C/EBPδ在结直肠癌中的表达及其对癌细胞增殖的影响

  目的   研究C/EBPδ在结直肠癌中的表达情况及其对结直肠癌细胞增殖能力的影响和相关机制。  方法  选取2017年至2018年于云南省第二人民医院行结肠癌根治术的40例患者的肠癌组织以及对应的癌旁组织和正常肠组织，采用免疫组织化学法检测组织中的C/EBPδ蛋白质表达情况。采用免疫共沉淀方法检测结直肠癌组织中C/EBPδ与Siah2的相互作用。构建C/EBPδ过表达及干扰的病毒载体，分别感染结直肠癌Caco-2细胞，通过CCK8、流式细胞仪检测、平板克隆形成实验观察C/EBPδ过表达和干扰对细胞增殖、凋亡及周期的影响。采用卡方检验对阳性表达率相关因素进行统计学分析。  结果  （1）从正常肠组织到癌旁组织再到结直肠癌组织中C/EBPδ的表达依次升高，差异均有统计学意义（P < 0.05），C/EBPδ蛋白表达量在伴有肝转移的结直肠癌患者中更为显著；（2）C/EBPδ升高的结直肠癌组织中伴有Saih2的升高，但二者没有直接的相互作用；（3）C/EBPδ过表达能显著提高Caco-2细胞的增殖，而C/EBPδ的shRNA干扰使结直肠癌细胞增殖明显减少；（4）与对照组相比，C/EBPδ的shRNA干扰显著抑制了结直肠癌细胞Caco-2细胞的体外迁移和侵袭能力（P < 0.05）。  结论  C/EBPδ在结直肠癌组织中存在异常，过表达的C/EBPδ通过与Saih2 相互作用促进结直肠癌细胞的侵袭和转转，其与结直肠癌的不良预后可能相关。     

C/EBPδ在结直肠癌中的表达及其对癌细胞增殖的影响

目的 研究C/EBPδ在结直肠癌中的表达情况及其对结直肠癌细胞增殖能力的影响和相关机制.方法 选取2017年至2018年于云南省第二人民医院行结肠癌根治术的40例患者的肠癌组织以及对应的癌旁组织和正常肠组织,采用免疫组织化学法检测组织中的C/EBPδ蛋白质表达情况.采用免疫共沉淀方法检测结直肠癌组织中C/EBPδ与Si...     

Fas通过抑制Wnt/β-catenin信号通路激活调控肝癌细胞增殖

目的 探究肿瘤坏死因子受体超族成员6(Fas)调控肝癌细胞株增殖的潜在分子机制。方法 收集正常肝细胞LO2和肝癌细胞株Hep3B、Huh7、PLC/PRF/5、Bel-7402、SMMC-7721、HepG2和SK-hep1,实时荧光定量PCR法检测Fas基因表达,运用癌症基因组图谱(TCGA)数据库分析Fas基因表达与肝癌的关系,设计特异性靶向Fas的siRNA,敲低肝癌细胞中Fas基因的表达,通过噻唑蓝(MTT)实验和克隆形成实验检测细胞增殖能力,用流式细胞术检测细胞凋亡和细胞周期分布,双荧光素酶实验检测β-连环蛋白(β-catenin)介导的T细胞因子(TCF)/淋巴增强子(LEF)转录活性,蛋白质印迹法检测β-catenin蛋白表达水平,实时荧光定量PCR法检测无翅型MMTV整合位点家族成员(Wnt)/β-catenin信号通路下游靶基因八聚体结合转录因子3/4(Oct3/4);G1/S-特异性周期蛋白-D1(CCND1);血管内皮生长因子(VEGF);B细胞特异性莫洛氏鼠白血病病毒插入位点-1(Bmi)的表达。结果 TCGA肝癌样品中Fas基因表达谱结果显示,肝癌组织Fas ...     

