胰岛素、胰高血糖素对体外培养脂肪细胞胰高血糖素受体mRNA丰度的影响

为阐明胰岛素、胰高血糖素在奶牛脂肪代谢中的调控作用,应用RT-PCR法观察了胰岛素、胰高血糖素对体外培养脂肪细胞胰高血糖素受体(GLNR)mRNA丰度的影响。结果发现,随着培养液中胰岛素质量浓度的升高,GLNR mRNA表达逐渐增加(P<0.05);而随着培养液中胰高血糖素浓度的升高,GLNR mRNA表达逐渐降低(P<0.01)。本研究结果表明,胰岛素、胰高血糖素直接调控奶牛脂肪细胞胰高血糖素受体mRNA的表达。     

胰岛素、胰高血糖素对体外培养脂肪细胞FAS mRNA表达的影响

为阐明胰岛素、胰高血糖素与脂肪酸合成酶（FAS）的关系,在体外培养良好的脂肪细胞中添加不同浓度的胰岛素（INS）、胰高血糖素（GLU）,每个激素设置6个浓度梯度,培养12h后,通过荧光定量PCR技术,观测胰岛素、胰高血糖素对FAS mRNA丰度的影响。结果显示,胰岛素促进了FAS mRNA的表达,而胰高血糖素抑制了FAS mRNA的表达。结果表明,胰岛素和胰高血糖素能直接调控肝细胞中FAS mRNA的表达。     

代谢产物对体外培养新生犊牛肝细胞胰高血糖素受体mRNA丰度的影响

为阐明代谢产物非酯化脂肪酸（NEFA）、β-羟丁酸（BHBA）和葡萄糖（GLU）在乳牛肝糖代谢、脂代谢中的调控作用，应用实时荧光定量PCR法观察了NEFA、BHBA和GLU对体外培养新生犊牛肝细胞胰高血糖素受体（GLNR）mRNA丰度的影响。结果，随着培养液中NEFA、BHBA和GLU浓度的升高，GLNRmRNA的表达量逐渐增加（P〈0．01）。表明，代谢产物NEFA、BHBA和GLU直接调控乳牛肝胰高血糖素受体mRNA的表达。     

胰岛素、胰高血糖素对体外单层培养的肝细胞胰岛素样生长因子-Ⅰ mRNA丰度的影响

以持家基因β肌动蛋白(β-actin)作为内参照,通过竞争PCR法检测不同浓度的胰岛素和胰高血糖素对犊牛肝细胞中胰岛素样生长因子-Ⅰ mRNA丰度的影响.结果表明,胰岛素和胰高血糖素都能直接调控胰岛素样生长因子-Ⅰ mRNA的表达,胰岛素促进胰岛素样生长因子-Ⅰ mRNA的表达,而胰高血糖素抑制胰岛素样生长因子-ⅠmRNA的表达,存在量变关系.     

胰岛素、胰高血糖素对体外单层培养的肝细胞胰岛素样生长因子-ImRNA丰度的影响

以持家基因β肌动蛋白（pactin）作为内参照，通过竞争PCR法检测不同浓度的胰岛素和胰高血糖素对犊牛肝细胞中胰岛素样生长因子-ImRNA丰度的影响。结果表明，胰岛素和胰高血糖素都能直接调控胰岛素样生长因子-ImRNA的表达，胰岛素促进胰岛素样生长因子-ImRNA的表达，而胰高血糖素抑制胰岛素样生长因子-ImRNA的表达，存在量变关系。     

瘦素对体外培养肝细胞胰高血糖素受体mRNA丰度的影响

为阐明瘦素（Leptin）在奶牛肝糖代谢、脂代谢中的调控作用,应用RT-PCR法观察了瘦素对体外培养肝细胞胰高血糖素受体（GLNR）mRNA丰度的影响。结果发现,随着培养液中瘦素浓度的升高,GLNR mRNA的表达呈现先升高后降低的趋势（p〈0.01）;研究结果表明瘦素直接调控奶牛肝胰高血糖受体mRNA的表达。     

