组)与MSC-HOX细胞(实验组)作为CD34~+细胞体外扩增的饲养层细胞,结合细胞因子Fh3/Flk3配体(FL)、促血小板生成素(TPO)、干细胞因子(SCF)和粒细胞-集落生长因子(G-CSF)体外扩增脐血CD34~+细胞10 d,收集所有脐血细胞,检测细胞总数、CD34~+细胞总数,集落细胞形成单位(CFU)数.结果 生产重组逆转录病毒可有效将HOXB4基因转入靶细胞内并表达.脐血CD34~+细胞经体外扩增10 d后,细胞总数和CFU数两组间差异无统计学意义(P>0.05),脐血CD34~+细胞总数和比例高于对照组(P<0.05).结论 转HOXB4基因的人骨髓MSC在脐血CD34~+细胞体外扩增中,可保持CD34~+细胞未分化状态,有潜在的应用价值.     

粒细胞集落刺激因子动员的外周血干细胞悬液诱导培养树突状细胞的研究

目的　研究粒细胞集落刺激因子 (G CSF)动员的外周血干细胞 (PBSC)悬液中单核细胞和造血干/祖细胞分别诱导培养的树突状细胞 (DC)的特性 ,探讨临床应用PBSC悬液诱导DC的前景。方法　健康供者经G CSF动员后采集PBSC ,分两种方法诱导培养树突状细胞 :①贴壁细胞 (单核细胞 )经粒—单核细胞集落刺激因子 (GM CSF) +白细胞介素 4 (IL 4 )培养 2周 ,培养结束前 4 8、2 4h分别加入肿瘤坏死因子 (TNF α)、布雷菲德菌素 (brefeldinA ,BFA ) ;②非贴壁细胞 (含CD34+细胞 ) ,加入Flt3Ligand(FL) +干细胞因子 (SCF) +GM CSF +IL 4培养 1周 ,再按前一种方法继续培养 2周。培养结束后 ,流式细胞仪分析细胞表型和胞质 (c)IL 10 +(PE标记 )、cIL 12 (P4 0 ) +(TC标记 )细胞。结果　新鲜标本含CD14 +细胞 ( 18 4± 8 6 ) % ,CD34+细胞 ( 0 9± 0 4 ) %。以PBSC悬液中的 2× 10 6单个核细胞为起始细胞 ,前一种培养方法获得 ( 1 6± 0 6 )× 10 5细胞 ,细胞表型 :CD11c+( 97 3± 5 2 ) % ,CD86 +( 88 2± 6 8) % ,CD83+( 5 9 6± 8 4 ) % ,HLA DR+( 96 5± 7 1) % ,CD1a+( 36 6±7 5 ) % ,cIL 12 (P4 0 ) +( 15 9± 5 1) % ,cIL 10 +( 1 2± 0 4 ) % ;后一种培养方法获得 ( 1 2± 0 4 )× 10 6细胞 ,细胞表型     

人骨髓间充质干细胞联合细胞因子的无血清培养体系体外扩增脐血干细胞研究

目的 探讨以人骨髓间充质干细胞(BM-MSC)为基质的无血清培养方法，体外扩增脐血造血干细胞(CBSC)，研究BM-MSC支持造血的功能和体外扩增时间的选择。方法 用含血小板生成素(TPO)、干细胞因子(SCF)、flt3／flk2配体(FL)和粒细胞-集落刺激因子(G-CSF)的无血清培养液，以人BM-MSC为基质，比较体外扩增脐血CD34^ 细胞7d及14d后总细胞(TC)、CD34^ 细胞和集落形成单位(CFU)数增加倍数。结果在以人BM-MSC为基质及TPO、FL、SCF和G-CSF这四种细胞因子作用下，经体外扩增7d后TC、CD34^ 细胞、CFU-GM和CFU-C数较起始分别增加了87、16、15和26倍；14d后较起始分别增加了427、38、125和104倍，与7d扩增倍数有显著性差异。结论以人BM-MSC为基质的无血清体外培养体系可以有效扩增CBSC，有潜在的临床应用价值，扩增时间应以14d为宜。     