结肠癌组织中C/EBPα的表达及其对SW480细胞侵袭的影响

【】目的 研究结肠癌组织中C/EBPα的表达,及其过表达对结肠癌SW480细胞系侵袭性的影响。方法 首先利用免疫组化方法检测48例结肠癌患者的癌组织和正常组织中的C/EBPα表达情况,并统计分析了C/EBPα的表达与结肠癌临床病理参数之间的关系。然后构建pCDGFP-C/EBPα真核表达质粒,过表达于结肠癌SW480细胞系中,通过细胞划痕实验研究其迁移能力的变化,并检测与肿瘤侵袭相关蛋白(KLF5、MMP-2、MMP-9、ECD)的表达量的变化 结果 免疫组化实验结果显示,在正常组织中,C/EBPα的低表达率为6.25%,而在结肠癌组织中,C/EBPα的低表达率为68.75%,两组之间差异具有统计学意义(P＜0.05),且低表达C/EBPα的患者的肿瘤直径越大、TMN分期越晚、淋巴结转移概率越大。细胞划痕实验结果显示,划痕48h后,正常SW480细胞的迁移率为53.16%,而过表达C/EBPα的SW480细胞的迁移率为23.57%,两组之间差异具有统计学意义(P＜0.05),且免疫印记实验也表明,过表达C/EBPα的SW480细胞的KLF5、MMP-2、MMP-9表达明显降低,而ECD表达明显升高。 结论 C/EBPα在结肠癌组织中低表达,且与结肠癌的TMN分期和转移有着密切关系,且过表达C/EBPα能够显著降低结肠癌细胞的侵袭性,对今后结肠癌的早期诊断和基因靶向治疗有着重要意义。     

青藤碱通过调节血红素氧合酶-1表达和自噬抑制脂多糖诱导的RAW264.7巨噬细胞炎症

目的：探讨青藤碱对脂多糖诱导的RAW264.7巨噬细胞炎症的影响和机制。方法：以小鼠RAW264.7巨噬 细胞为研究对象,在有或无血红素氧合酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)抑制剂Znpp处理下,采用青藤碱和/或脂多糖 (lipopolysaccharide,LPS)处理RAW264.7巨噬细胞。应用Real-time PCR检测细胞炎症因子TNF-α和IL-6 mRNA表达, ELISA检测细胞炎症因子TNF-α和IL-6水平,免疫荧光试验分析细胞自噬情况,Western印迹检测细胞HO-1蛋白表达。 结果：与对照组相比,LPS作用后RAW264.7细胞炎症因子TNF-α和IL-6表达和释放增多,自噬相关蛋白LC3绿色荧光 聚集,HO-1表达水平升高(P<0.05);与LPS组相比,加用青藤碱处理能减少TNF-α和IL-6表达和释放,进一步促进LC3 绿色荧光聚集,增加HO-1水平(P<0.05);用HO-1抑制剂Znpp预处理后,青藤碱对LPS诱导TNF-α和IL-6表达和释放的 抑制作用减弱,LC3绿色荧光聚集减少(P<0.05)。结论：青藤碱能减轻LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞炎症,其机制可 能与HO-1介导的自噬激活有关,这为青藤碱应用于炎症反应的防治提供了实验基础和理论依据。     

青藤碱抑制ERK/NF-κB信号通路缓解LPS诱导急性肺损伤

目的 验证青藤碱对急性肺损伤保护作用及作用机制;方法 建立脂多糖诱导的急性肺损伤小鼠模型,给予青藤碱治疗,检测血液及肺泡灌洗液的炎症指标以及ERK/NF-κB信号通路的激活情况,并通过HE和CD68免疫组化检测病理变化。结果 青藤碱提取液可以有效抑制ERK/NF-κB通路,减少炎症因子释放,减轻LPS导致的肺炎症细胞浸润及病理变化。结论 青藤碱可以通过抑制ERK/NF-κB通路缓解LPS诱导的急性肺损伤。     

