基因工程重组表达血管内皮生长因子的纯化与初步应用

目的 血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor, VEGF)可有效促进血管新生和增加血管通透性,是参与多种生理和病理过程的重要因子。通过基因工程重组表达VEGF_165a并进行蛋白纯化,同时建立免疫学活性检测方法,可用于检测开发的生物类似药雷珠单抗的药物活性。方法 通过对基因工程构建的rhVEGF_165a工程菌进行均质破菌,得到不可溶的包涵体,并进行包涵体的增溶与变性。通过镍柱亲和层析方法,从尿素溶解的包涵体中有效地复性和纯化rhVEGF_165a。以纯化的rhVEGF_165a建立ELISA分析方法,用于所开发的生物类似药雷珠单抗活性检测。结果 纯化后的rhVEGF_165a为天然的二聚体形式,分子量约为40kDa;成功获得纯度达到95%以上的rhVEGF_165a蛋白;间接ELISA结果表明,所研发的生物类似药雷珠单抗与原研雷珠单抗具有相同的药物活性。结论 本研究所获得的纯化rhVEGF_165a...     

人源血管内皮生长因子突变体Ⅱ的克隆表达、分离纯化及初步鉴定

构建人源血管内皮生长因子突变体hVEGF121Ⅱ的重组原核表达质粒,获得hVEGF121Ⅱ蛋白用于制备抗血管生成作用更强的抗肿瘤疫苗。利用PCR技术,在已构建的hVEGF121Ⅰ突变体的基因末端引入热休克蛋白mHSP70的407-426两段串联重复序列的编码基因,PCR产物经Hind III和Nco I双酶切后连接到经同样限制性内切酶切过的原核表达载体pET-28a(+)上,转入大肠杆菌菌株BL21(DE3)中,乳糖诱导表达,超声破碎菌体,包涵体经洗涤、溶解、稀释复性、离子交换层析得到目的蛋白hVEGF121Ⅱ,Western-blot鉴定。结果成功构建了hVEGF121Ⅱ蛋白的表达质粒pET-28a(+)-hVEGF121Ⅱ,重组菌株经乳糖诱导后,目的蛋白表达量占全菌蛋白的62%,分离纯化后纯度达到95%,hVEGF121Ⅱ蛋白的单体和二聚体都可以和VEGF抗体结合。重组hVEGF121Ⅱ蛋白的表达成功为进一步对其进行免疫学研究奠定了基础。     

人血管内皮细胞生长因子基因克隆、表达与纯化

目的研究人血管内皮细胞生长因子121(hVEGF121)基因在pET-24a(+)中的表达,获得高效表达、具有生物学活性的rhVEGF121。方法提取人原髓白血病细胞(HL60)总RNA,RT-PCR扩增hVEGF121基因,经DNA序列分析后,克隆于高效原核表达载体pET-24a(+),并转化到大肠杆菌B121(DE3)中,经IPTG诱导表达,超滤复性,DEAESephamseFastFlow阴离子交换和SephacryS-100分子筛色谱纯化后,以HUVEC测定其生物学活性。结果SDS-PAGE结果显示,目的蛋白质以包涵体形式存在,表达量达菌体总蛋白质的20%,纯化后rhVEGF121纯度达95%以上,生物学活性检测证实,具有刺激HUVEC增殖的功能。结论在原核系统中实现了hVEGF121的高效表达。     

肺癌血管内皮生长因子表达的研究

为探讨血管内皮生长因子(VDGF)与肺癌血管形成、转移和增殖活性等因素的关系，采用SP免疫组织化学方法观察VEGF在94例肺癌组织的表达．结果表明．VEGF在肺癌组织表达的阳性率为70.2%，明显高于癌旁正常组织(P＜0．01)，VEGF表达阳性组其激血管计数值和只PCNA标记指数均高于阴性组(P&;lt;0.05)。腺癌VEGF的表达与转移、分期和分级等因素均无关(P＞0.05)；在鳞癌有淋巴结转移组VEGF的阳性率高于无转移组，Ⅲ～Ⅳ期癌高于Ⅰ～Ⅱ期癌(P＜0.05)，上述结果提示，VEGF表达与肺癌的发生有关，并能促进肺癌组织中的血管形成．使癌细胞的增殖活性升高；VEGF表达与肺鳞癌淋巴结转移和进展有关．可能是预后不良的标志。     