神经内分泌因子对体外培养新生犊牛肝细胞胰高血糖素受体mRNA丰度的影响

为阐明神经内分泌因子胰岛素(In)、胰高血糖素(GLN)、瘦素(LEP)在奶牛肝糖代谢、脂代谢中的调控作用，应用实时荧光定量PCR ( real time fluorescent quantitative PCR)法观察了神经内分泌因子对体外培养新生犊牛肝细胞胰高血糖素受体（glucagon receptor，GLNR）mRNA丰度的影响。结果显示：随着培养液中In的升高，GLNR mRNA表达逐渐增加（P<0.01）；随着培养液中GLN浓度的升高，GLNR mRNA表达逐渐降低（P<0.01）；而随着培养液中LEP浓度的升高，GLNR mRNA的表达呈现先升高后降低的趋势（P<0.01）。表明：神经内分泌因子In、GLN、LEP直接调控奶牛肝脏GLNR mRNA的表达。     

胰岛素、胰高血糖素对体外培养犊牛肝细胞脂合成作用的影响

为确定胰岛素(insulin,INS)和胰高血糖素(glucagon,GLN)对奶牛肝细胞脂合成作用的影响,本试验体外培养犊牛原代肝细胞,分别用不同浓度的INS和GLN处理肝细胞:对照组(0nmol/L)、浓度梯度组(1,10,100,1 000nmol/L)。培养1h后分别用免疫印迹(Western blot,WB)方法、荧光定量PCR(qRT-PCR)方法以及细胞免疫荧光(immunofluorescence,IF)方法检测INS和GLN处理体外培养肝细胞对关键转录因子固醇调节元件结合蛋白-1c(SREBP-1c)mRNA表达水平,SREBP-1c核质分布以及下游靶基因脂代谢关键酶乙酰辅酶A羧化酶(ACC)和脂肪酸合成酶(FAS)mRNA表达水平的影响。结果显示:INS处理使SREBP-1c的表达水平和转录活性显著升高,入核量显著增加,其下游的脂合成关键酶ACC和FAS的基因表达水平也显著升高。而与之相反,GLN处理使SREBP-1c的表达水平和转录活性显著降低,入核量显著减少,其下游的脂合成关键酶ACC和FAS的基因表达水平也显著降低。以上结果说明,INS可通过增强SREBP-1c的活性从而促进肝细胞脂合成,增加肝脂沉积;而GLN则通过抑制SREBP-1c的活性从而降低肝细胞脂合成。     

胰岛素、胰高血糖素对体外培养的牛脂肪细胞HSL mRNA和ADPN mRNA丰度的影响

试验在单层培养的新生犊牛脂肪细胞中,分别添加胰岛素（INS）与胰高血糖素（GN）,每个激素设置6个梯度3个重复,通过荧光定量PCR技术,观测2种激素对ADPN mRNA与HSL mRNA丰度的影响。结果表明,胰岛素抑制了脂肪细胞ADPN mRNA与HSL mRNA的表达,胰高血糖素促进了ADPN mRNA与HSL mRNA的表达,且ADPNmRNA与HSL mRNA存在相关性。     