三氧化二砷通过降低Pin1表达及调节Wnt/β-连环素通路抑制肝癌细胞增殖

目的 探讨三氧化二砷（ATO）在肝癌中对肽基脯氨酰基顺反异构酶NIMA相互作用蛋白1(Pin1表达的抑制作用及其分子机制。方法 使用DepMap数据库和GEPIA数据库中的数据分析Pin1在人肝癌细胞系和肝癌组织中的表达情况。以人肝癌细胞系Huh7和小鼠肝癌细胞系H22为细胞模型,通过ATP法检测ATO对肿瘤细胞活力的影响;通过蛋白质印迹法、免疫荧光染色和qPCR检测ATO对Pin1在蛋白质水平和转录水平表达的作用。用氯喹预处理Huh7细胞抑制溶酶体途径后,通过蛋白质印迹法和免疫荧光染色检测ATO对Pin1表达的调控作用。通过皮下荷瘤小鼠模型和免疫组织化学染色验证ATO在体内对肝癌细胞生长和Pin1表达的影响。采用RNA测序分析ATO可能影响的信号通路,并通过蛋白质印迹法和qPCR验证。结果 在DepMap数据库23种人肝癌细胞系和GEPIA数据库人肝癌组织中,Pin1的表达均呈现较高水平。在体外实验中,ATO处理后Huh7和H22细胞的细胞活力均降低,细胞中Pin1在蛋白质和转录水平的表达均降低,但用氯喹抑制溶酶体途径逆转了ATO对Pin1表达的影响。在皮下荷瘤小鼠模型中,ATO表现...     

盐酸青藤碱-聚乳酸/羟基乙酸共聚物缓释微球制备工艺的研究

目的 制备盐酸青藤碱(SM)-PLGA缓释微球.方法 以PLGA为骨架材料,采用油包油乳化-溶剂挥发法制备盐酸青藤碱-PLGA缓释微球,以粒径、载药量为评价指标经正交试验筛选最优工艺;应用显微镜、扫描电镜、差示扫描量热分析等手段对微球进行表征,用高效液相色谱法测定微球载药量.结果 正交试验最优工艺条件:Span80的质量分数为1％、溶剂挥发时间为6h、PLGA摩尔质量为20 000 g/mol、SM与PLGA质量比为1∶5、转速为700r/min、PLGA质量浓度为80 mg/mL;按最优工艺制备所得微球圆整,平均粒径为7.90 μm,载药量为4.54％.结论 采用油包油乳化-溶剂挥发法制备盐酸青藤碱-聚乳酸/羟基乙酸共聚物微球有较高载药量,具有较大的应用前景.     

三氧化二砷通过降低Pin1表达调节Wnt/β-连环素通路抑制肝癌细胞增殖

目的　探讨三氧化二砷（ATO）在肝癌中对肽基脯氨酰顺/反式异构酶NIMA相互作用蛋白1（Pin1）表达的抑制作用及其分子机制。方法　在DepMap数据库中分析Pin1在23株人类肝癌细胞系中的表达情况,随后以人肝癌细胞系Huh7和小鼠肝癌细胞系H22为细胞模型,通过ATP法检测ATO对肿瘤细胞活力的影响;通过蛋白质印迹法、免疫荧光染色和qPCR检测ATO对Pin1表达在蛋白质水平和转录水平的作用。预先用氯喹预处理Huh7细胞抑制溶酶体途径后,通过蛋白质印迹法和免疫荧光染色检测ATO对Pin1表达的调控。通过皮下荷瘤小鼠模型和免疫组织化学染色验证ATO在体内对肝癌细胞生长和Pin1表达的影响。采用RNA测序富集分析ATO抑制Pin1所可能影响的信号通路,并通过蛋白质印迹法和qPCR验证。结果　在DepMap数据库中,23株人肝癌细胞系中Pin1的表达均呈现较高水平。在体外实验中,ATO处理后Huh7和H22细胞系的细胞活力均降低,细胞中Pin1在蛋白质和转录水平的表达均降低,但用氯喹抑制溶酶体途径逆转了ATO对Pin1表达的影响。在皮下荷瘤小鼠模型中,ATO表现出一定的抗肿瘤效果,免疫组织化学染色显示ATO处理后Pin1表达和肿瘤细胞增殖受到抑制。基因集富集分析结果显示在ATO处理的H22细胞中Wnt/β-连环素通路相关基因富集,在抑制H22细胞中Pin1表达后Wnt/β-连环素通路调控也受到影响。结论　ATO通过溶酶体途径抑制Pin1表达,从而影响Wnt/β-连环素信号通路来抑制肝癌细胞增殖。     