六种重组细胞因子对人骨髓造血细胞的体外扩增效应

目的 :观察造血生长因子对骨髓CD34 +细胞的扩增效应及扩增细胞的分化特性。方法 :采用重组人白细胞介素 (rhIL) 1 +rhIL 3+rhIL6 +重组人粒细胞集落刺激因子 +重组人粒 巨噬细胞集落刺激因子和重组人干细胞因子对人骨髓单个核细胞 (MNC)进行刺激 ,动态观察了经上述细胞因子作用后MNC的增殖效应及液态扩增培养后粒 巨噬集落形成率 (CFU GM ) ,利用流式细胞技术 (FACS)分析了扩增前后CD34 +细胞及其亚群的动态变化。结果 :经上述 6种细胞因子作用 2 4d ,骨髓MNC总数是原代MNC的 38.33倍 ,液态扩增 1 0d后 ,CFU GM的数量达高峰 ,是原代MNC的 1 9.0 4倍 ,2 4d时CFU GM总数降至 3.94倍 ,且集落明显小于扩增初期。扩增至 6～ 1 0d ,CD34 +细胞总数是原代MNC的 1 36 .40～ 90 .40倍 ,1 9d时降为 6 1 .40倍。结论 :外源性造血生长因子对CD34 +骨髓细胞具有较强的扩增效应 ,选择适宜的扩增时间是保证骨髓移植后尽快重建造血功能的重要环节。     

造血移植物中CD3~+CD8~(low)和CD3~+CD4~-CD8~(low)细胞亚群的检测及分析

目的检测造血移植物(正常人骨髓、脐血及动员后外周血)中CD3+CD8low和CD3+CD4-CD8low细胞亚群,探讨其促进造血干/祖细胞植入异基因骨髓的功能,以期拓宽脐血移植的应用范围。方法直接三色免疫荧光标记流式细胞术检测。结果CD3+CD8low和CD3+CD4-CD8low细胞亚群占CD3+细胞亚群的比例在骨髓中最高,为(8.61±1.40)%,动员后外周血次之,为(5.11±0.76)%,脐血最低,为(3.31±0.88)%(P<0.01);"初始"T(CD45RA+CD45RO-)细胞亚群占CD8low细胞亚群的比例为脐血(94.26±2.46),骨髓(58.68±7.57),动员后外周血(73.21±3.60),"初始"T占CD8high细胞亚群的比例为脐血(82.63±3.16),骨髓(38.69±3.24),动员后外周血(51.58±4.23),各移植物中"初始"T细胞亚群占CD8low细胞亚群的比例均高于其占CD8high细胞亚群的比例(P<0.01),CD8low细胞亚群中"初始"T与"记忆"T(CD45RA-CD45RO+)细胞亚群的比例均高于二者在CD8high细胞亚群的比例。结论脐血CD8low和CD8lowCD4-细胞占CD3+细胞的比例明显低于骨髓,可能是脐血移植植入延迟的原因之一;"初始T与"记忆"T细胞亚群的比例增高,可能与CD3+CD8low细胞亚群维持和诱导免疫耐受,不引起移植物抗宿主病有关。     

生长抑素对人脐血CD34^＋细胞增殖能力的影响

目的探索生长抑素（SST）对造血干／祖细胞增殖能力的影响以及可能机制。方法采用免疫磁殊分选技术纯化人脐血CD34^＋细胞;SST孵育人CD34^＋细胞后,体外集落形成、扩增培养了解细胞增殖;ELISA测定细胞内外TNF-α、TGF-β水平;RT—PCR分析其受体亚型。结果在1&#215;10^-6～1&#215;10^-10mol／L浓度范围内,SST抑制人CD34^＋细胞集落形成及扩增倍数,其细胞集落形成抑制与SST浓度呈正相关（r=0．903,P〈0．01）。SST使CD34^＋细胞内、外TNF-α及TGF-β1浓度显著增加（P〈0．05）;人脐血CD34^＋细胞表达SST-3型受体。结论SST通过人脐血CD34^＋细胞上SST-3型受体介导,提高造血抑制因子TNF-α、TGF-β水平,抑制人CD34^＋细胞的增殖、维持其干细胞特性。     

Optimizing donor selection in order to establish a cord blood banking facility: maternal and obstetric factors impact