胰岛素、胰高血糖素对体外培养犊牛肝细胞CPT-Ⅰ和CPT-ⅡmRNA表达的影响

体外原代培养犊牛肝细胞,添加不同浓度的胰岛素（insulin,INS）（0、1、10、100、1 000nmol/L）和胰高血糖素（glucagon,GLN）（0、1、10、100、1 000nmol/L）,每个处理做3个重复,分别培养1h后,提取总RNA。实时荧光定量PCR（qRT-PCR）的方法,检测肉碱棕榈酰转移酶Ⅰ（carnitine palmitoyl transferase,CPT-Ⅰ）和肉碱棕榈酸转移酶Ⅱ（carnitine palmitoyl transferase,CPT-Ⅱ）mRNA表达的变化。结果显示,随着培养液中INS含量的升高,肝细胞中CPT-ⅠmRNA和CPT-ⅡmRNA的表达量逐渐降低,呈现一定的剂量依赖性。随着培养液中GLN含量的升高,肝细胞中CPT-ⅠmRNA和CPT-ⅡmRNA的表达量均升高,呈现一定的剂量依赖性,且当GLN的添加浓度高于100nmol/L时,CPT-ⅠmRNA和CPT-ⅡmRNA的表达量显著升高（P〈0.01）。结果表明,INS可在一定程度上抑制脂氧化关键酶的表达,GLN可显著促进脂氧化关键酶的表达。     

瘦蛋白(Leptin)对体外培养新生牛脂肪细胞Leptin、HSL基因表达的影响

取单层生长良好的脂肪细胞,采用单因素重复试验,分别添加0、2.5、5、10、50、100μg/L的外源牛重组瘦蛋白(Leptin),培养12h后提取总RNA,每个处理3个重复(孔),应用半定量PCR方法检测外源Leptin对脂肪细胞Leptin mRNA和HSL mRNA水平的影响.结果表明,Leptin对脂肪细胞内Leptin mRNA表达具有抑制作用,但一定浓度的Leptin能提高脂肪细胞内HSL mRNA水平,其中以5μg/L Leptin的作用最为明显;当Leptin的质量浓度超过5μg/L,HSL mRNA表达水平呈下降趋势.     

重组抵抗素对犊牛肝细胞PC mRNA丰度及其活性的影响

取单层培养72 h生长良好的犊牛肝细胞,采用单因素重复试验,分别添加0、25、50、100、200、400 ng/L的牛重组抵抗素(resistin),每个处理3个重复(每重复2孔).继续培养12 h后分别提取RNA并制备细胞上清液.应用荧光定量PCR方法检测牛重组Resistin对肝细胞糖异生关键酶丙酮酸羧化酶(Pyruvate carboxylase,PC)基因表达的影响,同时用比色法检测其对肝细胞PC酶活性的影响.结果表明,一定浓度的resistin显著下调了肝细胞PCmRNA表达,且降低了PC酶活性.     

地塞米松、油酸、乳酸对体外培养脂肪细胞HSL mRNA表达的影响

取体外培养生长良好脂肪细胞,培养介质中分别添加0、10、20、40、80、160mg/L地塞米松,0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mmol/L油酸,0、10、20、30、40、50mg/L乳酸,培养24h后提取总RNA,每个处理3个重复,分别采用荧光定量PCR法检测地塞米松、油酸、乳酸对脂肪细胞HSL mRNA丰度的影响。结果表明油酸、乳酸抑制脂肪细胞内HSL mRNA表达,抑制作用随浓度增加而增强;地塞米松促进脂肪细胞内HSL mRNA表达,是剂量依赖性。     

牛DGAT2基因第6内含子MspI-RFLPs和TaqI-RFLPs及其与牛经济性状相关性研究

利用PCR-RFLPs方法分析牛DGAT2基因第5、6和7内含子内部的MspI和TaqI等11种酶切多态性,并在第6内含子检测到MspI-RFLPs和TaqI-RFLPs 2个多态位点。分析表明,该MspI-RFLPs普遍存在于鲁西牛、晋南牛、秦川牛、利木赞×鲁西牛、西门塔尔×延边牛、夏洛来×延边牛、安格斯×延边牛和三河牛、中国荷斯坦牛等9个试验群体中,TaqI-RFLPs只在鲁西牛、晋南牛和秦川牛3个地方品种和利木赞与鲁西牛的杂交群体中检测到,而且等位基因B(T碱基)在除鲁西牛外的群体中分布频率很低。统计分析表明,MspI-RFLPs与肉牛的体脂没有相关,但显著影响屠宰率,AA型个体的屠宰率显著高于AB和BB型(P<0.05)。DGAT2基因第6内含子MspI酶切多态性与三河牛群体平均乳脂率和平均干物质含量有极显著或显著的相关性(P<0.01和P<0.05),AA型个体的平均乳脂率和平均干物质含量均高于BB型个体的均值,但在荷斯坦牛群体中却没有得到相同的结果。研究分析了鲁西牛中TaqI-RFLPs的AA型与AB型个体之间屠宰性能的差异,结果表明这2种基因型与鲁西牛的屠宰性能没有显著的相关(P>0.05),有待在更大的鲁西牛群体中检验TaqI-RFLPs是否影响屠宰性状。     