盐酸青藤碱对家兔骨关节炎关节液IL-1β、PGE2生成与关节组织结构的影响

目的 从关节液细胞因子PGE2与IL-1β生成角度探讨盐酸青藤碱治疗骨关节炎的作用机制.方法 取健康家兔以木瓜蛋白酶关节腔注射方法 制备骨关节炎模型.模型成立后分别以盐酸青藤碱关节腔注射,并分别设玻璃酸钠、曲安奈德对照.治疗结束后取关节液检测PGE2、IL-1β含量,关节组织进行病理学检查.结果 盐酸青藤碱使关节液IL-1β、PGE2含量均有较明显降低,玻璃酸钠主要降低PGE2的含量,曲安奈德降低IL-1β的作用更明显.病理学检查显示治疗各组的关节病变程度均较模型组减轻.玻璃酸钠减轻关节软骨损伤作用明显,曲安奈德减轻滑膜炎症突出,盐酸青藤碱在减轻软骨损伤与滑膜炎症方面均有一定作用.结论 盐酸青藤碱可抑制骨关节炎病变中关节液炎性细胞因子PGE2、IL-1β生成,是其减轻软骨损伤与滑膜炎症的作用机制.     

CCAAT/增强子结合蛋白α抑制人肝癌细胞内的肝刺激因子表达

目的 探讨CCAAT/增强子结合蛋白α(CCAAT/enhancer binding proteinα,C/EBPα)对人肝癌细胞内肝刺激因子(hepatic stimulator substance,HSS)表达的影响及其在表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)抑制HSS表达过程中的作用.方法 采用凝胶迁移电泳实验(electrophoretic mobility shift assay,EMSA)研究C/EBPα与HSS启动子的体外相互作用,real-time PCR和Western blotting的方法测定hHSS mRNA和蛋白质表达情况.结果 EMSA实验证实C/EBPα可以与hHSS启动子-343/-330区域内的C/EBPα结合位点结合,对hHSS表达具有负性调节作用,C/EBPα siRNA转染入HepG2细胞后,hHSS mRNA和蛋白质表达均升高.但C/EBPα表达下降并不影响EGF对hHSS表达,而EGF不改变C/EBPα的活性和表达.结论 C/EBPα可通过C/EBP位点抑制hHSS的表达,但不参与EGF对hHSS的转录调节过程.     

盐酸青藤碱介导Hedgehog信号通路治疗小鼠溃疡性结肠炎分子机制的研究

  目的  研究盐酸青藤碱(SH)对小鼠溃疡性结肠炎(UC)的保护作用及可能机制。   方法  将24只小鼠采用随机数字表法分为正常组、模型组、SH低、高剂量组(SH 20 mg/kg、60 mg/kg)4组,每组6只;记录疾病活动指数(DAI)和结肠组织病理学评分,检测Shh mRNA及相关蛋白和细胞因子的表达。   结果  与正常组相比,模型组DAI评分[(3.44±0.27)分vs. 0分, P＜0.001]升高,组织病理学评分升高[(7.67±0.52)分vs. 0分,P＜0.001],Shh mRNA降低(P＜0.05),Shh、Smo、Ptch1、Gli1蛋白表达水平降低(均P＜0.01),TNF-α、IL-1β、IL-6升高(均P＜0.001);与模型组相比, SH低、高剂量组DAI评分[(2.50±0.18)分、(1.89±0.17)分vs. (3.44±0.27)分, P < 0.001]降低, 组织病理学评分降低[(5.17±0.75)分、(3.33±0.52)分vs. (7.67±0.52)分, P < 0.001],Shh、Smo、Ptch1、Gli1蛋白升高(均P＜0.001),TNF-α、IL-1β、IL-6降低(均P＜0.01)。   结论  SH可治疗小鼠UC,其机制可能是SH上调了Hedgehog信号通路活性,从而降低了TNF-α、IL-1β、IL-6含量。      

黄芩苷通过TGF-β1/ERK1/2信号通路抑制鼻咽癌细胞增殖

目的 探讨黄芩苷(baicalin)对鼻咽癌CNE2细胞增殖及TGF-β1/ERK1/2信号通路的作用.方法 采用CCK8法检测不同浓度黄芩苷(2.5、5、10、20、40、80μmol·L-1)、顺铂(4μg·mL-1)在24、36、48 h对CNE2细胞增殖的作用;细胞成像多功能检测系统(CytationTM 5)...     