重组血管内皮生长因子的研究进展

血管内皮生长因子（Ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ,ＶＥＧＦ）是１９８９年Ｆｅｒｒａｒａ等在牛垂体滤泡星状细胞体外培养液中首先纯化出来的。到目前为止已经发现了六个ＶＥＧＦ异构体,包括ＶＥＧＦ１２１,ＶＥＧＦ１４５,ＶＥＧＦ１６５,ＶＥＧＦ１８３,ＶＥＧＦ１８９,ＶＥＧＦ２０６。已经发现高亲和力的ＶＥＧＦ受体有两类,分别为Ｆｌｔ－１（Ｆｍｓ－ｌｉｋｅ ｔｙｒｏｓｉ     

新疆地区垂体瘤患者血管内皮生长因子表达研究

目的 探讨新疆地区垂体瘤患者血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)的表达及其意义.方法 选择我院所收治的52例垂体瘤患者,其中未复发者29例,复发者23例,应用免疫组化法对其脑垂体瘤中VEGF表达进行检测.结果 52例中,有42例出现VEGF表达阳性,复发组垂体瘤中VEGF表达较未复发组明显增高,两组间差异有统计学意义(P<0.05).结论 VEGF在垂体瘤血管形成中发挥重要作用,可能促进垂体瘤的复发.     

血管内皮生长因子

血管内皮生长因子是一类能够特异地作用于血管内皮细胞,通过特异性受体发挥生物学作用的血管生长调控因子。促进内皮细胞增生;增加细胞质钙离子浓度;增加血管渗透性,改变细胞外基质,促进血管生成,其中一些因子还在淋巴管生成中起作用。本文对血管内皮生长因子的特征、生物学作用等进行了综述。     

重组人肝细胞生长因子α高效表达工程菌筛选及发酵工艺研究

将人肝细胞生长因子α重组质粒转化至不同E.coli菌株，在相同培养条件下比较其表达量，筛选高表达工程菌株；在15L的发酵罐内，采用分批补料培养的方法，研究表达菌株的发酵培养条件，检测改变发酵培养基成分、种子液接种量、诱导时间等参数对菌液密度以及蛋白表达的影响，同时检测质粒传代的稳定性。实验结果表明筛选出的高表达工程菌在优化的发酵培养条件下，菌体收获量可达52g/L，目的蛋白表达量约占菌体可溶性总蛋白的25％，且质粒和蛋白表达均具有良好的稳定性。高效表达工程菌和优化发酵工艺可以较好地提高菌体收率，为规模化生产奠定了基础。     

重组人肝细胞生长因子-β链的高效表达及包涵体纯化研究

目的　构建重组人肝细胞生长因子 - β链 (rh HGF- β)的表达体系。筛选高效表达工程菌株 ,分离纯化 rh HGF- β。方法　用工程菌诱导培养技术筛选 rh HGF- β的高效表达菌株。从诱导起始时间、诱导时间、温度、p H值、培养基组分等方面优化 rh HGF-β的表达体系。进一步对 rh HGF-β进行粗纯化 ,采用超声波破菌 ,溶菌酶破菌 ,高速离心反复洗涤获得包涵体。采用凝胶过滤层析纯化 rh HGF-β。结果　经十二烷基硫酸钠 -多丙烯酰胺冻胶电泳 (SDS- PAGE)及扫描分析目的蛋白的表达量达 3 0 % ,经纯化后可获得纯度在 90 %以上的 rh HGF-β。结论　建立了高效稳定的 rh HGF- β表达体系 ,获得实验室水平 rh HGF- β的分离纯化工艺方案     

血管内皮生长因子与子宫内膜异位症

随着子宫内膜异位症（endometriosis,EMs）病因及发病机制研究的深入,备受大多数学者支持的内膜种植学说已无法合理解释绝大多数妇女经期存在经血逆流却只有少数发病这一现象。近年来,大量研究表明子宫内膜异位症的发生与种植部位新生血管的形成密切相关,认为经血逆流可能只是子宫内膜异位症发生的一个前提条件,而血供的建立和维持才是其发生的基本。而血管内皮生长因子作为目前所知作用最强的促血管生长因子,其与子宫内膜异位症的关系也因此成为人们研究的热点。     

L-天门冬酰胺酶II的表达与纯化

依据发表的大肠杆菌天门冬酰胺酶II基因序列,合成引物,利用PCR技术获得天门冬酰胺酶II的结构基因,插入高效表达载体pBV220,并转化大肠杆菌菌株DH5α,获得高效表达天门冬酰胺酶II的基因工程菌株。通过对包涵体的提取与纯化,结合离子交换层析获得天门冬酰胺酶II的蛋白质纯品。检测结果表明得到的天门冬酰胺酶II具有较高的比活性,与商品化的同类产品比活相近。     