丙酸钠和丙酮酸钠对体外培养牛肝细胞内丙酮酸羟化酶基因mRNA水平的影响

在成功构建牛肝细胞培养模型和PC基因DNA竞争模板的基础上，采用竞争RT—PCR方法检测了丙酸钠和丙酮酸钠对体外培养新生牛单层肝细胞PC基因mRNA丰度的影响。结果，随着丙酸钠浓度的升高，PC基因mRNA水平呈上升趋势，PC基因mRNA对丙酸钠的耐受范围较广；随着丙酮酸钠浓度的升高PC基因mRNA水平呈先上升后下降的趋势。结果表明，肝细胞内PC基因mRNA的表达水平受丙酮酸钠浓度的调控，在一定范围内丙酮酸钠对PC基因mRNA的转录具有促进作用，而浓度过高时则起抑制作用。     

神经肽Y对犊牛肝细胞PEPCKmRNA丰度及其活性的影响

取单层培养36 h生长良好的犊牛肝细胞.采用单因素重复试验,分别添加0、50、100、200、500、1 000 ng/L的羊体外合成神经肤Y(Neuropeptide Y,NPY),每个处理3个重复(每个重复2孔),再培养12 h后分别提取RNA和制备细胞上清液.应用荧光定量PCR方法检测外源NPY对肝细胞糖异生关键酶磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(Phosphoenolpyruvate carboxykinase,PEPCK)基因表达的影响,同时用比色法检测其对肝细胞PEPCK活性的影响.结果表明,一定浓度的NPY显著促进肝细胞PEPCK mRNA表达,增强了PEPCK活性.     

摩拉水牛二酰甘油酰基转移酶2基因的多态性检测

本研究旨在检测水牛二酰甘油酰基转移酶2（diacylglycerolacylt-ransferase,DGAT2）基因的单核苷酸多态性（SNP）,探究摩拉水牛多态性位点的群体遗传特征。以广西水牛研究所的57头摩拉水牛为材料,PCR扩增DGAT2基因的部分序列（外显子2及内含子2、3）,通过常规测序法检测其SNP,并运用遗传多样性分析软件（POPGENE）和SPSS软件对群体的多态性位点进行基因频率、基因型频率、多态信息含量（PIC）、有效等位基因数（Ne）及遗传杂合度（He）的检测。结果表明,在摩拉水牛DGAT2基因外显子2和内含子2、3上共发现了9个SNPs位点（IVS2.54 G > A、IVS2.158 A > G、EVS2.191 A > G、EVS2.228 A > G、IVS3.311 C > T、IVS3.444 A > G、IVS3.451 A > C、IVS3.466 C > T、IVS3.521 C > T）,其中EVS2.191 A > G位点的突变导致氨基酸由异亮氨酸突变为缬氨酸,突变位点间存在一定程度的连锁遗传但接近连锁平衡状态。从基因频率上看,IVS2.158 A > G、EVS2.191 A > G、IVS3.311 C > T、IVS3.451 A > C、IVS3.466 C > T和IVS3.521 C > T 6个SNPs位点的两个等位基因频率有较大差异,提示等位基因频率较大的基因个体可能更适合生存。9个SNPs位点在摩拉水牛品种上多处于高度多态,杂合度在0.1744~0.4975之间,说明摩拉水牛群体中DGAT2基因遗传多态性丰富,具有较大的育种价值和性状改良潜力。