利拉鲁肽对高脂喂养大鼠胰腺β细胞ATF4/CHOP通路的影响

目的 观察利拉鲁肽对高脂喂养大鼠胰腺GRP78、转录活化因子4(ATF4)、CCAAT区/增强子结合蛋白同源蛋白(CHOP)、TRB3蛋白和mRNA表达情况,探讨利拉鲁肽对高脂喂养大鼠胰腺ATF4/CHOP通路的影响.方法 将雄性Wistar大鼠44只分为对照组、高脂组、干预组1、干预组2,每组11只,对照组给予普通饮食,其余3组给予高脂饮食喂养8周后,干预组1给予利拉鲁肽100 μg·kg-1·d-1皮下注射;干预组2给予利拉鲁肽200 μg·kg-1·d-1皮下注射.药物干预2周后处死,每组取5只大鼠行清醒状态下高胰岛素-正葡萄糖钳夹试验计算葡萄糖输注率(GIR),测定其余大鼠空腹血糖(FBG)、空腹胰岛素(FINS)、血清游离脂肪酸(FFA)、总胆田醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)和高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C),计算胰岛β细胞功能指数(HOMA-β),Western blot和Realtime-PCR技术检测胰腺GRP78、ATF4、CHOP和TRB3蛋白及mRNA的表达.结果 与对照组相比,高脂组FBG、FFA、TC、FINS、TG、LDL-C水平显著升高,HDL-C、GIR和HOMA-β明显下降(P＜0.05或P＜0.01),与高脂组相比,干预组2 HDL-C、GIR和HOMA-β升高(P＜0.05或P＜0.01),其余指标明显下降;与干预组1相比,干预组2的血FGB、FFA、TC下降,GIR和HOMA-β升高(P＜0.05).与对照组相比,高脂组GRP78、ATF4、CHOP和TRB3蛋白及mRNA的表达明显升高;与高脂组相比,干预组1与干预组2随利拉鲁肽浓度升高,GRP78、ATF4、CHOP和TRB3蛋白及mRNA表达逐渐下降.结论 利拉鲁肽可呈浓度依赖性改善高脂喂养大鼠胰岛素抵抗及保护胰岛β细胞,其作用机制可能涉及胰腺内质网ATF4/CHOP通路.     

Sulindac通过抑制Wnt通路诱导SMMC-7721肝癌细胞凋亡

目的初步研究Wnt通路及蛋白激酶B（PKB）在非甾体类抗炎药sulindac诱导人肝癌SMMC-7721细胞凋亡过程的作用。方法利用流式细胞仪检测肝癌细胞7721的凋亡,利用Western blot检测caspase-9、PARP（poly ADP-ribose polymerase）等凋亡相关分子的剪切,β连环蛋白（β-catenin）及糖原合酶激酶3β（GSK3β）与蛋白激酶B（PKB）磷酸化水平的变化,利用RT-PCR检测β-catenin及c-myc的mRNA水平。结果sulindac能够诱导SMMC-7721细胞凋亡,显著降低β-catenin的蛋白水平,抑制GSK3β9位丝氨酸的磷酸化,同时促使caspase-9、PARP等凋亡相关分子发生剪切;β-catenin的mRNA水平未见变化;PKB的磷酸化水平未见降低,反而略有增高。结论sulindac能够通过抑制Wnt通路,促进β-catenin的蛋白降解,降低其蛋白水平,诱导SMMC-7721细胞凋亡,且该作用不依赖PKB活性的抑制。     