In this study, we analyzed the obstetric factors affecting total nucleated cells (TNC) content of cord blood units to establish the criteria for umbilical cord blood (UCB) donor selection in our geographic area. UCB was collected from normal uncomplicated pregnancies. In every case, following data were recorded: (1) gestation length; (2) type of delivery (cesarean or vaginal); and (3) newborn characteristics: weight and sex. For each sample, TNC content, percentage and number of CD34+ cells, and viability were analyzed. The results showed that TNC content increases with cord blood volume, gestational length and newborn weight. The mean blood volume and the mean TNC per unit were 42.37 ± 13.5 ml and 55.49 ± 19.4 × 10⁷, respectively. Stepwise regression analysis revealed a positive and significant correlation (r= 0.89) between these two variables. Meanwhile the CD34+ cell content remains unchanged in deliveries at 32–40 weeks of gestation. The mean CD34+ percentage obtained was 0.37 ± 0.06, and the total number of CD34+ cells was 4.827 ± 0.8204 × 10⁴ / mL UCB. Concluding, the maternal and obstetric factors have a significant impact on UCB cell quantity and quality. The main criteria for UCB collection and storage resulted to be: a gestational age higher than 36–40 weeks and newborn weight > 3200g; gestation number ≤ 2 and placental weight > 700g can be added to the standard criteria to improve the bank efficiency. Our results have also become helpful in evaluating stored UCB units to establish the adequacy for clinical transplant utilization.     

Effects of encapsulated rabbit mesenchymal stem cells on ex vivo expansion of human umbilical cord blood hematopoietic stem/progenitor cells

The expansion of umbilical cord blood mononuclear cells (UCB MNCs) was investigated in a novel co-culture system by means of encapsulation of rabbit bone marrow (BM) mesenchymal stem cells (MSCs) in alginate beads (Alg beads). Three kinds of media were applied and the experiments lasted for 7 days. The total nucleated cell density was measured every 24 h. Flow cytometric assay for CD34⁺ cells and methylcellulose colony assays were carried out at 0, 72 and 168 h. It was found that the encapsulated MSCs illustrated remarkable effects on UCB MNCs expansion regardless of whether serum is present in culture media or not. At the end of 168 h co-culture, the total nucleated cell number was multiplied by 15 ± 2.9 times, and CD34⁺ cells 5.3 ± 0.3 times and colony-forming units in culture (CFU-Cs) 5.6 ± 1.2 times in the serum-free media supplemented with conventional dose of cytokines, which was very similar to the results in the containing 20% serum media. While in the control, i.e. MNC expansion without encapsulated MSCs, however, total nucleated cells density changed mildly, CD34⁺ cells and CFU-Cs showed little effective expansion. It is demonstrated that the encapsulated stromal cells can support the expansion of UCB MNCs effectively under the experimental condition.     

涤垢祛腐液对粉刺性乳痈 30例术后创面愈合的疗效观察

目的 探讨涤垢祛腐液对粉刺性乳痈术后创面促愈的临床疗效及其安全性.方法 选择安徽中医药大学第一附院乳腺外科2017年1月至2018年12月收治的粉刺性乳痈60例,采用随机数字表法分为治疗组、对照组,各30例.两组分别使用涤垢祛腐液和利凡诺进行换药.记录两组术后第7天、第14天、第21天的创面面积、创面愈合率,并记录术后第7天、14天肉芽组织内成纤维细胞和新生血管数、临床疗效及安全性指标.结果 治疗组术后第7天、第14天、第21天的创面愈合率分别是(16.26±1.44)％、(35.95±3.45)％、(66.92±8.91)％,对照组术后第7天、第14天、第21天的创面愈合率分别是(15.05±1.61)％、(32.63±6.80)％、(59.72±16.13)％;创面愈合率受时间影响(P<0.001);治疗组创面愈合率优于对照组(P<0.05);治疗组创面内肉芽组织中的成纤维细胞数量第7天、第14天分别是(40.43±6.02)个、(65.50±6.46)个,对照组分别为(36.83±7.47)个、(60.40±10.37)个;治疗组创面内肉芽组织中的新生血管数第7天、第14天分别是(7.10±1.32)个、(12.30±1.82)个,对照组分别是(6.13±1.48)个、(11.03±2.67)个;治疗组术后第7天、第14天创面内肉芽组织中成纤维细胞数及新生血管数明显多于对照组(P<0.05).结论 涤垢祛腐液能促进粉刺性乳痈术后创面肉芽组织的生长、缩短创面愈合时间,无明显毒副作用,安全性较好.     