人粒细胞集落刺激因子基因重组及在E.coli中的表达和鉴定

将RT－PCR扩增的人粒细胞集落刺激因子（hG－CSF）结构基因与表达载体pJGW1重组，转化含有pGP1－2质粒的E.coliDH5α，进行温度诱导表达。经SDS－PAGE分析，rhG－CSF表达量占菌体总蛋白量的30％以上。将其复性，经CM－52FF离子交换层析纯化，纯化后的rhG－CSF（纯度＞98％）经SDS－PAGE测定分子量约为19kD；经胰酶裂解、反相HPLC分析肽谱具有8条特异肽段；等电聚焦测定PI值约为5．8；免疫印迹实验证实其与标准hG－CSF具有相同的抗原反应特异性；NH2-末端氨基酸分析与文献报道一致，采用小鼠白血病细胞株NFS－60测定活性为I×108IU／mg。     

从EDTA处理的重组E.coil中分离纯化重组人SOD包涵体

以金属离子螯合剂乙胺四乙酸(EDTA)代替超声法使重组大肠杆菌菌体释放,并提取重组人超氧化物歧化酶包涵体,纯度为65%.采用透析法复性包涵体,经凝胶色谱纯化后,目的蛋白纯度约为90%,酶比活力为5400 u/(mg蛋白).     

重组牛碱性成纤维细胞生长因子纯化工艺的研究

对大肠杆菌表达的重组牛碱性成纤维细胞生长因子 (bFGF)进行了纯化工艺的研究。 3批纯化后的终产品经SDS PAGE检测 ,其纯度为 99.3% ,经HPLC(高效液相 )检测 ,其纯度为 10 0 % ,分子质量为 17.8ku ,其平均比活性为 2 .8× 10 6AU/mg ,其表达量为 97.5mg/ml.。     

重组人粒-巨噬细胞集落刺激因子的分离与纯化

探讨重组人粒－巨噬细胞集落刺激因子的分离、纯化工艺。方法;经破菌溶解包含体、复性等粗提纯后,以三步色谱法精制纯化,对终产品进行纯度、生物活性、热原及急性毒性检测。结果：终产品为单一条带、单一峰,生物活性为１．５９ ×１０~７～１．８６×１０~７ＩＵ／ｍｇ,热原测定及急性毒性试验符合要求。结论：此工艺纯化的产品纯度高、生物活性好,有一定的应用价值。     

重组羧肽酶原B在大肠杆菌中的可溶性表达及活性羧肽酶B的纯化

实现羧肽酶原B表达质粒在大肠杆菌中的可溶性表达,并对表达产物进行激活和纯化,得到活性CPB.采用摇瓶发酵,对诱导温度,诱导时间,诱导剂IPTG的浓度进行优化,促成其可溶性表达;优化酶解激活条件,提高粗酶液比活.粗酶液用DEAE-FF离子交换柱和Octyl-FF疏水柱两步纯化.结果：实现可溶性表达的最佳条件为15℃下,0.1 mmol/LIPTG诱导20 h.此条件下得到的粗酶液经激活后两步纯化,得到比活为128.2 u/mg protein的较纯的活性CPB,活性回收率达39%.     

重组人胸腺素α1融合蛋白在大肠杆菌中表达条件的优化

为提高人胸腺素α1（Tα1）融合蛋白在大肠杆菌中的表达量，研究了本实验室构建的pET39-Tα1重组质粒在E.coli BL21（DE3）宿主菌中的表达条件。经SDS-PAGE和凝胶成像系统GDS-8000分析结果表明，重组菌以LB为培养基，卡那霉素浓度为50mg／L，开始诱导时的菌体密度为（OD600=0．5，所加IPTG的浓度为0．5mmol／L，27．5℃摇床200r／min振荡诱导培养10h时，可在周至空间中获得高效表达的可溶的Tα1融合蛋白，占周质蛋白总量的64．7％，为下一步纯化工作提供了方便。     

鼻咽癌组织中血管内皮因子VEGF和肿瘤抑制基因P16的表达及意义

目的:观察鼻咽癌组织中血管内皮因子VEGF和肿瘤抑制基因P16的表达,探讨其与鼻咽癌的预后关系。方法:采用S-P法,检测血管内皮生长因子VEGF和肿瘤抑制基因P16在40例鼻咽癌组织中的表达.分析它们与鼻咽癌患者的复发、转移、生存期之间的相关性。结果:鼻咽癌组织VEGF和肿瘤抑制基因P16的阳性表达率分别为55%和48%,VEGF阳性表达和P16阳性表达与鼻咽癌患者发生转移和较短的生存期有相关性。结论:鼻咽癌组织中VEGF和P16的表达可作为预测鼻咽癌患者的预后因素。