大鼠IL-6基因启动子荧光素酶报告质粒的构建及其与C/EBP β结合位点的鉴定

目的:构建大鼠IL-6基因启动子(全长和截短)荧光素酶报告质粒并予鉴定,观察人胚肾细胞(HEK293)中过表达CCAAT/增强子结合蛋白 β(CCAAT/enhancer binding protein β,C/EBP β)对该质粒基因启动子活性的影响?同时,筛选C/EBP β与IL-6基因启动子区的结合位点?方法:采用PCR技术,扩增出大鼠IL-6基因启动子全长序列(-1 791~ +30 nt),将IL-6基因启动子插入荧光素酶报告基因载体pGL3-basic中?将IL-6基因启动子全长荧光素酶报告质粒(pGL3-IL-6-1)和大鼠野生型C/EBP β表达质粒(pIRES2-EGFP-C/EBP β)共转染HEK293细胞,检测其荧光素酶活性,确定C/EBP β对IL-6基因的启动作用?另用生物信息学软件预测IL-6基因启动子上C/EBP β潜在的结合位点,并构建IL-6基因启动子截短的荧光素酶报告质粒(即pGL3-IL-6-2~5)?将上述IL-6基因启动子全长和各截短的荧光素酶报告质粒和C/EBP β过表达质粒共转染HEK293细胞,再行荧光素酶活性测定,筛选出C/EBP β的结合位点?结果:菌液PCR及核酸测序证实,上述荧光素酶报告质粒均构建成功?将pGL3-IL-6-1和pIRES2-EGFP-C/EBP β共转染HEK293细胞发现,IL-6基因启动子活性显著增加?另将pGL3-IL-6-1?pGL3-IL-6-2~5和pIRES2-EGFP-C/EBP β共转染HEK293细胞后发现,pGL3-IL-6-5的启动活性显著低于其他组?提示C/EBP β可能结合在IL-6基因启动子的-618 bp~ -126 bp区域?结论:成功构建了大鼠IL-6基因启动子全长及截短荧光素酶报告质粒,并初步筛查出了C/EBP β在IL-6基因启动子上的结合部位?     

青藤碱对大鼠肥大细胞RBL－2H3活化的影响及机制

目的：探讨青藤碱对大鼠肥大细胞RBL－2H3活化的影响及其作用机制。方法将培养的大鼠RBL－2H3细胞随机分为对照Ⅰ组和青藤碱组。青藤碱组用青藤碱溶液处理,对照Ⅰ组则用PBS处理。利用生化法检测两组细胞培养上清中β－氨基己糖苷酶释放率,并用荧光定量PCR和Western blot方法检测细胞中信号调节蛋白α（SIRPα）mRNA和蛋白的表达水平。构建SIRPα过表达重组质粒或SIRPαsiRNA,将RBL－2H3细胞分为对照Ⅱ组、空载质粒组、过表达组、对照Ⅲ组、空白组、沉默组,对照Ⅱ组和对照Ⅲ组不进行转染,空载质粒组转染空白质粒,过表达组转染SIRPα过表达质粒,空白组转染非特异性siRNA,沉默组转染SIRPαsiRNA,转染结束后向对照Ⅲ组、空白组、沉默组添加青藤碱处理,并检测SIRPα的表达及炎症因子白细胞介素（ IL）－4、IL－6和肿瘤坏死因子－α（ TNF－α）的含量。结果与对照Ⅰ组比较,青藤碱组细胞中β－氨基己糖苷酶释放率显著降低（P＝0．000）,SIRPαmRNA及蛋白表达量均显著升高（P＝0．000）。与对照Ⅱ组和空载质粒组比较,过表达组细胞中SIRPαmRNA表达量显著升高（P＝0．000）,IL－4、IL－6和TNF－α含量均明显降低（P＝0．000）。与对照Ⅲ组和空白组比较,沉默组细胞SIRPαmRNA表达量显著降低（P＝0．000）,IL－4、IL－6和TNF－α含量均显著升高（ P＝0．000）。结论青藤碱处理能够显著抑制大鼠RBL－2H3细胞活化并上调细胞中SIRPα基因的表达,而SIRPα基因介导了青藤碱的这种抑制作用。