不同时期移植人脐血 CD34+细胞对大鼠脊髓损伤修复的对比研究

目的 研究不同时期移植人脐血 CD34⁺细胞修复大鼠脊髓损伤的效果和机制。方法 免疫磁珠法从人新鲜脐血中分离得到 CD34⁺细胞。雌性 Wistar 大鼠 96 只, 以 IMPACTOR MODEL-Ⅱ脊髓损伤打击器建立 T10 脊髓损伤模型, 随机均分为免疫抑制剂应用组、 损伤后急性期移植组和损伤后亚急性期移植组, 对各组后肢功能恢复情况进行 BBB 评分, 损伤中心行双重免疫荧光染色、 2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色和血管明胶墨汁灌注观察。结果 损伤后第 8～56 天, 细胞急性期移植组的 BBB 评分高于其余 2 组(P < 0.05); TTC 染色示组织活力降低区域比例小于其余 2 组(P < 0.01); 明胶墨汁灌注示脊髓损伤中心血管密度大于其余 2 组(P < 0.01); 亚急性期移植组的细胞存活密度大于急性期移植组（个/视野： 7.51±1.00 vs 5.51±0.89, t=6.051, P < 0.01）, 2 组均未观察到移植细胞的神经分化。结论 人脐血 CD34⁺细胞急性期移植可通过提高脊髓损伤中心血管密度促进微循环恢复, 增加组织活力,促进大鼠脊髓损伤后肢体功能恢复。     

Human umbilical cord blood-derived CD34+ cells can be used as a prophylactic agent for experimental heatstroke

We attempted to assess the prophylactic effect of human umbilical cord blood-derived CD34(+) cells in experimental heatstroke. Anesthetized rats, 1 day before heat stress, were divided into 2 major groups and given CD34(-) cells (defined by 1 x 10(6) human cord blood lymphocytes and monocytes that contained <0.2% CD34(+) cells) or CD34(+) cells (defined by 1 x 10(6) human cord blood lymphocytes and monocytes that contained >95% CD34(+) cells). They were exposed to ambient temperature of 43 degrees C for 70 min to induce heatstroke. When the CD34(-) cells-treated or untreated rats underwent heat stress, their survival time values were found to be 20-24 min. Pretreatment with CD34(+) cells significantly increased survival time (123-351 min). As compared with normothermic controls, all CD34(-) cells-treated heatstroke animals displayed hypotension, hepatic and renal failure, hypercoagulable state, activated inflammation, and cerebral ischemia and injury. However, these heatstroke reactions all were significantly suppressed by CD34(+) cells pretreatment. In addition, the levels of interleukin-10 in plasma and glial cell line-derived neurotrophic factors in brain were all significantly increased after CD34(+) cell administration during heatstroke. Our data indicate that human umbilical cord-derived CD34(+) cells can be used as a prophylactic agent for experimental heatstroke.     

重组人粒细胞集落刺激因子注射液动员外周血干细胞10例

目的 :探讨重组人粒细胞集落刺激因子(rhG CSF)注射液动员外周血造血干细胞 (PBSC)的效果。方法 :对 6例恶性血液病病人 ,1d内静脉注射长春新碱 1～ 2mg·m- 2 及环磷酰胺 4～ 7g·m- 2 (分 4次 ,间隔 4h) ,外周血白细胞降至 1×10 9·L- 1以下时 ,加rhG CSF 6～ 8μg·kg- 1,皮下注射 ,qd× 5～ 7d ;对 4例健康供者在采集PBSC前 5d予rhG CSF 6～ 8μg·kg- 1,皮下注射 ,qd× 5d。白细胞升至 10× 10 9·L- 1以上时采集PSBC ,并进行CD+ 34 及粒 巨噬细胞集落形成单位 (CFU GM )检测。结果 :一次收集单个核细胞计数 (3.9±s 1.7)×10 8·kg- 1;CD+ 34 (4 .8± 2 .3)× 10 8·kg- 1;粒 巨噬细胞集落形成单位 (5± 3)× 10 4 ·kg- 1。未出现严重不良反应。结论 :rhG CSF无论对病人自体还是对健康供者均能安全、高效地动员PBSC ,满足移植所需要。